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方法文章

一种用于珊瑚生长与监测的集成微装置系统

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DOI：

10.3791/65651

⸱

2023年7月21日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Digital Medical Engineering, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 2Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, University of Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

本方案描述了一种模块化可控微装置系统的开发，该系统可用于海珊瑚的长期培养与监测。

摘要

珊瑚是海洋和沿海生态系统中的基础生物。近年来，随着珊瑚保护研究的不断推进，对珊瑚培养环境进行精确控制的需求日益增长。本文中，我们开发了一种半封闭式珊瑚培养微型装置系统，作为一种多功能平台，可为珊瑚提供精确且可编程的温度控制、无菌的初始环境、长期稳定的水质、可调节的溶解氧浓度以及可定制的光谱条件。得益于模块化设计，该珊瑚培养系统可通过安装所需的新模块或移除现有模块进行升级或改造。目前，在适当条件下并配合系统的合理维护，样品珊瑚可在健康状态下存活至少30天。此外，由于具备可控且无菌的初始环境，该珊瑚培养系统可支持珊瑚与其相关微生物之间共生关系的研究。因此，该微型装置系统可用于对海洋珊瑚进行相对定量的监测与研究。

引言

在过去70年中，全球范围内的珊瑚礁生态系统持续退化。综合中美洲1、东南亚2,3,4,5,6、澳大利亚7,8和东非9所有主要珊瑚分布区域的数据，自20世纪50年代以来，全球珊瑚礁覆盖面积已减少一半10。珊瑚礁的大规模丧失已引发严重的生态与经济问题。例如，研究人员通过对各类依赖珊瑚生存的鱼类存在与否及其丰度进行为期8年的追踪，得出结论：巴布亚新几内亚的珊瑚衰退已直接导致鱼类生物多样性和丰度显著下降11。该结果证明，珊瑚衰退不仅会破坏以珊瑚礁为基础的生物系统，还会降低渔业收入。

数十年来的野外调查，包括直接监测、遥感观测和数据对比，科学界已确定了导致珊瑚大规模衰退的多个因素。其中一个重要原因是海水温度升高引发的珊瑚白化现象12,13。通过结合白化记录与气象数据，科学家得出结论：珊瑚白化在厄尔尼诺-南方涛动（El Niño-Southern Oscillation）期间发生得更加频繁14。另一个导致珊瑚衰退的原因是海洋酸化。由于大气和海水中CO2浓度升高，碳酸钙的溶解速度比以往更快，导致珊瑚礁净钙化速率下降15。事实上，已有研究指出，当大气中CO2浓度超过500 ppm时，数千万人将受到影响，珊瑚礁也将面临严重退化和虫黄藻脱离的风险16,17。此外，还有其他因素可能影响珊瑚的生存，例如近岸污染物会引发或加速珊瑚衰退。夏威夷的研究人员测量了珊瑚中的碳、氧和氮同位素，以及溶解的无机碳酸盐和相关营养物质（NH4+、PO43-、NO2−和NO3−），并得出结论：陆源污染加剧了近海酸化和珊瑚的生物侵蚀18。除污染外，城市化也威胁着珊瑚的生存，并导致珊瑚结构复杂性相对降低，这一点在对新加坡、雅加达、中国香港和冲绳珊瑚生存状况的研究中已得到证实。因此，人为压力因素与气候变化的叠加效应正导致珊瑚礁生物多样性的广泛下降，以及珊瑚生态功能和恢复力的相应衰退19。

还应注意，大量微生物参与了珊瑚的生理功能，包括固氮、几丁质分解、有机化合物的合成以及免疫反应20，因此在考虑珊瑚礁退化问题时，应将这些微生物纳入考量。在珊瑚礁等自然环境中，许多因素会导致缺氧或无氧条件，例如水体循环不足、藻类分泌物以及藻类过度生长。这种现象对珊瑚及其相关微生物的种群分布产生负面影响。例如，越南科学家发现，在芽庄、富国岛和Ujung Gelam等地，不同地点的溶解氧水平会影响珊瑚Acropora formosa体内的细菌组成21。美国研究人员探讨了珊瑚所处的缺氧或无氧条件，发现藻类分泌物可调节微生物活性，从而引发局部缺氧，可能导致邻近区域珊瑚死亡。他们还发现，珊瑚能够耐受较低的氧气浓度，但仅限于由暴露时间和氧气浓度共同决定的某一阈值以上22。印度研究人员发现，当Noctiluca scintillans藻类暴发性增殖时，溶解氧可下降至2 mg/L；当浓度低于此值时，约70%的Acropora montiporacan会因缺氧而死亡23。

