小鼠或幼年大鼠的批量电针操作

摘要

本文介绍一种利用三维（3D）打印固定装置在小鼠或幼年大鼠中进行高效、快速电针刺激（EA）的实验方案。该技术可同时对多只动物进行操作，节省时间并提高实验效率。

摘要

电针（EA）被广泛用于治疗多种健康状况。然而，电针治疗的潜在机制尚不明确，这阻碍了其推广应用。机制研究需要借助小鼠或大鼠模型来解决这一问题。然而，这些动物在实验过程中并不顺从，导致实验耗时较长。为解决这些问题，我们设计了一种3D打印的小动物躯体固定装置，以提高电针动物实验的效率。本视频详细展示了如何使用该固定装置对小鼠或幼年大鼠进行批量电针操作。在穴位选择方面，选用了顶颞前斜线（MS6 头部）和天枢穴（ST25 腹部），以验证该固定装置在俯卧位和仰卧位下的适用效果。使用3D打印的小动物固定器可同时对多只啮齿类动物进行固定和处理，显著减少实验所需的时间和资源。该技术可通过3D打印不同尺寸的装置应用于其他动物模型，并有望适用于多种固定条件。该装置有利于推动电针领域实验科学研究的发展。

引言

电针（EA）疗法是一种独特的方法，即将针灸针插入头皮并连接到电刺激仪，以刺激特定穴位¹。与手动刺激不同，电针可通过稳定特定频率和波形，实现对刺激参数的更好控制，从而获得最佳治疗效果²。根据一项调查，中国有81.2%的医疗机构使用电针或手工针灸治疗脑性瘫痪、神经痛、面瘫等疾病。尽管电针应用广泛，但其疗效的具体作用机制仍不明确，这在一定程度上阻碍了其在神经系统疾病康复治疗中的推广和应用^1,2,3。未来仍需进一步研究，以全面阐明电针发挥作用的机制，并推动其在神经系统疾病康复治疗中的应用。

随着针灸的影响在全球范围内不断扩大，许多研究已经探讨了在啮齿类动物模型（如大鼠或小鼠模型）上进行电针（EA）的作用机制^1,2,3。在电针的啮齿类动物实验中常遇到一些问题。首先是如何在不使用麻醉的情况下固定动物，因为在清醒状态下进行针灸更能反映临床实践情况。此外，某些实验需要动物保持清醒状态以观察治疗效果^2,3。另一个挑战是准确定位小鼠或大鼠身上与人类相对应的穴位。目前，许多学者正在研究实验用啮齿类动物穴位的精确定位方法^4,5。在本实验方案中，选择了MS6和ST25两个穴位，这两个穴位已通过人体解剖定位的转化在啮齿类动物中被明确定义。MS6常用于治疗某些脑部疾病，如帕金森病⁶；ST25通常用于治疗胃肠道问题，如腹泻⁷。选择这两个穴位主要是为了展示如何在仰卧位和俯卧位下有效地固定啮齿类动物。此外，这两个穴位已被广泛研究，在科研中具有重要的参考价值^6,7。

先前用于实验的单只大鼠固定方法不仅耗时，而且难以由单人操作⁸。此外，由于动物不配合，实际操作中的成功率相对较低。因此，迫切需要建立一种易于制备且具有稳定特征的动物模型，以提高实验效率。本文介绍了一种3D打印的小动物固定装置，可方便地同时固定多只啮齿类动物，实现运动限制。本研究的目的是对一批年轻大鼠或小鼠进行电针（EA）治疗，重点探讨小鼠批量固定策略、个体识别以及MS6和ST25穴位的定位与刺激方法。

