本方案旨在详细阐述如何制备低含水量硬质种子样品切片，用于基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）分析，在保持分析物原始分布和丰度的同时，提供高质量的信号和空间分辨率。
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方法文章
硬质油棕种子用于基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析的制备
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）可用于在原始环境中鉴定化合物。目前，MALDI-IMS 已广泛应用于临床分析。然而，该技术在植物组织中用于解析化学化合物生理信息方面仍具有广阔的应用前景。但是，由于 MALDI-IMS 需要制备薄切片（12–20 µm）以实现有效的数据采集和成功分析，因此从植物材料中制备特定样品可能具有挑战性。为此，我们此前已建立了一种样品制备方案，用于获得巴西莓棕榈（Euterpe oleracea）硬种子的薄切片，从而实现其分子分布的 MALDI-IMS 成像分析。
在此，我们证明所开发的方案适用于制备同属其他种子的样品。简言之，该方案基于将种子浸入去离子水中24小时，用明胶包埋样品，并在恒温冷冻切片机中进行切片。随后，在基质沉积过程中，将一个XY运动平台与电喷雾电离 使用含0.1%三氟乙酸的1:1（v/v）2,5-二羟基苯甲酸（DHB）甲醇溶液（30 mg/mL）进行电喷雾电离（ESI）针尖喷雾。 E. precatoria 和 E. edulis 使用软件对种子数据进行处理，以绘制其代谢物图谱。
在样品切片中对己糖寡聚物进行了成像，以验证该方案对这些样品的适用性，因为已知这些种子含有大量甘露聚糖，即由己糖甘露糖组成的聚合物。结果鉴定出己糖寡聚物的峰，表现为[M + K]+加合物（Δ = 162 Da）。因此，先前为刺葵（E. oleracea）种子专门开发的样品制备方案，同样适用于另外两种坚硬棕榈种子的基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-IMS）分析。简而言之，该方法可成为植物材料形态解剖学和生理学研究的有力工具，尤其适用于抗切割样品的研究。
引言
基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）是一种强大的方法，可实现生物分子的二维定位，对可电离化合物进行非靶向分析，并确定其空间分布，尤其适用于生物样品1,2。二十多年来，该技术已实现对脂质、肽段、碳水化合物、蛋白质、其他代谢物以及合成分子（如治疗药物）的同时检测与鉴定3,4。MALDI-IMS 能够在无需提取、纯化、分离或使用标记与染色试剂的情况下，对组织样品表面进行化学分析。然而，要实现成功的分析，该技术中的一个关键步骤是样品制备，尤其是在植物组织中，由于适应环境而演化出结构复杂的多种特化器官，使得样品制备更具挑战性5。
由于植物组织固有的理化特性，在制备切片时需要采用经过优化的实验方案，以满足MALDI-IMS分析的要求，并保持组织的原始形态6,7。对于种子等非常规样品，已建立的实验方案8并不适用，因为这些组织具有坚硬的细胞壁和较低的含水量，容易导致切片破碎，进而引起化合物的移位9....
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方案
Euterpe precatoria 种子由巴西亚马孙国家研究所（Manaus，巴西）慷慨提供，Euterpe edulis 种子由巴西Resende市的Silo - Arte e Latitude Rural在工业脱果肉过程后慷慨提供。种子在室温下保存于密封的塑料盒中。
1. 基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）
- 种子切片方案
- 将每个物种的三粒种子置于去离子水中浸泡 24 小时。
- 次日，开启冷冻切片机（见材料表），并使其温度降至 -20 °C。
- 将吸水后的种子从水中取出，使用切片刀（见材料表）将种子切成两半。
- 配制新鲜的温热（10%）明胶溶液（见材料表）。
- 将半粒种子置于模具中，并用新配制的明胶填充，于 -80 °C 冷冻 2 小时，随后转移至冷冻切片机中。
- 使用最佳切割温度包埋剂（OCT，见材料表）将包埋好的种子固定在冷冻切片机的样品台上，在冷冻切片机内静置 10 分钟，使 OCT 固化。
- 在镀有氧化铟锡的载玻片（ITO 载玻片；见材料表）上....
