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方法文章

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

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DOI：

10.3791/65639

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2023年6月30日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Colorado Denver | Anschutz Medical Campus, 2Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。

摘要

光可调水凝胶可在光照下发生空间和时间上的转变。将此类生物材料整合到细胞培养平台中，并动态触发其变化（例如增加微环境刚度），可使研究人员模拟纤维化疾病进展过程中细胞外基质（ECM）发生的变化。本文介绍了一种在明胶支撑浴中进行两次连续聚合反应的光可调水凝胶生物材料的3D生物打印方法。通过调节支撑浴的pH值以促进迈克尔加成反应，对自由形式悬浮水凝胶可逆嵌入（FRESH）生物打印技术进行了改进。首先，将含有聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）的生物墨水与可细胞降解的交联剂以非化学计量比反应，形成柔软的水凝胶。随后，将这些柔软水凝胶暴露于光引发剂和光照下，诱导未反应基团的均聚反应，从而使水凝胶硬化。本方案涵盖了水凝胶合成、3D生物打印、光致硬化以及终点表征，用于评估成纤维细胞在3D结构中的活化状态。本文所述方法使研究人员能够3D生物打印经历pH催化聚合反应的多种材料，并可用于构建组织稳态、疾病及修复的多种模型。

引言

3D 生物打印是一项变革性技术，使研究人员能够在三维空间内精确地沉积细胞和生物材料，重建生物组织复杂的层级结构。在过去十年中，3D 生物打印技术的进步已成功构建出跳动的人类心肌组织1、功能性肾组织模型2、肺部气体交换模型3以及用于癌症研究的肿瘤模型4。嵌入式 3D 生物打印技术（如悬浮水凝胶自由成型可逆嵌入，FRESH 生物打印）的发明，使得在三维空间中复制复杂的软组织结构（例如肺部血管5甚至人类心脏6）成为可能。FRESH 3D 生物打印通过将软质、低粘度的生物墨水挤出至剪切稀化支撑浴中，实现逐层打印。该支撑浴由紧密堆积的明胶微颗粒等材料构成，具有宾汉塑性体特性，可在打印后维持生物墨水预期的形状和结构。当打印结构固化后，可通过升温至 37 °C 溶解去除支撑浴7。

最近的一篇综述文章总结了使用FRESH技术在不同出版物中进行3D生物打印的各种材料。这些天然来源的材料包括从I型胶原到甲基丙烯酰化透明质酸，并代表了多种不同的凝胶化机制7。大多数采用该3D生物打印技术开展的研究使用的是静态生物材料，其不会对外部刺激产生响应。动态光可调水凝胶生物材料已被本实验室及其他研究团队8,9,10,11,12用于模拟多种纤维化疾病。与静态生物材料不同，光可调生物墨水允许先构建一个弹性模量较低的软化模型，随后通过硬化来研究细胞对微环境刚度增加的响应。

纤维化疾病的特点是细胞外基质的产生增加，可能导致组织瘢痕化和僵硬13。组织僵硬可引发进一步损伤并破坏受累组织，导致永久性器官损害甚至死亡；纤维化疾病占全球死亡人数的三分之一。在此类疾病状态下，成纤维细胞产生过量且异常的细胞外基质14,15。 成纤维细胞增殖增加以及细胞外基质沉积加剧了组织僵硬，并激活促纤维化的正反馈环路16,17,18,19。 研究成纤维细胞的活化对于理解纤维化疾病至关重要。本文以人类肺动脉高压（PAH）为例，介绍一种重要的纤维化疾病，其中利用3D生物打印技术模拟血管的三维几何结构，并引入光可调水凝胶的动态刚化能力具有重要意义。肺动脉高压是一种主肺动脉压力超过正常水平的病症，会对心脏造成负担，增加人肺动脉外膜成纤维细胞（HPAAF）的活化，并使血管组织僵硬16,17,18,19。一种光可调聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）生物墨水配方可在构建体中实现时间可控的刚化，有助于模拟健康组织 以及疾病进展过程5,8,9,10。利用这一独特特性，可 在三维环境中量化HPAAF对微环境刚化响应的活化与增殖情况，可能为该疾病相关的细胞机制提供有价值的见解。本文所述方案将使研究人员能够构建三维模型，以重现疾病进展或组织修复过程中细胞外微环境的变化，并研究成纤维细胞的活化。

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方案

1. PEGαMA 的合成与表征

注意：聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）的合成方法改编自 Hewawasam 等 并在无水条件下进行9.