方案

本研究中的实验遵循动物伦理的"3Rs"原则，并已获得陆军军医大学实验动物福利与伦理委员会（AMUWEC20234543）的批准。

1. 啮齿类动物体固定装置的制备

1. 基于中国实用新型专利⁹设计一种小型动物固定装置。
2. 通过3D打印技术制造该装置。
3. 准备一根2米长的绳子，并将其分成6根。将这6根绳子穿过固定器上的孔洞。利用弹簧扣固定绳子末端，便于调节绳圈大小。
   ​注：该固定器可根据设计图纸由任何具备3D打印技术的公司制造。装置的设计图纸见图1。本研究中使用的固定器采用熔融沉积成型（FDM）方法，也称为熔丝制造（FFF）¹⁰，通过3D打印机制造而成。这种增材制造技术通过在预设路径上逐层选择性地沉积熔融状态的材料来打印设计部件。该工艺使用线材形式的热塑性聚合物来构建最终的物理结构。本研究中使用的固定装置可同时固定三只动物，因此需要六根绳子，每只动物使用一对绳子：一根用于颈部，一根用于躯干。

2. 实验动物的准备

1. 购买3只Sprague-Dawley大鼠（10-40 g，7-45日龄）和3只C57 BL/C小鼠（5-40 g）。
2. 将动物饲养在具有12小时昼夜循环、环境温度21-23 °C、湿度45%-60%的房间内。定期对饲养环境进行消毒和通风，并允许动物自由进食和饮水。

3. 将啮齿类动物固定在固定器上（俯卧位）

1. 将啮齿类动物的头部置于固定器前方的U形孔中，动物呈俯卧位。将动物身体穿过两个绳圈。
2. 用绳子绑住啮齿类动物的颈部和腹部，确保其无法逃脱，但不可过紧，以免引起呼吸困难甚至死亡。
   1. 关键步骤是固定颈部。在啮齿类动物颈部与绳子之间留出2-5 mm的间隙。确保绳子既不会过紧导致动物窒息，也不会过松导致其逃脱。
3. 以相同方式将其他啮齿类动物固定在装置中。
4. 重复上述固定步骤（3.1-3.2）共3天，以尽量减少固定操作可能引发的应激反应。连续3天每天进行一次固定，每次持续5分钟。
   注意：为确保啮齿类动物在固定过程中不过度应激，我们连续3天重复该操作。每天每次持续5分钟，使小鼠或大鼠有充足时间适应该操作，从而最大程度减少潜在不适。
5. 从第4天开始进行EA处理。
6. 为防止疾病传播，使用无菌棉签或棉球蘸取75%酒精，在每次使用前后彻底擦拭固定装置，以清洁和消毒。操作啮齿类动物时应佩戴手套及其他防护装备，避免潜在的健康风险。

在小鼠或幼年大鼠中进行EA（MS6）

1. 选用0.25 mm × 13 mm的一次性无菌针灸针。
2. 根据解剖位置确定穴位，并确认该穴位的进针深度。
   注：MS6位于头部外侧。该区域在头部分布于神聪（Ex-hn1）与悬厘（GB6）之间的连线上，又称顶旁线（Du21）。MS6对应大脑皮层中央前回在头皮的投射区域。Ex-hn1位于头前后正中线中点后方0.5 cm处；GB6位于耳前缘中点与外眼角端点的连线中点。该区域分布有眶上神经、滑车上神经、枕神经及耳颞神经。MS6主要用于治疗中风及脑病，如运动功能障碍。
3. 分别在3只啮齿类动物双侧MS6穴位处，沿皮下缓慢捻转进针，进针深度为从前方神聪（Ex-hn1）至悬厘（GB6）距离的3/5。
4. 将连接线的一端连接至电针仪。
5. 将连接线的另一端（含正负电针夹）分别连接至左右两侧MS6穴位上的针柄。
6. 打开电针仪。
   1. 旋转按钮（功能/选择开关），设置频率和工作模式。
   2. 将频率设置为10 Hz，并选择连续波模式。
   3. 旋转相应的按钮（调节强度）以设定刺激强度。每个强度调节按钮控制其下方所连接导线对应啮齿动物的电流强度。将电流强度调节至动物可耐受的范围，通常为1–2 mA，持续5分钟。
      ​注：在操作过程中，必须密切监测啮齿动物的呼吸和行为，确保其未出现痛苦或不适。若大鼠表现出挣扎或疼痛迹象，应立即停止操作。