上述所有事实和因素表明，环境变化导致了珊瑚礁的退化。为了在特定条件下培养和研究造礁珊瑚，准确而全面地构建一个可控的微观环境至关重要。通常，科学家关注温度、光照、水流和营养物质等因素，但海水中溶解氧浓度、微生物丰度和微生物多样性等其他特征常常被忽视。为此，我们课题组探索了利用小型设备在相对可控的环境中培养珊瑚息肉的可能性24,25。在本研究中，我们设计并构建了一套模块化的珊瑚培养微装置系统。该模块化微装置系统可在温度、光谱、溶解氧浓度、营养物质及微生物等方面提供可控的微环境，并具备扩展和升级能力。

设备的模块与功能
该微型设备系统的设计灵感来源于柏林系统26，但当前系统中未使用活石。如图1所示，当前系统包含六个主要模块、两个无刷电机泵、一个气体泵、一个流通式紫外灯、一个电源、若干电子控制组件以及相关的导线和螺丝。这六个主要模块分别为海水储存模块（配有气泵和温度传感器）、温度控制模块、藻类净化模块、微生物净化模块、活性炭净化模块和珊瑚培养模块。

装置结构
如图2和图3所示，整个微装置系统在水平方向上可分为两个区域，中间设有温度控制模块。出于安全考虑，所有含海水的模块和部件均置于左侧区域，称为培养区；其余电子部件则置于右侧区域，称为电子区。两个区域均被密封或封装在外壳内。温度控制模块固定在中间的隔板上。培养区的外壳包括一个底板和三个通过螺钉固定的侧板，该设计可确保区域的密封性，并有利于系统的操作，同时密封性也有助于实现精确的温度控制。电子区的外壳包括一个底板、两个通过螺钉固定的侧板以及一个前部控制面板。

海水循环
已预先设计连接至海水储存模块的内循环和外循环回路。内循环回路成功连接了海水储存模块、温度控制模块、流通式紫外灯、藻类净化模块和微生物净化模块。该循环回路旨在为珊瑚提供适宜的海水物理化学及生理条件，且无需频繁维护。藻类净化模块含有Chaetomorpha藻类，可吸收水中多余的营养物质（硝酸盐和磷酸盐）。微生物净化模块含有细菌培养基质，用于培养微生物组，将亚硝酸盐和铵转化为硝酸盐以实现水质净化。所有这些模块仅在极端情况下才需要更换。

外循环回路依次连接海水储存模块、珊瑚培养模块和活性炭模块。该循环回路旨在为珊瑚提供光照、密闭环境、水流以及高质量的海水。海水可通过进水口和出水口进行更新。通过三通阀添加添加剂，也可从此阀采集海水样品进行检测。空气可通过进气口泵入，并从出气口排出。

电子设计
整个系统采用带开关和保险丝的 220 V 交流电源供电。输入电源分为四个支路。第一路连接至 12 V 直流电源，直接为加热板、制冷板和散热风扇供电。该支路还通过一个四通道直流变压器间接为两个泵和两个照明面板供电。第二路连接至 PID 温度控制器。第三路连接至气泵电源。最后一路连接至紫外灯电源。在温度控制模块中，固态继电器连接 PID 温度控制器与制冷板，普通继电器连接 PID 温度控制器与加热板。四通道直流变压器将电压转换为各设备所需电压。

系统右侧有两个控制面板。上层面板上有四个开关和一个紫外灯控制器，包括主电源开关、紫外灯电源开关、气泵开关和温度控制开关。主电源开关控制系统的12 V电源供应。

前面板上设有PID温度控制器、循环定时器、四通道直流变压器和三通道定时器。PID温度控制器通过控制温度控制模块中的加热和冷却面板来调节水温。温度控制模块仅在内循环泵工作且水流经温度控制模块时才会运行。循环定时器连接至气泵电源线，用于设定气泵的工作时间段。电子舱内还配备了一个三通道定时器，该定时器用于控制气泵、珊瑚灯和藻类灯的工作时间段。

