本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。
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摘要
摘要
光可调水凝胶可在光照下发生空间和时间上的转变。将此类生物材料整合到细胞培养平台中，并动态触发其变化（例如增加微环境刚度），可使研究人员模拟纤维化疾病进展过程中细胞外基质（ECM）发生的变化。本文介绍了一种在明胶支撑浴中进行两次连续聚合反应的光可调水凝胶生物材料的3D生物打印方法。通过调节支撑浴的pH值以促进迈克尔加成反应，对自由形式悬浮水凝胶可逆嵌入（FRESH）生物打印技术进行了改进。首先，将含有聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）的生物墨水与可细胞降解的交联剂以非化学计量比反应，形成柔软的水凝胶。随后，将这些柔软水凝胶暴露于光引发剂和光照下，诱导未反应基团的均聚反应，从而使水凝胶硬化。本方案涵盖了水凝胶合成、3D生物打印、光致硬化以及终点表征，用于评估成纤维细胞在3D结构中的活化状态。本文所述方法使研究人员能够3D生物打印经历pH催化聚合反应的多种材料，并可用于构建组织稳态、疾病及修复的多种模型。
引言
3D 生物打印是一项变革性技术，使研究人员能够在三维空间内精确地沉积细胞和生物材料，重建生物组织复杂的层级结构。在过去十年中，3D 生物打印技术的进步已成功构建出跳动的人类心肌组织1、功能性肾组织模型2、肺部气体交换模型3以及用于癌症研究的肿瘤模型4。嵌入式 3D 生物打印技术（如悬浮水凝胶自由成型可逆嵌入，FRESH 生物打印）的发明，使得在三维空间中复制复杂的软组织结构（例如肺部血管5甚至人类心脏6）成为可能。FRESH 3D 生物打印通过将软质、低粘度的生物墨水挤出至剪切稀化支撑浴中，实现逐层打印。该支撑浴由紧密堆积的明胶微颗粒等材料构成，具有宾汉塑性体特性，可在打印后维持生物墨水预期的形状和结构。当打印结构固化后，可通过升温至 37 °C 溶解去除支撑浴7。
最近的一篇综述文章总结了使用FRESH技术在不同出版物中进行3D生物打印的各种材料。这些天然来源的材料包括从I型胶原到甲基丙烯酰化透明质酸，并代表了多种不同的凝胶化机制7。大多数采用该3D生物打印技术开展的研究使用的是静态生物材料，其不....
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方案
1. PEGαMA 的合成与表征
注意：聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）的合成方法改编自 Hewawasam 等 并在无水条件下进行9.
- 称量反应物。
注意：例如，称取 5 g 10 kg/mol 8 臂 PEG-羟基（PEG-OH）和 0.38 g 氢化钠（NaH）（参见 材料清单). - 向250 mL Schlenk烧瓶中加入搅拌子，并用氩气吹扫。
- 在Schlenk烧瓶中，用溶解所需的最小体积无水四氢呋喃（THF）溶解PEG-OH。
注意：约80 mL THF可溶解5 g PEG-OH。加入溶解PEG-OH所需的最小量THF。 - 向反应混合物中加入3倍摩尔过量的NaH，并在室温（RT）下搅拌30分钟。
- 加入6倍摩尔过量的2-(溴甲基)丙烯酸乙酯（EBrMA，参见 材料列表逐滴加入Schlenk烧瓶中，并用铝箔包裹反应容器以避光。室温下搅拌反应约48小时。
注意：对于5 g PEG-OH和0.38 g NaH，此反应需使用3.68 mL EBrMA。 - 加入几滴 1 N 乙酸以终止反应。通过助滤剂对溶液进行减压过滤。
注意：加入乙酸会产生气泡。....