  1. 称量反应物。
    注意：例如，称取 5 g 10 kg/mol 8 臂 PEG-羟基（PEG-OH）和 0.38 g 氢化钠（NaH）（参见 材料清单).
  2. 向250 mL Schlenk烧瓶中加入搅拌子，并用氩气吹扫。
  3. 在Schlenk烧瓶中，用溶解所需的最小体积无水四氢呋喃（THF）溶解PEG-OH。
    注意：约80 mL THF可溶解5 g PEG-OH。加入溶解PEG-OH所需的最小量THF。
  4. 向反应混合物中加入3倍摩尔过量的NaH，并在室温（RT）下搅拌30分钟。
  5. 加入6倍摩尔过量的2-(溴甲基)丙烯酸乙酯（EBrMA，参见 材料列表逐滴加入Schlenk烧瓶中，并用铝箔包裹反应容器以避光。室温下搅拌反应约48小时。
    注意：对于5 g PEG-OH和0.38 g NaH，此反应需使用3.68 mL EBrMA。
  6. 加入几滴 1 N 乙酸以终止反应。通过助滤剂对溶液进行减压过滤。
    注意：加入乙酸会产生气泡。当气泡停止生成时，应停止滴加乙酸，这表明混合物已成功淬灭。
  7. 在旋转蒸发仪上浓缩滤液，并进行沉淀 4 °C 乙醚。将沉淀物避光放置于 4 °C 12-18 小时。
  8. 将一张沃特曼滤纸放入布氏漏斗中。缓慢将反应混合物倒入滤纸上，利用真空抽滤将沉淀物与乙醚分离。将沉淀物收集至一个干燥洁净的抽滤瓶中。
  9. 将产物在室温下真空干燥至少5小时或过夜，然后溶于所需最小体积的去离子水中。将溶解后的产物转移至透析袋中（参见 材料列表）并在至少4天内对3.5 L去离子水进行透析，每12小时更换一次透析水。
    注意：真空干燥后，产物将呈现为完全干燥的纯白色固体粉末。
  10. 将产物快速冷冻，并冷冻干燥约72小时，或直至完全干燥。
  11. 将产物溶于氘代氯仿（CDCl₃）中3）。使用样品进行运行 1采用进行 248 次扫描、弛豫时间为 2.5 秒的方案进行氢核磁共振（1H NMR）。
  12. 通过标定 CDCl 验证产物的功能化程度和纯度3 将溶剂峰校准至7.26 ppm，对PEG骨架质子峰（d 3.71）进行积分，并将积分值校准为114。
  13. 整合剩余的峰：PEGαMA 1H NMR（300 MHz，CDCl₃）3）：d（ppm）1.36（t，3H，CH3-），3.71（s，114H，PEG CH2-CH2)，4.29（t，s，4H，-CH2-C(O)-O-O, -O-CH2-C(=CH2)-)，5.93（q，1H，-C=CH2），6.34（q，1H，-C=CH2）并根据 PEG 骨架校准结果，将 αMA 烯烃端基峰的积分值与预期值（1H）进行比较（图1).
    注意：将标记为“a”的两个峰取平均值（图1）乘以100，以获得平均PEGαMA功能化百分比。

核磁共振波谱图；聚合物结构，化学位移；质子分析；教学示意图
图1质子核磁共振（1H NMR）证实了PEGαMA功能化的成功。 NMR 分析在氘代氯仿（CDCl₃）中进行3）并显示出96.5%的功能化率。PEGαMA 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1.36 (t, 3H, CH3-），3.71（s，114H，PEG CH2-CH2），4.29（t，s，4H，-CH2-C(O)-O-O, -O-CH2-C(=CH2)-), 5.93 (q, 1H, -C=CH2)，6.34（q，1H，-C=CH2). 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 模型设计与3D生物打印设备设置

注意：通过将市售的 3D 打印机（见材料表）的热塑性挤出机替换为自行构建的注射泵挤出机，并参考 Hinton 等人20 的方法进行改装。开源设计可在线获取：https://3d.nih.gov/users/awfeinberg。

  1. 打开 Fusion 360 软件（参见 材料表），设计一个三维计算机辅助的中空圆柱体结构。
    注意：可在 补充文件 1 中获取可用于此步骤并模拟血管几何结构的可下载文件。
  2. 保存文件，并在 Slic3r 软件中（参见 材料表）打开该文件。仔细检查所有参数是否符合预期，然后点击导出 G 代码按钮。将生成的 G 代码保存至计算机。
  3. 打开 Pronterface 软件（参见 材料表），并上传 G 代码文件。
    注意：Pronterface 软件可与生物打印机进行通信，并提供足够的硬件输入控制。可用的 G 代码文件可在 补充文件 2 中获取。
  4. 使用无菌技术将生物打印机及所有相关部件转移至生物安全柜（BSC）内。
  5. 将一个 30 G、0.5 英寸长度的钝头针尖（参见 材料表）安装到打印用玻璃注射器上，并放置一旁备用。
  6. 将生物打印机的电源线插入电源插座。按下生物打印机前面的红色电源按钮以开启设备。将通用串行总线（USB）线缆连接至计算机与生物打印机之间，并确保所有线路连接牢固且已插好。

