方法文章

野生型阻断PCR联合Sanger测序法检测低频体细胞突变

DOI：

10.3791/65647

⸱

2024年8月23日

 ,  ,  , 
1Kindstar Global Technology Inc., 2Yongzhou Central Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了基于Sanger测序的低频突变检测方法在血管免疫母细胞性淋巴瘤中的应用，为将该方法应用于其他疾病提供了依据。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在肿瘤治疗后监测微小残留病（MRD）时，对检测下限的要求高于治疗过程中检测耐药突变和循环肿瘤细胞突变的要求。传统的Sanger测序法对野生型突变的检测灵敏度为5%–20%，因此其检测限无法满足相应需求。已有报道的克服该问题的野生型阻断技术包括阻断剂置换扩增（BDA）、不可延伸的锁核酸（LNA）、热点特异性探针（HSSP）等。这些技术利用特异性寡核苷酸序列阻断或识别野生型，再结合其他方法抑制野生型扩增，同时促进突变型扩增，具有高灵敏度、灵活性和操作便捷等特点。本实验方案采用BDA技术，即野生型阻断PCR联合Sanger测序法，优化RHOA G17V低频体细胞突变的检测，检测灵敏度可达0.5%，可为血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤的MRD监测提供依据。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微小残留病（MRD）是指在治疗后体内仍存在的少量癌细胞。由于数量极少，这些细胞不会引起任何明显的体征或症状。它们通常无法通过传统方法（如显微镜观察和/或血液中异常血清蛋白的追踪）检测到。MRD检测结果呈阳性表明体内存在残留的病变细胞；阴性结果则表示未检测到残留的病变细胞。癌症治疗后，体内残存的癌细胞可能重新被激活并开始增殖，从而导致疾病复发。检出MRD提示治疗可能未完全奏效，或治疗不彻底。治疗后出现MRD阳性结果的另一个原因可能是并非所有癌细胞都对治疗产生反应，或癌细胞对所用药物产生了耐药性1。

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）是一种来源于滤泡辅助性T细胞的外周T细胞淋巴瘤（PTCL）亚型2；它是外周T细胞淋巴瘤（PTCL）中最常见的类型，约占PTCL的15%–20%3它是一组影响淋巴系统的相关恶性肿瘤，其细胞来源为滤泡辅助性T细胞。根据2016年世界卫生组织（WHO）分类，该疾病被归类为血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。42022年，世界卫生组织（WHO）将其重新命名为滤泡辅助性T细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞型（nTFHL-AI），并与滤泡辅助性T细胞淋巴瘤，滤泡型（nTFHL-F）以及滤泡辅助性T细胞淋巴瘤，非特指型（nTFHL-NOS）共同归类为结节性滤泡辅助T细胞淋巴瘤（nTFHL）。此举旨在明确其重要的临床和免疫表型特征，以及相似的滤泡辅助性T细胞（TFH）基因表达谱和突变特征。在遗传学上，nTFHL-AI的特征是早期造血干细胞通过TET2和DNMT3A突变逐步获得体细胞突变，而 RHOA 和 IDH2 TFH 肿瘤细胞中也存在突变5多项研究已表明 RHOA G17V突变出现在50%–80%的AITL患者中6,7,8,9RHOA基因编码的RHOA蛋白通过与三磷酸鸟苷（GTP）结合而被激活，通过与二磷酸鸟苷（GDP）结合而失活。激活后，该蛋白可结合多种效应蛋白，并调控多种生物学过程。在生理条件下，RHOA介导T细胞的迁移与极性，参与胸腺细胞发育，并介导前T细胞受体（pre-TCR）信号通路的激活。10RHOA G17V 突变是一种功能缺失性突变，在淋巴瘤发病机制中起驱动作用11检测其低频突变有助于AITL的微小残留病监测。

Sanger 测序已作为检测已知和未知突变的金标准使用了 40 多年。然而，其检测限仅为 5%–20%，这限制了其在低频突变检测中的应用12,13。在 Sanger 测序中，通过用 BDA（一种野生型阻断技术）替代传统 PCR，可将检测灵敏度降低至 0.1%14。BDA 技术主要是在设计常规引物时，添加一条与突变型互补但存在错配的引物，使其与野生型竞争，从而实现突变型的扩增。引物设计的关键在于错配引物和末端修饰。同时，根据 DNA 的结构原理，两条引物之间的吉布斯自由能差应控制在 0.8 kcal/mol 至 5 kcal/mol 之间。该技术的另一个关键步骤是通过调节野生型引物与阻断引物的比例来抑制野生型的扩增14,15。