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方案

本研究所用的珊瑚为实验室培养的Seriatopora caliendrum。所有珊瑚均由中科院南海海洋研究所友情提供。

1. 检查与启动

注意：在组装系统之前，必须对每个模块单独进行密封性和功能测试。应使用去离子水测试模块的密封性。所有模块组件的商用信息详见材料表。

  1. 模块间连接的密封性测试
    1. 连接所有模块和泵（图1，并确保水流在系统中循环至少30分钟。
    2. 检查所有接缝是否存在可能的泄漏问题。若任何粘合接缝处发生泄漏，需从外部涂抹粘合胶。若任何连接接缝处发生泄漏，应再次拧紧连接，并检查密封垫圈是否需要更换。
  2. 加载中
    1. 紧度测试后，抽空并干燥内部水分。
    2. 加载适当的内容。
      注意：例如，将细菌培养基质加载到微生物纯化模块中， 刺松藻 将藻类装入藻类纯化模块中。
  3. 组装并测试整个系统
    1. 加载后，使用螺丝将模块固定在基板上。
    2. 将内循环模块与外循环模块连接（不包括珊瑚培养模块）。
    3. 对于海水循环，通过海水储存模块的进水口注入海水。当水位高于水泵进水口3 cm时，启动水泵，并继续注入海水，直至内部循环模块完全充满海水，同时海水储存模块内留有3 cm高的空气空间。
      注意：海水使用纯水和海盐配制（参见 材料表).
  4. 系统测试
    1. 打开所有开关，将两个海水泵的电压均设置为 9 V。将水温设置为 25 °C。
    2. 将循环计时器设置为 "开启1分钟，关闭1分钟"将三通道计时器的三个通道均设置为 "上午9:00" 和 "下午5:00 结束".
    3. 至少监测系统24小时，检查是否存在任何故障。若未发现异常，则系统已准备好进行下一步操作。
      ​注意：除海水储存模块外，所有模块中的气泡都必须排净。可将整个系统轻轻抬起并晃动，使气泡从模块入口移向出口。

2. 微生物环境的建立

注意：在珊瑚移植之前，必须建立一个对珊瑚友好的微生物环境。为了在系统中培养微生物，特别是在微生物净化模块中，应添加稀释的益生菌溶液作为硝化系统的微生物来源。

  1. 添加微生物组来源
    1. 将1 mL商业微生物组来源溶液（参见材料表）加入500 mL海水中，同时搅拌。
    2. 向循环系统中注入50 mL上述稀释后的溶液以及10 µL商业珊瑚营养液（参见材料表）。
  2. 微生物组培养
    1. 开启内循环泵和气泵，培养微生物组21天。气泵的开启与关闭时间比例应根据微生物组对氧气含量的需求来确定。
      ​注意：本步骤旨在培养海水净化用微生物组，并促进系统中有益于珊瑚的微生物组生长。在此过程中，从接种微生物组后的第二天至第四天开始，海水逐渐变得浑浊。完成该微生物组培养过程后，系统应具备一定的营养物质降解能力。需要注意的是，为满足不同的实验需求，可使用不同的微生物组来源来建立相应的微生物组环境。

3. 珊瑚移植与生长

  1. 珊瑚移植
    1. 将原始珊瑚枝条切割为3-5 cm长度，然后将其粘附到3D打印的珊瑚支撑基座上（补充编码文件1）。
    2. 将这些珊瑚枝条样本放回原始海水水箱中，至少恢复7天。
    3. 用胶水将珊瑚支撑基座固定在旋转装置上。组装珊瑚培养模块，并将其连接至外部循环回路。
  2. 成像珊瑚生长
    注意：需要获取随时间变化的珊瑚图像以评估其生长情况。采用可拆卸连接方式，便于将珊瑚培养模块从整个系统中取出进行成像。为此，搭建一个具备适当照明条件的微型摄影工作室。使用配备微距镜头的相机（见材料表）拍摄不同时期的珊瑚表面形态。培养模块中的珊瑚旋转装置可在模块外部以非接触模式操作。通过旋转靠近模块的磁性手柄，可获取全角度的珊瑚图像。
    1. 将相机置于摄影工作室顶部，从垂直视角拍摄图像。
    2. 将珊瑚培养模块放置于微型摄影工作室中，使珊瑚位于底部中央位置。
    3. 通过旋转外部手柄拍摄珊瑚图像。
      ​注意：出于珊瑚存活考虑，成像时间应限制在15分钟以内。