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结果
本方案描述了如何在支撑浴中对光可调水凝胶进行三维生物打印，以构建能够动态且随时间硬化、并模拟人体组织几何结构的支架，用于研究成纤维细胞的活化。首先，本方案介绍了如何合成该光可调聚合物体系的骨架材料PEGαMA。核磁共振（NMR）波谱分析显示PEGαMA的功能化率达到96.5%（图1）。功能化率在90%或以上均适用于本实验。接下来，详细说明了如何创建中空圆柱体的三维CAD模型，以模拟肺部血管结构。补充文件1中提供了可下载的三维CAD模型，而该设计对应的G代码可在补充文件2中获取。该CAD模型所生成的结构具有以下尺寸：高度4 mm，内径4 mm，壁厚300 µm。
生物打印机设置说明如下所示（图2将打印头牢固组装并固定，使玻璃注射器和针头能够将生物墨水直接挤出到下方含有支撑浴的孔板中，是至关重要的一步（图2 和
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讨论
通过控制光照条件引发的双阶段聚合反应可实现对生物材料刚度的时空调控。已有多个研究利用该技术在不同平台上评估细胞-基质相互作用。5,8,9,10,11,21,22,23更具体而言，可采用光掩模或双光子激发方法对3D生物打印结构的特定区域进行刚性化，以研究细胞在受限区域或界面处对局部动态刚性变化的响应，如我们先前发表的研究所述。5,8选择有意义的时间点以评估细胞反应至关重要。在此，允许成纤维细胞在.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。本稿件部分内容经许可转载自 © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf。5 保留所有权利。
致谢
作者谨向 Adam Feinberg 博士（卡内基梅隆大学）以及举办 3D 生物打印开源研讨会的各方致以谢意。正是这些个人和机构使得作者能够学习 FRESH 生物打印技术，并搭建本研究所用的 3D 生物打印机。此外，作者谨向 Biorender.com 致谢，本文中的示意图由该平台绘制。本研究得到了多个团体或资助机构的支持，包括 Rose 社区基金会（DDH 和 CMM）、科罗拉多肺血管疾病研究奖（DDH 和 CMM）、美国国家科学基金会 Award 1941401 项目（CMM）、美国陆军部 Award W81XWH-20-1-0037 项目（CMM）、美国国立卫生研究院国家癌症研究所 Award R21 CA252172 项目（CMM）、科罗拉多大学安舒茨医学校区 Ludeman 女性健康研究中心（DDH 和 CMM），以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所 Award R01 HL080396（CMM）、R01 HL153096（CMM）、F31 HL151122（DDH）和 T32 HL072738（DDH 和 AT）项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AccuMax 辐射计/光度计套装 | Spectronics Corporation | XPR-3000 | 用于测量光强度，适用于光致硬化 |
| 乙酸 | Fisher Scientific | BP2401-500 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 丙酮 | Fisher Scientific | A184 | 与冷冻切片一起使用 |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | 用于染色 |
| 铝箔 | Reynolds | F28028 | |
| 无水四氢呋喃（THF） | Sigma-Aldrich | 401757-1L | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 压缩氩气 | Airgas | AR R300 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 8 臂聚乙二醇-羟基（PEG-OH） | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 365 nm 带通滤光片 | Edmund Optics | 65-191 | 用于光致硬化 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Scientific | BP9700-100 | 用于染色过程 |
| 布氏漏斗 | Quark Glass | QFN-8-14 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | 用于染色过程 |
| Celite 545（助滤剂） | EMD Millipore | CX0574-1 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 带电荷显微镜载玻片 | Globe Scientific | 1358W | |
| 氘代氯仿 | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | 用于表征 PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU 细胞增殖检测试剂盒 | Invitrogen | C10637 | 用于染色 |
| 50 mL 锥形管 | CELLTREAT | 667050B | |
| 低温安全防护套装 | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM 1850-3-1 | |
| 透析管 | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 用于染色 |
| 乙醚 | Fisher Scientific | E1384 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 10197777001 | 生物墨水组分 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Cytiva | SH30271.FS | |
| 滤纸 | Whatman | 1001-090 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| Freezone 2.5L 冷冻干燥系统 | Labconco | LA-2.5LR | 冻干机 |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | 软件下载 |
| 2.5 mL 气密注射器 | Hamilton | 81420 | 用于生物打印 |
| 15 号 1.5" IT 系列喷嘴 | Jensen Global | JG15-1.5X | 用于生物打印 |
| 30 号 0.5" HP 系列喷嘴 | Jensen Global | JG30-0.5HPX | 用于生物打印 |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 抗体 | Fisher Scientific | A21422 | 用于染色 |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | C2H5NO2 | 用于染色过程 |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | 用于染色过程 |