目前常见的低频体细胞突变检测技术包括基于PCR的等位基因特异性PCR（allele-specific polymerase chain reaction, ASPCR）、扩增阻遏突变系统PCR（amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR），后者利用阻遏性引物辅助进行SNP基因分型。通过针对突变和正常等位基因设计引物，可实现选择性扩增；以及数字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR），该方法基于水油乳液微滴技术实现数字PCR。16将样品分馏为20,000个液滴，对每个液滴中的模板分子进行PCR扩增，检测灵敏度为1 × 10⁻⁷-5；阻断剂置换扩增（blocker displacement amplification, BDA）也是一种基于PCR的稀有等位基因富集方法，可用于在高度多重的环境中准确检测和定量SNV和indel，检测下限可达0.01%的VAF；锁核酸技术（不可延伸锁核酸，locked nucleic acid, LNA）是一类高亲和力的RNA类似物，其核糖环被锁定在最适合沃森-克里克碱基配对的构象中；热点特异性探针（Hot-Spot-Specific Probe, HSSP）与目标引物序列重叠，包含单个突变，并在C3位置用C3间隔基进行修饰' 末端以防止通过qPCR扩增14,16,17,18当序列中存在突变时，HSSP 会竞争性地结合至目标突变位点，阻止引物与目标突变序列结合，从而抑制序列扩增；基于下一代测序（next-generation sequencing, NGS）的免疫球蛋白高通量测序（igHTS）癌症深度测序个性化谱型分析（Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing, CAAP-seq），是一种基于下一代测序的技术，用于定量检测癌细胞中的循环 DNA（灵敏度为 1 × 10⁻⁵）-4）等。其中，大多数方法基于PCR，只能检测少量突变位点，而基于NGS的方法可检测多个位点，但成本较高，且操作流程复杂14,16,17,18已有报道关于检测 RHOA 基于qPCR的G17V低频突变检测，但检测下限仅能达到约2%19。目前尚未见有关检测 RHOA 基于Sanger测序的RHOA G17V低频突变检测。本文展示了通过BDA技术（一种野生型阻断PCR联合Sanger测序的方法）提高检测灵敏度的效果，以优化RHOA G17V低频体细胞突变的检出，其检测灵敏度可达0.5%。附加数据用于 IDH2 和 JAK1 也一并提供。

本文提供了通过Sanger测序法检测RHOA G17V低频突变的详细实验方案，为基于Sanger测序平台开发更多低频突变检测方法提供了参考。该方法可用于检测和监测肿瘤中可能存在的耐药性突变及微小残留病灶。

方案

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本研究经永州市中心医院医学伦理审查委员会批准（批准号：2024022601）。所有参与者均签署了知情同意书。

1. 引物设计

  1. 常规引物设计：根据已报道的引物设计规则20进行引物设计，或使用NCBI Primer-BLAST工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）进行引物设计。针对RHOA G17V突变位点，所有常规引物设计所用的参考序列均为突变后的碱基序列。确保设计的反向扩增引物包含突变位点序列，且引物的退火温度约为60 °C。
  2. BDA引物设计
    1. 设计长度约为20-30个碱基对（bp）的野生型阻断引物，其中包含2-4个修饰碱基，修饰碱基由A和T组成。确保阻断引物与突变扩增引物之间有6-14 bp的重叠区域，用于与突变扩增引物竞争结合。
    2. 设计引物时，最终确定的突变扩增引物和野生型阻断引物的退火温度应设定在约60 °C，且两者之间的吉布斯自由能差值应为0.8-5 kcal/mol。具体计算规则请参考文献15。
      注意：当设计的引物不满足上述条件时，可手动增减碱基进行调整。最终设计的引物列表见表1和表2。