4. 系统常规维护

注意：常规维护包括泄漏检查、故障检查、添加剂添加以及海水更换。

  1. 渗漏检查
    1. 检查底板是否有水渍或水滴。由于系统的外壳为透明材质，可方便直观地观察是否存在漏水情况。此项检查需每天进行。
  2. 故障检查
    1. 确保本步骤包括对水温、水泵、灯光电压、气泵状态和定时器状态的检查，具体包括目视检查并记录设定水温、实时温度、变压器输出电压、紫外灯设置以及定时器工作状态。此项检查应每天进行。
      注意：某些系统故障可根据异常声音或温度异常进行判断。
  3. 添加剂添加
    注意：添加剂添加是指将营养物质及其他试剂加入系统的过程。
    1. 例如，使用注射器从活性炭模块与海水模块之间的三通阀处抽取10 mL海水。
    2. 将添加剂溶解于所抽取的海水中。
    3. 通过三通阀将溶液重新注入系统。在实际操作中，添加剂的种类、用量及添加频率应根据系统内海水质量并结合实验需求确定。
  4. 换水操作
    注意：常规换水可降低养殖系统中有害物质浓度和富营养化程度。若实验条件允许，海水更换可作为常规操作进行。
    1. 为安全起见，关闭整个系统的电源，并拔掉电源线。
    2. 拆下珊瑚养殖模块。
    3. 将外部废水管道连接至海水储存模块的出水口。
    4. 旋转系统，使系统正面朝下放置。
    5. 打开出水口，使系统内部海水自然流出。
      注意：请勿使用任何泵抽水，以免内部负压损坏系统。
    6. 排出适量海水后关闭出水口。排出海水的量应根据珊瑚的生理状态决定。
    7. 将系统复位，并通过进水口将新配制的海水注入系统。
    8. 将珊瑚养殖模块重新安装回系统中。
    9. 接通系统电源，等待整个系统恢复正常运行。

5. 模块更换

注意：如果任何模块因故障或根据实验安排需要更换，则必须在不中断或对培养实验产生负面影响的情况下更换模块。

  1. 对于海水储存模块、藻类净化模块、微生物净化模块或活性炭净化模块，关闭内循环泵，并松开模块的固定螺钉。
  2. 断开两个连接模块之间的管道，将需更换的模块从系统中拆下。最后一步是通过连接管道并重新拧紧固定螺钉，将新模块组装到系统中。
    注意：温度控制模块的更换略有不同。首先，需要断开模块上的所有电线。然后拧下固定螺栓，断开管道。随后拆下加热面板，并将模块从系统中拆卸下来。温度控制模块的安装过程为上述步骤的逆序操作。

6. 关闭系统并将系统恢复至初始状态

注意：在完成必要的珊瑚培养实验后，该系统最终将被关闭。系统需要恢复至其初始状态。

  1. 关闭系统
    1. 关闭系统电源，并拔下电源线。
    2. 排空系统内的海水。
    3. 按以下顺序拆卸模块：珊瑚培养模块、活性炭净化模块、海水储存模块、藻类净化模块、微生物净化模块、紫外灯、两个循环泵以及温度控制模块。
  2. 系统恢复
    1. 使用纯水和表面活性剂（参见材料表）清洗所有模块。
    2. 用3%过氧化氢溶液对模块进行消毒。
      ​注意：请勿使用任何有机溶剂清洗模块。
    3. 在40 °C下干燥模块12小时，确保系统内所有水分完全蒸发。
    4. 使用相同的表面活性剂清洗所有管道和阀门。

7. 受控微生物环境的改造

注意：除了珊瑚培养实验外，对于某些特殊实验，例如在系统中获得受控的微生物环境，必须严格控制微生物组的物种和丰度。我们珊瑚培养系统最具创新性的特点是，可以在相对封闭的微生态系统中，于特定的微生物环境下探究珊瑚的生理活动。实现这一功能需要采用不同的操作流程。

  1. 预灭菌
    1. 使用3%过氧化氢溶液在组装系统前对所有模块、管道和阀门进行灭菌。
    2. 灭菌细菌培养基质 通过 高压灭菌。
    3. 灭菌 刚毛藻 用75%乙醇溶液处理藻类，并用无菌纸将其干燥。
  2. 系统改造与灭菌
    1. 在组装系统时，添加一个空气灭菌过滤器（参见 材料表）位于空气泵与海水储存模块之间。
    2. 在进水口和三通阀之间安装一个水用灭菌滤器。此步骤可确保注入系统的空气和水均经过灭菌处理。
    3. 将臭氧引入系统以清除残留的微生物组。
    4. 用无菌海水将残留的消毒剂冲洗三次，并将无菌海水注入系统中。
    5. 仅为了建立微生物环境，通过出水口注入微生物组来源溶液。
      注意： 不要 使用进水口注入微生物组来源物。其他试剂和海水仍通过进水口注入。