5. 将啮齿类动物固定在固定器上（仰卧位）

1. 将啮齿类动物置于固定器前方的U形孔中，动物呈俯卧位。将动物的身体穿过两个绳环。
2. 用绳子绑紧啮齿类动物的颈部和腹部，确保其无法逃脱，但不可过紧，以免引起呼吸困难甚至死亡。
   注意：固定过程中需注意的事项与步骤3.2相同。
3. 以相同方式固定其他啮齿类动物。
4. 同步骤3.4，重复上述固定步骤3天，以减少啮齿类动物的应激反应。
5. 从第4天开始进行Strat EA处理。
   ​注意：消毒操作按步骤3.6所述进行。

6. 进行EA（ST25）

1. 选用0.25 mm × 13 mm的一次性无菌针灸针。
2. 根据解剖位置确定穴位，并确认该穴位的进针深度。
   注：ST25位于脐部水平。在啮齿类动物中定位该穴位时，需先测量其足掌长度。ST25位于足掌长度的2/3处，紧邻脐部两侧。例如，若测得啮齿类动物足掌长度为0.6 cm，则ST25位于脐部左右两侧各0.4 cm处。
3. 将无菌针缓慢捻入3只啮齿类动物双侧ST25穴位，进针深度为4–8 mm。
4. 将连接线的一端接至电针仪。
5. 将连接线的另一端（含正负电针夹）分别连接至左右两侧ST25穴位的针柄上。
6. 打开电针仪。
   1. 旋转按钮（功能/选择开关），设置频率和功能模式。
   2. 将频率设为10 Hz，并选择连续波模式。
   3. 旋转相应的按钮（调节强度）以设置刺激强度。每个强度调节按钮控制其下方导线所连接大鼠的电流强度。将电流强度调节至啮齿类动物可耐受的范围，通常为1–2 mA，持续5分钟。
      注：观察结果与步骤4.6相同。

结果

我们设计的动物体固定器的平面图如图所示 图1此外，已提交该固定器的三维图形模型，以全面展示其设计结构。补充文件 1）。这是一种可同时固定3只啮齿类动物并进行电针（EA）操作的装置。大鼠和小鼠在清醒状态下被固定于该固定器中，俯卧位和仰卧位均可牢固固定，且不会对动物造成损伤。图2 和 图3）。在固定器的帮助下，成功定位并针刺了啮齿类动物的MS6和ST25穴位（图4 和 图5).

为控制变量并验证该固定方法的有效性，一名实验人员在一项比较研究中对3只大鼠（视频1）或3只小鼠连续进行了三次固定操作（表1）。结果显示，使用该工具固定3只大鼠，在俯卧位和仰卧位的平均...

讨论

电针（EA）是一种针灸形式，通过在针灸针上施加电刺激来发挥作用¹¹。该技术利用特定强度和频率的微脉冲电流刺激穴位，以获得增强的治疗效果³。然而，电针对促进愈合的作用机制尚不明确，仍需大量基础研究加以验证^1,2,3。啮齿类动物模型常用于基础电针研究^8,12,13，本文旨在提供一种在大鼠和小鼠中快速高效开展此类实验的方法。

目前，电针实验面临诸多挑战。首要挑战是如何在不使用麻醉的情况下有效固定啮齿类动物。动物的稳定固定至关重要，对动物实验的结果具有显著影响。否则，麻醉状态下动物的生理功能与清醒状态下的动物存在差异，而临床针...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D打印批量小鼠固定器	MESH INVENT	定制	由3D打印机生产的固定器。打印方法称为熔融沉积成型（FDM），也称为熔丝制造（FFF）。
电针仪	华佗，苏州医疗用品厂	SDZ-III	www.Hwato-med.com
一次性无菌针灸针	苏州医疗用品厂	无	0.25 mm x 13 mm