3. 支持浴液与试剂的准备

注意：所有步骤均须在生物安全柜中采用无菌技术进行。

  1. 根据制造商说明，配制由 SmBM 基础培养基（CC-3181）和 SmGM-2 SingleQuots 添加剂（CC-4149）组成的细胞培养基，不添加胎牛血清（FBS）。4 °C 保存，备用。
  2. 取 50 mL 细胞培养基，加入 1% v/v 胎牛血清（FBS）（CC-4149）（见材料表），配制低血清培养基。4 °C 保存，备用。
  3. 按照制造商说明，使用不含 FBS 的无菌细胞培养基作为溶剂，重悬明胶浆粉末（见材料表）。使用前立即用 2 M 氢氧化钾（KOH）和/或 2 M 盐酸（HCl）调节明胶浆的最终 pH 至 pH 9，并使用 pH 计根据需要调整溶液 pH。
  4. 使用无针头的注射器，每孔加入 1 mL 明胶浆，将 24 孔板中所需数量的孔填充至约一半高度。
    注意：均匀填充孔的中心区域，并确认无气泡存在。轻敲培养板以帮助均匀分布微粒浆液。根据需要调整每孔浆液的高度和体积，以适应不同生物打印尺寸和形状。用户可自制注射器将明胶浆转移至各孔。具体操作为：将合适尺寸的注射器推杆插入已装有压实明胶浆的 50 mL 试管底部。插入推杆时，沿试管旁插入一根细导丝以帮助排出空气，待推杆接触明胶浆后将其移除。使用前立即用剃刀片切掉试管尖端，形成明胶浆挤出孔，然后下压推杆。
  5. 将装有明胶浆的 24 孔板放置于生物打印机平台中心，并固定于平台上。
    注意：图 2 显示了一种通用的生物打印机设置。在打印平台上缠绕橡皮筋，以固定 24 孔板并防止移动。

带有注射器、生物墨水、挤出打印头的3D生物打印装置；组织工程过程。
图2：基本的3D生物打印装置示意图。 生物打印机安装在无菌环境（如生物安全柜）内，打印头组装完成后，将玻璃注射器和针头垂直下降至下方支撑浴打印区域。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 细胞培养

注意：所有步骤均须在生物安全柜中使用无菌技术进行。

  1. 解冻HPAAF细胞（商业获取，参见 材料列表) 并根据制造商说明，将细胞置于含 SmBM 基础培养基（CC-3181）及全部 SmGM-2 SingleQuots 添加剂（CC-4149）的 T-75 组织培养处理塑料培养瓶中进行扩增（参见 材料清单).
    注意：应采用标准的贴壁细胞培养方案，维持细胞在 37 °C 和 5% CO2 每隔几天更换一次培养基。
  2. 当HPAAFs达到约80-90%融合度时，吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
  3. 向每个T-75培养瓶中加入约4 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。倾斜培养瓶，确保细胞培养表面完全被0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖。将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育3–5分钟 37 °C 并检查细胞是否脱落。
  4. 待细胞悬浮后，向每个培养瓶中加入至少6 mL的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并将细胞转移至50 mL锥形管中。
  5. 将细胞悬液在300 x g 在室温下离心5分钟以收集细胞。吸除细胞沉淀上的上清液，用含FBS的1-3 mL培养基重悬细胞。 1000 µL 移液，确保形成单细胞悬液。
  6. 转移 10 µL 将细胞悬液转移至微量离心管中。加入 10 µL 台盼蓝溶液并充分混匀。使用 10 µL 将此混合液用于倒置光学显微镜下通过血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：为实现 4 x 106 细胞/mL 最终生物墨水浓度，每份预留 800,000 个成纤维细胞 200 µL 生物墨水

5. 水凝胶生物墨水的制备

注意：生物墨水的制备方法改编自 Davis-Hall 等人5。步骤 5.1–5.2 可与步骤 4.1–4.3 并行操作，以尽量缩短细胞收集与重悬于生物墨水之间的时间。所有操作均应在生物安全柜中采用无菌技术进行。