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结果
所设计的方案实现了MALDI-IMS分析 E. precatoria 和 E. edulis 种子。因此，我们能够通过分子量和聚合度（DP）确认碳水化合物的部分结构。MALDI-IMS 分析提供的分子信息（图1 和 图2) 出现了代表[M+K]的峰+ 六碳糖寡聚物加合物（Δ = 162 Da），无需向基质中添加盐。六碳糖二聚体（m/z 381），三聚体（m/z 543），四聚体（m/z 705）、五聚体（pentamers）（m/z 867），六聚体（m/z 1029）以及最多达14个单元的寡聚体（m/z 2325）在两种种子组织中均被鉴定出。两个样本的箱线图（图3) 表示在种子胚乳中检测到的每种己糖寡糖的峰强度，展示了它们的分布情况以及高聚合度（DP）寡糖含量略.......
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讨论
植物由具有特定生化功能的特化组织构成。因此，基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）的样品制备方案必须根据具有不同理化特性的各类植物组织进行设计，因为样品需保持其原始分析物的分布和丰度，以获得高质量的信号和空间分辨率8。
在进行MALDI-IMS分析之前，首要考虑的是正确采集和储存样品。然而，在植物中，样品制备方法通常因所分析的组织类型而异。例如，植物组织中的细胞壁木质化程度和含水量可能在切片过程中带来挑战，从而难以准确保持样品形态的真实再现7。
基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）分析可分为组织制备与切片、基质包被以及数据分析的工作流程。然而，成像结果的质量和真实性直接受到样本制备方法的影响，因此样本制备是一个至关重要的步骤。本研究中所采用的样本制备方法基于先前发表的关于 E. oleracea 成熟种子的实验方案10。为了验证该切片方案在其.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由塞拉皮尔海拉研究所（Serra-1708-15009）以及里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021）资助。塞拉皮尔海拉研究所和国家科学技术发展委员会（CNPq）为 Felipe Lopes Brum 博士和 Gabriel R. Martins 博士提供了奖学金（机构能力建设计划/INT/MCTI）。研究生协调提升局（CAPES）为 Davi M. M. C. da Silva 先生提供了硕士奖学金，特此致谢。里约热内卢联邦大学生物分子质谱中心（CEMBIO-UFRJ）提供了 MALDI-IMS 分析服务，在此表示感谢；同时感谢 Alan Menezes do Nascimento 先生以及由 MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ 项目资助编号为 442604/2019 的纳米技术材料与催化表征中心（CENANO-INT）提供的元素组成分析。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 气密注射器型号 1001 TLL，PTFE 鲁尔锁 | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-二羟基苯甲酸 | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI 针头 | Bruker Daltonik, Bremen, 德国 | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy 运动平台 | Evil Mad Scientist, CA, 美国 | 2510 | |
| 双面碳导电胶带 | |||
| Compass 数据分析软件 | 质谱列表生成 | ||
| 压缩空气 | |||
| 双面铜导电胶带 | 3M, 美国 | 1182-3/4"X18YD | |
| 冷冻切片机 CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, 德国 | ||
| 金刚石切片刀片 15 HC | |||
| Everhart-Thornley 检测器 | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, 德国 | 图像采集 | |
| FTMS 数据处理 | Bruker Daltonik, Bremen, 德国 | 数据校准 | |
| 牛皮明胶 | Sigma Aldrich Co, MO, 美国 | G9391 | |
| Leica 818 高剖面切片刀 | Leica Biosystems, Nussloch, 德国 | 0358 38926 | |
| 氧化铟锡涂层玻璃载玻片 | Bruker Daltonik, Bremen, 德国 | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, 美国 | ||
| IsoMet 1000 精密切割机 | Buehler, Illinois, 美国 | ||
| 甲醇 | J.T.Baker | 9093-03 | |
| 超纯水（Milli-Q 水） | 18.2 MΩ.cm | ||
| 油封真空泵 | |||
| 最佳切割温度包埋剂（Optimal Cutting Temperature Compound） | Fisher HealthCare, Texas, 美国 | 4585 | |
| Parafilm "M" 密封膜 | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, 美国 | ||
| SCiLS Lab（多厂商支持）质谱软件 | Bruker Daltonik, Bremen, 德国 | ||
| INCA Suite 4.14 V 软件 | Oxford Instruments, Abingdon, 英国 | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, 德国 | ||
| 注射泵 | kdScientific, MA, 美国 | 78-9100K | |
| 三氟乙酸 | Sigma Aldrich Co, MO, 美国 | 302031 | |
| X-Max 能谱仪 | Oxford Instruments, Abingdon, 英国 |
参考文献
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry<....
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