2. 样品制备与DNA提取

注意：实验验证样本均来源于人类淋巴瘤患者的外周血、骨髓或实体瘤样本。共有10个阳性样本：其中3个为实体瘤样本，4个为骨髓样本，3个为外周血样本。另有30个来自健康人群的阴性样本。

  1. 骨髓和外周血样本的提取
    1. 根据要求将400 µL骨髓或外周血样本及试剂加入相应的试管中，并按照制造商的提取步骤进行提取。
    2. 准备新的样本管和1.5 mL微量离心管。将样本管编号为1-24。按照相应采血管上的名称顺序，在1.5 mL管盖上标记样本名称和提取日期。在微量离心管侧面标记1-24，以便进行一对一核对。
    3. 向样本管中加入40 µL蛋白酶K溶液，并加入400 µL全血样本（若体积小于400 µL，用PBS补足至400 µL）。
    4. 将样本管（1-24）、移液器吸头（包括吸头盖）和收集管放置在相应位置。按照制造商的操作程序提取DNA。
  2. 福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的提取
    1. 根据要求将样本和试剂加入相应的试管中，并按照制造商的提取步骤进行提取。
    2. 向蛋白酶K干粉中加入1.1 mL蛋白酶K储存缓冲液（PK溶液），涡旋振荡并充分混匀，得到浓度为10 mg/mL的蛋白酶K溶液。于-20 °C保存。
    3. 取出蛋白酶K溶液，在室温下完全融化。启动干式恒温仪，并将温度设定为55 °C。
    4. 取一个1.5 mL微量离心管并在其上标注样本名称。取少于30 mg的组织放入该微量离心管中。然后向管中加入500 µL脱蜡缓冲液和20 µL蛋白酶K溶液。
    5. 涡旋混匀至少10秒后，将微量离心管放入干式恒温仪中，在55 °C保温90分钟。
    6. 确保离心柱能正确放入滤管中。孵育完成后，将样本（包括液体和组织）转移至离心柱中。在16,500 x g条件下离心5分钟，使所有液体进入滤管。
    7. 取试剂盒中提供的一个样本管（无盖），并在其上标注样本名称。将滤管中的400 µL液体转移至该样本管中。
    8. 完成样本预处理和准备工作后，将相应的耗材和试剂放置在指定位置，并按照制造商说明书进行DNA提取。
  3. DNA质量控制
    1. 测定所提取DNA的浓度和纯度，确保DNA浓度≥25 ng/µL。记录每个样本的DNA浓度，并立即用于后续检测或在-20 °C冷冻保存。
      注：通常使用OD260/OD280值来检测DNA样本的纯度。正常的OD260/OD280值约为1.7–1.9，表明DNA纯度良好；若OD260/OD280值≤1.7，提示可能存在蛋白质污染；若OD260/OD280值≥2.0，提示可能存在RNA污染或DNA已降解。

3. PCR 扩增

  1. 引物的制备
    1. 引物储备液的制备
      1. 取出引物干粉，以 5400–8400 × g 离心 2–3 分钟。查看引物的 nmol 值，缓慢打开管盖。使用移液器吸取与引物 nmol 值相对应的双蒸水（ddH2O）体积（为 nmol 值的 10 倍），沿引物管管壁缓慢加入。
      2. 将引物配制成 0.1 nM/µL 或 100 µM 的储备液（例如，若引物的 nmol 值为 21.1，则需加入 211 µL 水）。充分涡旋混匀，短暂离心以确保溶液沉至管底。在管盖上标注引物名称、配制日期及配制人，并将其放入相应的储备液储存位置。
    2. 引物工作液的制备
      1. 在洁净的微量离心管中，加入 5 µL 正向引物、5 µL 反向引物、50 µL 野生型引物储备液和 40 µL ddH2O。重复移液 2–3 次，涡旋混匀后立即离心。
      2. 在管盖上标注引物名称、配制日期及配制人，并将该管放入引物工作液相应的储存位置。
  2. PCR 扩增程序
    1. 每反应体系中加入 5 µL PCR 扩增酶预混液、1 µL 引物工作液、1 µL DNA 模板（模板投入量需达到 400 ng；若 DNA 浓度不足，可增加 DNA 体积并相应减少 ddH2O 的加入量）以及 3 µL ddH2O。涡旋混匀后立即离心。
    2. 将 PCR 反应管放入预设好的 PCR 仪中进行扩增。设定 PCR 仪的热循环程序如下并运行：
      ​95 °C 预变性 3 分钟；进行 20 个循环：95 °C 变性 30 秒，68 °C 退火 15 秒（每个循环降低 0.5 °C），72 °C 延伸 1 分钟；再进行 16 个循环：95 °C 变性 30 秒，58 °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 1 分钟；最后 72 °C 延伸 10 分钟。
  3. 对 PCR 产物进行 2% 琼脂糖凝胶电泳，检测目标片段是否成功扩增。
  4. PCR 产物的纯化
    1. 将纯化酶 I 和纯化酶 II 恢复至室温，并立即离心。按以下组分配制 PCR 产物纯化反应体系：1 µL 纯化酶 I、0.5 µL 纯化酶 II、3 µL PCR 产物和 3.5 µL ddH2O。
    2. 将 PCR 反应管放入预设好的 PCR 仪中进行反应。设定 PCR 仪的热循环程序如下并运行：
      37 °C 反应 30 分钟，95 °C 灭活 15 分钟。