  1. 配制 20 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP，参见材料表）pH 7 溶液，并使用 0.2 µm 注射器滤器进行无菌过滤。使用前立即加入 2 M KOH 和/或 2 M HCl，根据需要调节溶液 pH。用 pH 计测量并相应调整。
    注意：TCEP 可还原二硫键。
  2. 配制浓度为 0.25 mg/mL 的 PEGαMA 储存液，将其重悬于不含 FBS 的无菌细胞培养基中；分别配制 250 mM 的 1,4-二硫苏糖醇（DTT）、MMP2 可降解交联剂和 CGRGDS（RGD）肽（参见材料表）储存液，均用 20 mM 无菌 TCEP 溶液重悬；另用移液器配制 15 wt% 的聚环氧乙烷（PEO）储存液，溶于去离子（DI）水中，根据需要使用移液器操作。
  3. 参照表 1，将所需量的 PEGαMA、DTT、MMP2 可降解交联剂、PEO、CGRGDS 和低血清细胞培养基与成纤维细胞一起加入 50 mL 锥形管中。
    注意：建议在加入除细胞培养基外的所有组分后，使用 pH 试纸检测 pH，此混合物的 pH 应非常接近 6.2。若需进一步调节 pH，请记录为调节前体溶液 pH 所需添加的额外体积。最终通过加入剩余的细胞培养基（减去 pH 调节时已加入的体积）将总体积补足至 200 µL。
  4. 使用正排量移液器混合生物墨水，确保细胞为单细胞状态，并确认最终前体溶液的 pH 为 6.2，以防止在 3D 生物打印过程中发生碱催化聚合。
  5. 通过取出玻璃注射器的活塞，并使用另一支连接有 15 号、1.5 英寸长度钝头针尖的注射器（参见材料表），将生物墨水从离心管转移至玻璃注射器中，装入时注意避免在溶液中产生气泡。
  6. 将玻璃注射器放入打印头中，并安装打印头组件，确保所有部件牢固组装，准备就绪以进行打印。
    注意：此时打印头内的玻璃注射器应已安装 30 号、0.5 英寸长度的钝头针尖，用于打印。

   

组分储存液浓度添加量
PEGαMA0.25 mg/ml140 µL
DTT250 mM12.24 µL
MMP2 可降解交联剂250 mM5.25 µL
RGD250 mM1.6 µL
PEO15 wt%33.33 µL
活化培养基和/或 pH 调节试剂-7.58 µL
成纤维细胞-800000 cells

表1：制备200 µL 生物墨水（水凝胶前体溶液与成纤维细胞）所需的示例体积。

6. 三维生物打印

注意：所有步骤均须在生物安全柜中采用无菌技术进行。

  1. 使用 Pronterface 软件中的方向箭头，手动调节挤出针的位置，使其位于孔的中心并处于支撑浴浆料中。针尖下方应至少保留 1 mm 的支撑浴浆料。
    注意：该软件无法识别针头在空间中的具体位置。用户必须通过手动点击软件中的箭头来移动针头，完全由用户自行操作。例如，点击上箭头将使针头向上或远离打印平台移动， 等等。）。小心移动针头，确保其不会触碰到孔板的任何边界。
  2. 当针尖位于孔中混合液中央后，点击Pronterface中的开始按钮，等待打印完成以获得构建体，如图所示。 图 3A.
    注意：使用提供的文件进行一次构建体的生物打印（补充文件 1），整个过程大约需要3分钟。调整并移动针头约需5分钟，随后从头到尾完成一个结构的打印。
  3. 重复步骤 6.1–6.2，直至达到所需数量的生物打印结构。
    注意：建议构建的质粒数量应多于实际所需，以弥补可能的打印失败。若出现失败情况，应移至下一孔，重置所有设置，并重复步骤6.1–6.2。 
  4. 打印完成后，将培养板置于室温下，并在生物安全柜中覆盖孵育1小时，以促进光可调水凝胶的碱催化聚合。
  5. 将含有3D生物打印结构的培养板放入 37 °C 无菌培养箱中孵育12-18小时，使支撑浴浆液完全溶解。

3D水凝胶结构；光聚合；细胞标志物；实验装置；显微镜分析。
图3：实验示意图。 本方案分为三个主要步骤：（A）3D生物打印包埋细胞的PEGαMA中空管，以模拟肺血管结构；（B）光引发均聚反应，以增强细胞微环境的刚度；（C）检测细胞增殖与活化的标志物。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 3D 生物打印结构的培养与光致硬化