| 人肺动脉外膜成纤维细胞（HPAAFs） | AcceGen | ABC-TC3773 | 来源于一名 2 岁男性患者 |
| 盐酸（HCl） | Fisher Scientific | A144-500 | 用于调节溶液 pH 值 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | N/A | 免费软件下载 |
| ImmEdge® 笔 | Vector Laboratories | H-4000 | 用于染色过程 |
| 培养箱 | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport 明胶微粒悬浮液（明胶悬浮液） | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | 用于生物打印 |
| 光学显微镜 | Olympus | CKX53 | 倒置光学显微镜 |
| 二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP） | Sigma-Aldrich | 900889-5G | 用于光致硬化的光引发剂 |
| 液氮 | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | 经改造的生物打印机 |
| 甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-甲基丁烷 | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman 毛细管活塞 CP1000 | VWR | 76178-166 | 正向置换移液器吸头 |
| MMP2 可降解交联剂（KCGGPQGIWGQGCK） | GL Biochem | N/A | 生物墨水组分 |
| 小鼠抗人 αSMA 单克隆抗体 | Fisher Scientific | MA5-11547 | 用于染色 |
| OmniCure 系列 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | 用于光致硬化的紫外光源 |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 用于固定样品 |
| pH 计 | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH 试纸 | Cytiva | 10362010 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| 移液器套装 | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL 移液器吸头 | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL 移液器吸头 | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL 移液器吸头 | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL 移液器吸头 | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA） | N/A | N/A | 合成步骤请参见论文 |
| 聚环氧乙烷（PEO） | Sigma-Aldrich | 372773-250G | 生物墨水组分 |
| 正向置换移液器 | Fisher Scientific | FD10004G | 100–1000 µL |
| 氢氧化钾（KOH） | Sigma-Aldrich | 221473-500G | 用于调节溶液 pH 值 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | 用于染色过程 |
| Pronterface | All3DP | N/A | 软件下载 |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | 用于染色 |
| RGD 肽（CGRGDS） | GL Biochem | N/A | 生物墨水组分 |
| 摇床 | VWR | 10127-876 | |
| 旋转蒸发仪 | Thomas Scientific | 11100V2022 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| 橡胶圈 | Staples | 808659 | |
| 施伦克烧瓶 | Kemtech America | F902450 | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| Slic3r | Slic3r | N/A | 软件下载 |
| 平滑肌细胞生长培养基-2（SmGM-2）BulletKit | Lonza | CC-3182 | 试剂盒包含 CC-3181 和 CC-4149 组分 |
| 氢化钠 | Sigma-Aldrich | 223441-50G | 用于 PEGaMA 合成过程 |
| Sorvall ST 40R 离心机 | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| 搅拌子 | VWR | 58948-091 | |
| 注射器滤器 | VWR | 28145-483 | 用于溶液的无菌过滤 |
| T-75 组织培养处理烧瓶 | VWR | 82050-856 | 用于细胞培养操作 |
| Tissue-Tek 冷冻模具 | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂（OCT） | Sakura | 4583 | |
| 三(2-羧乙基)膦（TCEP） | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| 吐温 X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | 用于染色过程 |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | 用于细胞培养操作 |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25-300-062 | 用于细胞培养操作 |
| 吐温 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | 用于染色过程 |
| 直立式显微镜 | Olympus | BX63F | 具备荧光显微镜功能 |
| 水浴锅 | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24 孔组织培养板 | Corning | 3527 |
参考文献
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
- Lin, N. Y. C., et al.
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