4. 纯化后PCR产物的测序

  1. 测序
    1. 将测序扩增酶预混液、缓冲液和ddH2O置于室温。试剂完全融化后，立即离心。
    2. 按以下组分配制测序反应体系：1.8 µL测序缓冲液、0.4 µL测序扩增酶预混液、1 µL测序引物、0.8 µL纯化的PCR产物和6 µL ddH2O。
    3. 将PCR反应管放入预设好的PCR仪中进行PCR扩增。设定PCR仪的热循环程序如下并运行：96 °C 3分钟；28个循环：96 °C 25秒，56 °C 15秒，60 °C 4分钟。
    4. 测序反应结束后，从PCR仪中取出产物，避光保存于冰箱中。
  2. 测序产物的纯化
    1. 充分涡旋混匀磁珠。向96孔板中加入10 µL磁珠和40 µL 80%乙醇，并用封口膜密封。
    2. 将含有磁珠和乙醇的96孔板置于涡旋振荡器上振荡10秒，使磁珠充分悬浮并混匀（观察底部是否有磁珠沉淀，注意避免液体接触封口膜）。然后将其置于水平摇床上，用橡皮筋固定，以最大档速振荡3-5分钟。
    3. 振荡结束后，将PCR板置于磁力架上，注意压紧。在4 °C静置吸附3分钟，待磁珠完全吸附至管壁后，移除封口膜并倾倒废液。
    4. 向PCR板中加入40 µL 80%乙醇，冲洗磁珠后倾倒废液。将板放在吸水纸上轻轻拍打（切勿使PCR板脱离底座）。重复此步骤一次。
    5. 将吸水纸连同磁力板一起倒置放入离心机，在120 x g条件下瞬时离心。
    6. 将去除乙醇后含磁珠的PCR板放入60 °C烘箱中干燥3-5分钟，确保磁珠完全干燥。
      注：若无烘箱，可将板在室温下放置10分钟。
    7. 干燥后加入40 µL纯水。盖上封口膜，在涡旋振荡器上振荡3-5秒。将板置于水平摇床上牢固固定，振荡3-5分钟，以充分溶解纯化的测序产物。
    8. 将溶解后的测序产物在180 x g条件下离心，所得产物用于毛细管电泳21进行基因组分析（注意需将配套底座加入样品板中）。
  3. 测序结果分析
    1. 从软件中获取测序结果。详细操作步骤请参考软件使用手册。使用NCBI提供的参考序列进行比对分析。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将测试样本的序列与参考序列进行比对，以确定测试样本的突变状态。基于BDA的WBT-PCR技术能够检测上下游引物扩增区间内的已知RHOA G17V突变以及其他低频突变。见图1。本方法还用于分析另外两个基因IDH2和JAK1，分别见图2和图3。结果表明，该方法在检测低频突变方面具有很高的灵敏度。