注意：所有步骤均应在生物安全柜中采用无菌技术进行。

  1. 在 PBS 中配制 2.2 mM 的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）（见材料表）储备液，并使用 0.2 µm 注射器滤器进行无菌过滤。LAP 溶液需避光保存。
  2. 12–18 小时后，更换生物打印结构周围的培养基。手动移除孔内的培养基和融化的明胶支撑浴，注意不要扰动生物打印结构。
    注意：可将培养板倾斜约 45° 角缓慢移除培养基，以便观察孔内结构的显露情况。成功打印时，每个孔中应可辨识出透明的水凝胶圆柱体（图 4A）。
  3. 向每孔中加入适量的低血清培养基。
    注意：对于 24 孔板，每孔加入 700 µL 培养基可完全覆盖生物打印结构。可根据实际情况进行调整。
  4. 将培养板放回培养箱，并根据实验设计每 3 天更换一次培养基。
  5. 在目标硬化时间点前 24 小时，移除样品中的培养基，并替换为添加了 2.2 mM 无菌 LAP 的低血清培养基。
    注意：如需对结构进行荧光标记，可将 3D 生物打印结构在含 10 µM 甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B（见材料表）的 PBS 中溶胀过夜，然后按步骤 7.6 进行硬化以实现荧光标记。随后在 4 °C 条件下用 PBS 洗涤 2 天以去除过量罗丹明，再使用 TRITC 滤光片进行成像（图 4B,C）。
  6. 在目标硬化时间点，移除待硬化孔中一半的培养基，将培养板去盖后置于紫外光下。打开紫外光源，使用 Omnicure（见材料表）和 365 nm 带通滤光片，以 10 mW/cm2 的强度照射 365 nm 光 5 分钟，使这些结构硬化（图 3B）。
    注意：在细胞暴露于紫外光前，应使用辐射计/光度计确认光照强度准确无误。
  7. 移除这些孔中剩余的培养基，并向每孔中加入新鲜的低血清培养基。将培养板放回培养箱。
  8. 从培养箱中取出培养板，并在所需时间点按照步骤 9 进行成纤维细胞活化研究。

细胞活力分析，活/死染色实验；图像显示显微镜结果及21天内活细胞数量的图表。
图4：3D生物打印的水凝胶结构在随时间延长的过程中支持细胞存活。（A）置于24孔板中的3D打印水凝胶结构的照片。（B）荧光标记的PEGαMA 3D打印水凝胶的最大强度投影图像。比例尺 = 1 mm。高倍显微镜图像显示，FRESH生物打印支撑浴中明胶微粒诱导形成了水凝胶结构内部的孔隙。（C）在共聚焦显微镜下观察到的荧光标记的刚性化区域的PEGαMA管状结构（显示100 µm的z轴堆栈，以最大强度投影呈现），展示了在三维空间中对刚性化区域的精确控制。比例尺 = 500 µm。（D）通过活/死染色法测定3D生物打印结构中HPAAF细胞的活力。厚度为300 µm、细胞密度为4 × 106 cells/mL的条件在所有时间点均优于其他各组。细胞活力在第7天达到峰值。因此选择该条件及该时间点用于后续实验。柱状图表示均值 ± 标准误（SEM），n = 3。*，p < 0.05，单因素方差分析（ANOVA），Tukey HSD检验。（E）在第7天（整体细胞活力最高的时间点）对3D结构中的细胞进行活/死染色试剂染色后的代表性共聚焦显微图像。Calcein AM将活细胞标记为绿色，碘化丙啶将死细胞标记为红色。最右侧一列表明，表现最佳的条件具有均匀的细胞分布和较高比例的活细胞。比例尺 = 500 µm。经Davis-Hall等5许可转载。请点击此处查看此图的高清版本。

8. 成纤维细胞活力的评估

  1. 在预定的细胞活性检测时间点，使用钙黄绿素 AM 和碘化丙啶进行染色（参见材料表）。
    注意：总结如下，应从每个孔中移除培养基，并用无菌 PBS 冲洗构建物。将构建物置于活/死染色液中，在 37°C 摇床上孵育 40 分钟。染色液应包含钙黄绿素 AM（1:1000 稀释）和碘化丙啶（1:1000 稀释），以便在成像时区分活细胞与死细胞。
  2. 将构建物转移至无菌 PBS 中，并立即在共聚焦荧光显微镜下进行成像。每个时间点每份样品采集三个不同的 100 µm z 轴层扫图像，并以活细胞的平均百分比表示细胞活性（图 4D、E）。

