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测量初始和效应CD8 T细胞的线粒体功能

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DOI：

10.3791/65642

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2025年3月28日

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1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Division of Surgical Oncology, Department of Surgery, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

CD8 T细胞的生物能量学可通过线粒体应激测试（Mito Stress Test）进行检测。该方法可用于研究急性和慢性的代谢编程。本方案描述了探讨T细胞受体生物学与生物能量学分析之间关系的研究方法。

摘要

了解免疫代谢如何影响淋巴细胞的功能、分化和命运已引起广泛关注。淋巴细胞生物学的研究已采用生物能量分析，并且该方法现已成为该领域中至关重要的工具。因此，我们致力于优化一种生物能量分析检测方法，使其可结合预处理和受体刺激所需的急性给药步骤。本文中，我们评估了CD8 T细胞 离体 使用细胞线粒体应激测试（Cell Mito Stress Test）检测初始和效应CD8 T细胞的氧气消耗率和细胞外酸化率，以评估其代谢情况。抗原特异性效应CD8 T细胞通过以下方法获得： 离体 刺激，并从脾细胞中收获初始CD8 T细胞，通过磁珠柱分离法进行分离。

预处理在微孔板中进行，我们将详细介绍如何制备传感器 cartridge。我们展示了如何通过加样口加入药物以间接测量代谢能力，以及加入代谢调节剂；该方案可用于研究特定酶的活性。利用加样口进行抗 CD3/CD28 的急性注射和刺激，可实时研究 T 细胞受体的激活。使用仪器分析仪进行测量和数据采集，并通过软件程序进行数据可视化，以解析细胞代谢情况。该策略可产生大量关于免疫细胞生物学和线粒体生物能量学的数据，研究人员可根据需要对方案进行多种定制，以深入探究 CD8 T 细胞的代谢特性。

引言

免疫细胞的命运和功能受到代谢、氧化消耗和无氧呼吸的显著影响1,2,3,4。近年来，通过靶向调控代谢以重编程或恢复CD8 T细胞的命运和效应功能，并提高病毒清除能力或增强内源性抗肿瘤免疫，正受到越来越多的关注5,6,7,8,9。值得注意的是，T细胞受体（TCR）介导的抗原受体信号传导是CD8 T细胞分化的关键条件，可引发下游信号转导和激活10,11,12（图1）。长期暴露于免疫损伤会导致TCR持续的抗原特异性刺激，最终引发慢性炎症状态、T细胞耗竭、免疫微环境重塑以及免疫逃逸11<....

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方案

小鼠饲养于无病原体环境中，并根据机构动物护理和使用委员会的标准与规定进行管理。

1. 通过抗原特异性刺激生成和扩增CD8 T细胞

  1. 第一天，分离来自OT-I小鼠的脾细胞；随后进行制备与激活 体外 与SIINFEKL（4）肽。
    1. 清洁超净台空间，准备试剂，并收集小鼠培养基。将小鼠培养基置于水浴或珠浴孵育器中预热。
      1. 在6孔板中，向一个孔加入7 mL小鼠培养基，再向另一个孔加入3 mL小鼠培养基。随后，将滤网插入含有7 mL培养基的孔中。
    2. 从动物房用转运笼将小鼠带入实验室，将小鼠转移至一个干净的空笼中，并放置好 CO2 顶部连接适配器。使用 CO2 最高流速达2.75。
      1. 仔细观察小鼠，留意任何痛苦的迹象。在最后一次呼吸后，至少继续观察1分钟，注意是否有呼吸或其他生命迹象。关闭CO₂气源。2 并采用颈椎脱位法作为安乐死的辅助方法。随后清洁工作台面、鼠笼及其他工作区域，将小鼠转移至解剖通风橱中。
    3. 从小鼠体内解剖出脾脏。
      1. 使用70%乙醇对解剖器械进行消毒，并将小鼠左侧朝下放置，喷洒小鼠左侧以消毒。
      2. 使用洁净的器械解剖....

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结果

糖酵解和氧化代谢能力可通过线粒体功能检测进行测量，该检测通过在特定时间点靶向电子传递链的组分来评估其能力（图2A）。可通过将不同的注射方案加载到传感器微孔板的加样口，以修改传统检测方法，从而评估T细胞受体（TCR）的急性刺激效应（图2B、C）。在解读结果之前，应针对不同细胞类型优化细胞数量和药物浓度。本文报告了已针对CD8 T细胞优化的实验条件（图3A、B），其中电子传递链抑制剂的浓度已优化，可用于测量初始态和效应态T细胞的代谢能力（图4A、B）。重要的是，该检测方法可进一步修改，用于研究由抗原特异性刺激或抗CD3/CD28刺激产生的效应CD8 T细胞在TCR刺激下的反应。我们还进一步分析了CD8 T细胞对生物活性脂质信号的响应，特别是溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）.......

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讨论

本文概述了一种评估初始态和效应态CD8 T细胞线粒体功能的实验方案。我们详细描述并比较了使用OT-I和C57BL/6小鼠制备抗原特异性及多克隆CD8 T细胞的方法。结果显示，尽管CD8 T细胞的激活方式和预处理方法不同，其代谢特征仍表现出相似的趋势。数据表明，与经抗CD3和抗CD28抗体刺激的C57BL/6野生型细胞相比，抗原特异性激活可产生代谢活性更高的OT-I CD8 T细胞。本文所述方案表明，线粒体功能检测（即线粒体应激测试）是一种极为敏感且可重复性良好的检测方法，可在多种不同条件和细胞类型下获得可靠结果。我们的研究结果及详细的实验流程进一步确立了该检测方法作为分析CD8 T细胞代谢和生物能量学基础技术的重要地位。

随着免疫疗法和各种细胞治疗的不断进步，T细胞靶向治疗的重要性也日益增加41。免疫疗法的应答及抗肿瘤免疫反应依赖于T细胞介导的代谢、钙信号传导以及由上游TCR激活引发的氧化通量42。最佳的CD8 T细胞反应需要代谢效率和代谢灵活性5

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披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

赫兹基金会、艾米·戴维斯基金会、摩尔家族基金会和海蒂·霍纳基金会提供了宝贵的支持，我们对此深表感谢。本研究还部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 RMT 提供的资助（AI052157、AI136534），JAT 则获得了赫兹研究生奖学金的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗霉素 ASigma-AldrichA8674
抗-CD28Biolegend102116
抗-CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher11456D
生物素标记抗-CD3Biolegend317320
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich108321-42-2
CD8a+ T细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-104-075
细胞筛（100 µm）CELL TREAT229485
乙二胺四乙酸Sigma-AldrichE8008
FicollSigma-Aldrich26873-85-8密度梯度介质 
FCCP（(4-(三氟甲氧基)苯基)碳酰肼二氰）Sigma-AldrichC2920
葡萄糖Sigma-AldrichG-6152
谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401正向选择柱
磁性细胞分离柱Miltenyi Biotec130-042-301
微孔板Agilent102601-100
寡霉素Sigma-Aldrich75351
丙酮酸Sigma-Aldrich113-24-6
重组 IL-2PeproTech200-02
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875
Seahorse 培养基Agilent103576-100
传感器微孔板Agilent102601-100
链霉亲和素Sigma-AldrichA9275
无菌6孔板CELL TREAT230601
无菌24孔板CELL TREAT229524
XF 校准液Agilent102601-100

参考文献

  1. Patsoukis, N., et al. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 6, 6692(2015).
  2. Scharping, N. E., et al.

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