DNA测序色谱图；传统PCR与WBT-PCR在RHOA突变检测中的比较。
图1：RHOA的测序结果。 从上至下，该图显示了通过WBT-PCR扩增的RHOA G17位点的碱基突变，以及对应野生型RHOA G17经传统PCR扩增后的测序结果。中间图片展示了在检测灵敏度为0.5%时，使用WBT-PCR引物扩增后c.50G>T突变的测序结果。底部图片展示了在检测灵敏度为0.5%时，使用WBT-PCR引物扩增后c.49-50delinsTT突变的测序结果。 请点击此处查看此图的放大版本。

WBT-PCR 与传统 PCR 色谱图比较，IDH2 基因 c.515G>A 突变检测。
图 2：IDH2 测序结果。 从上至下，上图显示了通过 WBT-PCR 扩增的 IDH2 R172 位点的碱基突变，以及对应野生型 IDH2 R172 经传统 PCR 扩增后的测序结果。顶部图像显示了使用 WBT-PCR 引物扩增后，在检测灵敏度为 0.5% 时 c.515G>A 突变的测序结果。请点击此处查看此图的放大版本。

DNA测序比较，WBT-PCR与传统PCR在JAK1突变分析中的对比图。
图3：JAK1的测序结果。从上到下，上图显示了通过WBT-PCR扩增的JAK1 S703位点的碱基突变，以及对应于野生型JAK1 S703的传统PCR扩增后的测序结果。顶部图像显示了在检测灵敏度为0.5%时，使用WBT-PCR引物扩增后c.2108G>T突变的测序结果。请点击此处查看该图的放大版本。

引物引物序列
RHOA-VFATAACCTTTTGGTGCCAGGT
RHOA-VRGCTGAAGACTATGAGCAAGCA
RHOA-WTBAGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA
测序引物ATAACCTTTTGGTGCCAGGT

表1：RHOA 最终设计的引物列表。

IDH2 R172 引物
引物引物序列
IDH2-VFCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VRTACCTGGTCGCCATGGGC
IDH2-WTBGCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
测序引物CTGGTTGAAAGATGGCGGCT
JAK1 基因引物
引物引物序列
JAK1-VFACTCTGAGGCCGAGTAGTGT
JAK1-VRCCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTBGGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA
测序引物ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT

表2：IDH2 和 JAK1 的最终设计引物列表。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于BDA技术的WTB-PCR方法在本文中被描述，该方法在设计常规引物时引入一个与突变型互补的错配引物，以与野生型竞争、抑制野生型并扩增突变产物。随后对WTB-PCR产物进行测序以进行突变分析。WTB-PCR/Sanger法的优势在于其操作简便且灵敏度高。根据本文建立的检测方案，大多数现有的基于Sanger测序的检测方法均可通过BDA技术添加抑制性引物，从而提高检测灵敏度。本文中所介绍的RHOA G17V突变，是在基于BDA技术的WTB-PCR扩增后通过Sanger测序完成的。当DNA输入量达到400 ng时，检测灵敏度可达到0.5%，甚至0.1%。不同基因的检测灵敏度需根据DNA输入量、基因序列等因素进一步确认。

WTB-PCR 的关键在于引物设计，该技术仅能检测已知突变。本文描述了该技术在 Sanger 测序中的应用。该技术还可应用于高通量测序、定量 PCR 等，并可用于多重 PCR 检测。WTB-PCR 可降低这些检测方法的检测下限，更适用于微小残留病（MRD）监测。大多数基于 PCR 的方法只能检测少量突变位点，而基于高通量测序（NGS）的方法虽可检测多个位点，但成本较高且流程复杂14,15,16,17,18。WTB-PCR 具有高灵敏度、低成本和强灵活性的特点，是低频突变检测的理想选择，可显著提高 Sanger 测序在 MRD 检测中的灵敏度和应用价值。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了康圣环球医学检验所有限公司以及分子生物学实验室领导和相关同事的帮助与支持。感谢公司、领导及相关同事给予的支持与帮助。本文仅用于科学研究，不构成任何商业活动。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动DNA提取仪9001301Qiagen
DNA核酸检测仪Q32854Thermo fisher
PCR扩增试剂盒P4600merck
PCR仪C1000 TouchBiorad
蛋白酶K溶液D3001-2-Azymo research
蛋白酶K储存缓冲液D3001-2-Czymo research
测序扩增酶试剂盒P7670-FINQiagen

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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标签

DNA

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