9. 成纤维细胞活化的评估

  1. 在 PBS 中配制 3% w/v 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1% v/v 吐温 20。该溶液将被称为免疫荧光（IF）溶液。
  2. 在预定时间点，从样本孔中移除培养基，并用 PBS 冲洗构建物。加入 4% 多聚甲醛（PFA），在 37 °C 摇床上固定 30 分钟。随后，用含 100 mM 甘氨酸的 PBS 替换 4% PFA，在室温（RT）摇床上继续孵育 15 分钟。
  3. 接下来，将样本转移至组织冷冻模具（Tissue-Tek Cryomolds）中，完全覆盖最佳切割温度（OCT）包埋剂（见材料表），并在 4 °C 下使 OCT 渗入样本 12–18 小时。
  4. 使用液氮在 2-甲基丁烷中快速冷冻已浸透 OCT 的样本。准备一个泡沫盒或其他合适容器，装入液氮，再将盛有 2-甲基丁烷的第二容器置于液氮中，使其至少一半浸没。用镊子夹住每个含有 OCT 包埋样本的冷冻模具，浸入液氮冷却的 2-甲基丁烷中，直至明显冻结。这些样本可在 -80 °C 下保存，直至进行冷冻切片。
    注意：操作液氮时应穿戴低温防护手套、低温防护围裙和面罩等个人防护装备（PPE）（见材料表，低温安全防护套件）。
  5. 在 -22 °C 下对冷冻的 OCT 样本进行切片，并将 10 µm 厚的切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。每个 3D 水凝胶样本准备三张载玻片，每张载玻片至少包含 3–5 个冷冻切片。
    备注：若需暂停实验，载玻片可在此阶段于 -80 °C 下保存。
  6. 将冷冻切片在冰冻丙酮中固定 15 分钟，以增强其与载玻片的黏附性。用室温水轻轻冲洗以去除残留的 OCT。让样本自然干燥，并用疏水笔标记切片区域（见材料表）。
  7. 在室温下用含 0.2% v/v Triton X-100 的 PBS 对样本进行透化处理 10 分钟，随后在室温下用含 5% w/v BSA 的 PBS 封闭 1 小时。
  8. 将小鼠抗人 α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）一抗（1:250 稀释）加入 IF 溶液中（见材料表）。将切片样本与一抗在 4 °C 下孵育过夜，随后用 IF 溶液冲洗 3 次。
  9. 将切片在含二抗（山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 抗体，1:250 稀释）和每毫升 IF 溶液中加入两滴 ActinGreen 488 ReadyProbe（见材料表）的 IF 溶液中孵育。后续所有步骤均需用铝箔包裹样本以避光，在室温下孵育 1 小时。
  10. 用 IF 溶液冲洗切片 3 次。在去离子水中加入 300 nM DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色 15 分钟（室温）。最后用去离子水冲洗 3 次。
  11. 使用 10 µL 商业抗荧光淬灭剂（见材料表），按标准方法加盖玻片。
    备注：封片后的载玻片可在 -80 °C 冰箱中避光保存，直至成像使用。
  12. 使用荧光显微镜对冷冻切片进行成像（图 3C 和 图 5B）。每张载玻片随机选取三个区域，使用 10 倍物镜进行成像。
    备注：图像应在 DAPI、FITC 和 TRITC 通道下采集。
  13. 将图像导入 ImageJ（NIH）软件。通过将每个视野中 αSMA 阳性细胞总数除以细胞核总数，计算 αSMA 阳性细胞百分比，作为成纤维细胞活化的量化指标（图 5A）。

成纤维细胞活化与增殖；柱状图、荧光显微镜图像、刚度影响分析。
图 5：肺动脉外膜三维生物打印模型中的成纤维细胞活化。 (A) 通过αSMA表达检测软质和硬化三维水凝胶中成纤维细胞的纤维化活化。在硬化结构中，人肺动脉外膜成纤维细胞（HPAAF）的αSMA阳性率显著高于软质结构中的细胞。柱状图表示均值 ± 标准误（SEM），n = 3。*，p < 0.05，Mann-Whitney U检验。(B) 软质和硬化三维水凝胶中αSMA、肌动蛋白和DAPI免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。在硬化结构中，HPAAF表现出比软质结构中更广泛的αSMA免疫荧光信号。比例尺 = 250 µm。(C) 通过EdU阳性率检测软质和硬化三维生物打印结构中的成纤维细胞增殖。在硬化结构中，HPAAF的EdU阳性率显著高于软质结构中的细胞。柱状图表示均值 ± SEM，n = 3。*，p < 0.05，Mann-Whitney U检验。(D) 软质和硬化三维水凝胶中EdU和Hoechst染料免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。在硬化结构中，HPAAF表现出比软质结构中更广泛的EdU免疫荧光信号。比例尺 = 300 µm。经Davis-Hall等5许可转载。请点击此处查看该图的高清版本。

10. 成纤维细胞增殖的评估

  1. 在预定的增殖时间点前 24 小时，从每个孔中移除细胞培养基，并替换为添加了商用细胞增殖检测试剂盒中 10 µM EdU 溶液的低血清培养基（参见 材料表）。将样品放回培养箱中，过夜孵育。
  2. 在预定的增殖时间点，使用 4% 多聚甲醛（PFA）在 37 °C 条件下于摇床上固定 EdU 孵育的样品，固定 30 分钟。用 PBS 中的 100 mM 甘氨酸溶液替换 4% PFA 溶液，并在 37 °C 下孵育样品至少 15 分钟。加入适当浓度的 Hoechst 染色 30 分钟，然后用 PBS 清洗样品 2 次。
    注意：样品可在避光条件下于 4 °C 保存，直至成像。
  3. 使用荧光显微镜及建议的细胞增殖检测试剂盒制造商推荐的设置和滤光片对所有固定并保存的 EdU 样品进行成像（图 3C 和 图 5D）。每个样品采集三个不同的 100 µm z 轴层扫描图像，并对每个 z 轴层扫描图像生成最大投影图像。通过计数最大投影图像中 EdU 阳性细胞的数量，并除以 Hoechst 复染识别出的总细胞数，来测量 HPAAF 的增殖情况（图 5C）。