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结果

温度控制精度
系统温度通常根据珊瑚物种设定为 23–28 °C。然而，温度波动是影响珊瑚存活的最重要因素之一，因此温度控制精度是珊瑚培养系统的关键决定因素。可使用温度传感器和独立的数据采集器（温度范围为 9 °C 至 32 °C）来检测珊瑚培养模块中的温度控制精度。我们将系统海水温度设定为 24 °C，并同时测量海水温度和室内温度。如图 4所示，红色曲线代表测得的室内温度波动，黑色曲线代表珊瑚培养模块中测得的海水温度波动。在连续 14 小时的监测中，实测平均温度为 23.8 °C，标准偏差为 0.1 °C，表明系统对海水温度的控制较为精确。

珊瑚培养结果
通常，当环境条件满足珊瑚的生存需求时，健康的珊瑚会自由伸展其触手，如图5所示。该标准通常可用于验证珊瑚的状态，并用于检测是否存在环境胁迫因素。如图5B所示，样品珊瑚的触手...

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讨论

该珊瑚培养系统旨在模拟并为珊瑚移植后存活提供相对自然或可定制的微环境。同时，作为一种自主研发的设备，该系统需要具备可靠性、易用性和安全性。例如，在温度控制方面，应根据每日环境条件对海水温度进行适当调控。通过将珊瑚培养1个月对系统进行了测试，证实了该系统的可靠性。

与普通的海水缸或水族箱相比26，根据我们的珊瑚培养实验，在设定好培养参数/条件（包括添加剂配方、换水计划、循环速度（水泵功率或电压）、光照强度、气泵开关时间比例以及光照时间）后，每日维护和操作所需时间少于10分钟。此外，在此期间未发生任何漏电、短路、过载或其他事故，表明该系统具有良好的用户友好性和安全性。

然而，需要注意的是，系统检查、启动、珊瑚移植/成像以及常规维护是本方案中必不可少的关键步骤。设备内部漏水和设备部件老化可能是长时间运行后出现的两个问题。希望复制该系统的读者必须重视并妥善处理这些问题。

从人工微生态系统角度来看，该模块化平台能够在实验室可控环境中研...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究得到中国国家重点基础研究发展计划（2021YFC3100502）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12V 直流电源德力西电气有限公司CDKU-S150W12V12.5A
3% 过氧化氢溶液山东安捷高科消毒科技有限公司NULLNULL
75% 乙醇溶液山东安捷高科消毒科技有限公司NULLNULL
空气泵重庆优嘉供应链管理有限公司NHY-001NULL
空气灭菌滤器北京_capsid_过滤设备有限公司S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-ANULL
相机SONYΑ7r4-ILCE-76M4ANULL
珊瑚营养液Red Sea Aquatics 有限公司22101珊瑚营养
Coral pro 盐（海盐）Red Sea Aquatics 有限公司R11231NULL
循环定时器乐清尚金仪器设备有限公司CN102A220V 版本
双闭式快速接头JOSOT 有限公司NL4-2103TNULL
流通式紫外灯中山新升电子技术有限公司211NULL
四通道变压器东莞尚固时代电子科技有限公司LM2596NULL
微距镜头SONYFE 90mm F2.8 Macro G OSSNULL
微生物组来源溶液广州百奥微生物技术有限公司303NULL
迷你摄影棚绍兴上虞摄影器材厂CM-45NULL
PID 温度控制器广东东启 电气有限公司TE9-SC18WSSR 版本
水泵（用于水）中祥泵业有限公司ZX43D海水版本
纯水机Kemflo （南京）环境科技有限公司kemflo A600NULL
固态继电器德力西电气有限公司DD25ANULL
表面活性剂广州立白集团有限公司Libai 洗涤剂NULL
三通道定时器乐清长虹智能科技有限公司CHE325-3220V 版本
水灭菌滤器北京_capsid_过滤设备有限公司S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-LNULL

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