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结果

本方案描述了如何在支撑浴中对光可调水凝胶进行三维生物打印，以构建能够动态且随时间硬化、并模拟人体组织几何结构的支架，用于研究成纤维细胞的活化。首先，本方案介绍了如何合成该光可调聚合物体系的骨架材料PEGαMA。核磁共振（NMR）波谱分析显示PEGαMA的功能化率达到96.5%（图1）。功能化率在90%或以上均适用于本实验。接下来，详细说明了如何创建中空圆柱体的三维CAD模型，以模拟肺部血管结构。补充文件1中提供了可下载的三维CAD模型，而该设计对应的G代码可在补充文件2中获取。该CAD模型所生成的结构具有以下尺寸：高度4 mm，内径4 mm，壁厚300 µm。

生物打印机设置说明如下所示（图2将打印头牢固组装并固定，使玻璃注射器和针头能够将生物墨水直接挤出到下方含有支撑浴的孔板中，是至关重要的一步（图2 和

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讨论

通过控制光照条件引发的双阶段聚合反应可实现对生物材料刚度的时空调控。已有多个研究利用该技术在不同平台上评估细胞-基质相互作用。5,8,9,10,11,21,22,23更具体而言，可采用光掩模或双光子激发方法对3D生物打印结构的特定区域进行刚性化，以研究细胞在受限区域或界面处对局部动态刚性变化的响应，如我们先前发表的研究所述。5,8选择有意义的时间点以评估细胞反应至关重要。在此，允许成纤维细胞在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。本稿件部分内容经许可转载自 © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf。5 保留所有权利。

致谢

作者谨向 Adam Feinberg 博士（卡内基梅隆大学）以及举办 3D 生物打印开源研讨会的各方致以谢意。正是这些个人和机构使得作者能够学习 FRESH 生物打印技术，并搭建本研究所用的 3D 生物打印机。此外，作者谨向 Biorender.com 致谢，本文中的示意图由该平台绘制。本研究得到了多个团体或资助机构的支持，包括 Rose 社区基金会（DDH 和 CMM）、科罗拉多肺血管疾病研究奖（DDH 和 CMM）、美国国家科学基金会 Award 1941401 项目（CMM）、美国陆军部 Award W81XWH-20-1-0037 项目（CMM）、美国国立卫生研究院国家癌症研究所 Award R21 CA252172 项目（CMM）、科罗拉多大学安舒茨医学校区 Ludeman 女性健康研究中心（DDH 和 CMM），以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所 Award R01 HL080396（CMM）、R01 HL153096（CMM）、F31 HL151122（DDH）和 T32 HL072738（DDH 和 AT）项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AccuMax 辐射计/光度计套装Spectronics CorporationXPR-3000用于测量光强度，适用于光致硬化
乙酸 Fisher ScientificBP2401-500用于 PEGaMA 合成过程
丙酮Fisher ScientificA184与冷冻切片一起使用
ActinGreen 488 ReadyProbesFisher ScientificR37110用于染色
铝箔ReynoldsF28028
无水四氢呋喃（THF）Sigma-Aldrich401757-1L用于 PEGaMA 合成过程
压缩氩气AirgasAR R300用于 PEGaMA 合成过程
8 臂聚乙二醇-羟基（PEG-OH）JenKem Technology8ARM-PEG-10K用于 PEGaMA 合成过程
365 nm 带通滤光片Edmund Optics65-191用于光致硬化
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP9700-100用于染色过程
布氏漏斗Quark GlassQFN-8-14用于 PEGaMA 合成过程
Calcein AMInvitrogen65-0853-39用于染色过程
Celite 545（助滤剂）EMD MilliporeCX0574-1用于 PEGaMA 合成过程
带电荷显微镜载玻片Globe Scientific1358W
氘代氯仿Sigma-Aldrich151823-10X0.75ML用于表征 PEGaMA
Click-iT Plus EdU 细胞增殖检测试剂盒InvitrogenC10637用于染色
50 mL 锥形管CELLTREAT667050B
低温安全防护套装Cole-ParmerEW-25000-85
冷冻切片机LeicaCM 1850-3-1
透析管Repligen132105
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Sigma-AldrichD9542-1MG用于染色
乙醚Fisher ScientificE1384用于 PEGaMA 合成过程
1,4-二硫苏糖醇（DTT） Sigma-Aldrich10197777001生物墨水组分
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）CytivaSH30271.FS
滤纸Whatman1001-090用于 PEGaMA 合成过程
Freezone 2.5L 冷冻干燥系统LabconcoLA-2.5LR冻干机
Fusion 360AutodeskN/A软件下载
2.5 mL 气密注射器Hamilton81420用于生物打印
15 号 1.5" IT 系列喷嘴Jensen GlobalJG15-1.5X用于生物打印
30 号 0.5" HP 系列喷嘴Jensen GlobalJG30-0.5HPX用于生物打印
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 抗体Fisher ScientificA21422用于染色
甘氨酸Fisher ScientificC2H5NO2用于染色过程
血细胞计数板Fisher Scientific1461
HoechstThermo Scientific62249用于染色过程
人肺动脉外膜成纤维细胞（HPAAFs）AcceGenABC-TC3773 来源于一名 2 岁男性患者
盐酸（HCl）Fisher ScientificA144-500用于调节溶液 pH 值
ImageJ美国国立卫生研究院（NIH）N/A免费软件下载
ImmEdge® 笔Vector LaboratoriesH-4000用于染色过程
培养箱VWRVWR51014991
LifeSupport 明胶微粒悬浮液（明胶悬浮液）Advanced Biomatrix5244-10GM用于生物打印
光学显微镜OlympusCKX53倒置光学显微镜
二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）Sigma-Aldrich900889-5G用于光致硬化的光引发剂
液氮N/AN/A
LulzBot Mini 2 LulzBotN/A经改造的生物打印机
甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B Polysciences Inc.669775-30-8
2-甲基丁烷Sigma-AldrichM32631-4L
Microman 毛细管活塞 CP1000VWR76178-166正向置换移液器吸头
MMP2 可降解交联剂（KCGGPQGIWGQGCK）GL BiochemN/A生物墨水组分
小鼠抗人 αSMA 单克隆抗体Fisher ScientificMA5-11547用于染色
OmniCure 系列 2000 Lumen DynamicsS2000-XLA用于光致硬化的紫外光源
多聚甲醛（PFA） Electron Microscopy Sciences15710用于固定样品
pH 计Mettler Toledo FP20 
pH 试纸Cytiva10362010
磷酸盐缓冲液（PBS）Hyclone Laboratories, Inc.Cytiva SH30256.FS
移液器套装Fisher Scientific14-388-100
10 µL 移液器吸头USA Scientific1120-3710
20 µL 移液器吸头USA Scientific1183-1510
200 µL 移液器吸头USA Scientific1111-0700
1000 µL 移液器吸头USA Scientific1111-2721
聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）N/AN/A合成步骤请参见论文
聚环氧乙烷（PEO）Sigma-Aldrich372773-250G生物墨水组分
正向置换移液器Fisher ScientificFD10004G100–1000 µL
氢氧化钾（KOH）Sigma-Aldrich221473-500G用于调节溶液 pH 值
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930用于染色过程
PronterfaceAll3DPN/A软件下载
碘化丙啶Sigma-AldrichP4864-10ML用于染色
RGD 肽（CGRGDS）GL BiochemN/A生物墨水组分
摇床VWR10127-876
旋转蒸发仪 Thomas Scientific11100V2022用于 PEGaMA 合成过程
橡胶圈Staples808659
施伦克烧瓶 Kemtech AmericaF902450用于 PEGaMA 合成过程
Slic3rSlic3rN/A软件下载
平滑肌细胞生长培养基-2（SmGM-2）BulletKitLonzaCC-3182试剂盒包含 CC-3181 和 CC-4149 组分
氢化钠 Sigma-Aldrich223441-50G用于 PEGaMA 合成过程
Sorvall ST 40R 离心机Fisher Scientific75-004-525
搅拌子VWR58948-091
注射器滤器VWR28145-483用于溶液的无菌过滤
T-75 组织培养处理烧瓶VWR82050-856用于细胞培养操作
Tissue-Tek 冷冻模具Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂（OCT）Sakura4583
三(2-羧乙基)膦（TCEP）Sigma-AldrichC4706-2G
吐温 X-100Fisher BioreagentsC34H622O11用于染色过程
台盼蓝Sigma-AldrichT8154-20ML用于细胞培养操作
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25-300-062用于细胞培养操作
吐温 20Fisher BioreagentsC58H114O26用于染色过程
直立式显微镜OlympusBX63F具备荧光显微镜功能
水浴锅PolyScienceWBE20A11B
24 孔组织培养板Corning3527

参考文献

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