本文介绍了一种改进的悬吊固定方法，通过使用大鼠固定夹克在针灸实验过程中有效固定大鼠。此外，还详细阐述了该固定装置的结构与应用，以及其在电针治疗中使用的方法说明和效果评估。
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方法文章
使用大鼠固定夹具改进大鼠针灸实验中的悬吊固定方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在基础实验性针灸研究中，大鼠常被用作实验动物。然而，大鼠难以长时间保持固定体位。在进行电针操作时，对大鼠进行适当的固定至关重要。目前常用的大鼠固定方法包括麻醉固定、高台固定、捆绑固定以及使用自制大鼠外套进行固定。但这些方法均存在一定局限性，可能在一定程度上影响实验的效率与可操作性。本实验方案介绍了一种利用大鼠服装进行悬吊固定的固定方法。首先，为大鼠穿上与其体型相匹配的大鼠背心，利用其喜暗和喜钻的习性实现自然约束。大鼠穿戴背心后即可进行针刺操作。当大鼠被悬吊时，其四肢无法自由活动，因而保持相对静止状态。该固定方法不仅经济实用、操作简便，而且能够使大鼠在舒适放松的体位下实现稳定可靠的固定。同时，该方法还能有效节省时间、实验空间和人力成本。此外，该方法可充分暴露大鼠针灸常用的多数穴位。本文重点介绍该固定装置的组成结构，包括特制的大鼠背心、高位固定架及其连接部件。同时，将通过一个示例展示基于大鼠服装的悬吊固定法在大鼠电针实验中的具体应用。
引言
针灸是一种传统疗法，通过在特定的穴位或其他位置进行针刺来预防和治疗疾病。电针将细针与电刺激相结合1，通过调节相关参数可精确控制刺激量，有助于针灸治疗的标准化2。近年来，关于电针作用机制的研究不断拓展和深入3,4，导致聚焦于电针机制的研究数量逐年增加5。
在电针基础研究中，大鼠是最常用的实验动物。在电针治疗过程中，受试动物必须保持静止以确保操作顺利进行。与人类受试者的临床试验不同，在动物实验中使用的小动物无法在持续15-30分钟的电针过程中主动配合指令。这给研究人员带来了实现稳定且可靠固定的主要挑战。不恰当的固定方式可能引发动物的负面情绪，如焦虑、抑郁和恐惧6，这不仅会增加大鼠受伤以及实验人员被咬伤的风险，还会影响研究结果的稳定性和说服力。
在以往的研究中，研究人员常在针灸或电针操作前采用麻醉固定7、高台固定8、绑缚固定6,9或大鼠外套固定10。然而，考虑到麻醉对机体11和脑功能12的影响，且临床上针灸均在清醒患者身上实施，麻醉可能在一定程度上影响研究结果。因此，与麻醉固定相比，让大鼠在清醒状态下进行舒适固定是更优的选择。
然而，在非麻醉状态下，各种固定方法也存在各自的局限性，包括大鼠体表被毛发覆盖导致穴位暴露受限10、操作至少需要两人配合13、固定装置尺寸不可调节14，或大鼠在强制体位下处于应激状态6。为解决这些技术问题，我们设计了一种大鼠背心及固定架，适用于在大鼠身体大部分区域进行针刺操作。该装置可帮助研究人员更高效地开展大鼠针刺实验。
本实验方案的设计原理如下：首先，大鼠背心上的封闭式头套利用了大鼠天生喜暗和善于挖掘的习性，从而限制其活动范围。其次，缠绕在大鼠四肢关节附近的绑带提供了物理性压迫固定，对其运动施加了一定限制。然而，即使穿着背心，大鼠仍能够跳跃并进行水平移动。最后，由于大鼠在悬吊时若无固定受力点则无法接触地面，因此我们在大鼠背心上加装了悬吊固定装置，进一步限制其活动，并确保针具的留置。该固定装置的结构组成如图1所示。
图1：大鼠背心式固定装置的示意图。（A）大鼠背心平铺状态下的整体外观。（B）大鼠背心的三维视图。（C）特制的大鼠背心，在头部和腰背部穴位附近设有切口。（D）多只大鼠同时悬吊于高架装置上的示意图。1：织物整体视图；2：前肢出口；3：后肢出口；4：绑绳；5：缝合后形成的空腔；6：暴露头部穴位的切口；7：暴露腰背部穴位的切口；8：缝合位置。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
本研究中对大鼠进行的所有操作均遵循中华人民共和国正式采用的《实验动物福利伦理审查指南（2018）》以及美国国家科学院出版社发布的《实验动物护理和使用指南》15。本方案包含三个主要步骤：首先，根据不同体重的大鼠个体体型定制并穿戴特制背心；其次，按照标准操作进行针灸手法干预；最后，在针具留置期间，将大鼠悬挂于其背心中，以便对同组内多只大鼠同时实施干预。
1. 针刺前准备
- 大鼠背心的制作
- 在制作背心前，先称量大鼠体重并测量其体型。为验证本方案适用于不同体重的大鼠，分别选取体重为220 g、300 g、400 g和520 g的大鼠，独立测量其身体尺寸参数a至f（如图2所示）。
注意：大鼠身体比例与其对应背心尺寸之间的关系也在图2中展示。不同体重大鼠的相关体长参数记录于表1中。 - 裁剪一块厚实的深色布料，制成矩形的大鼠背心。布料未折叠时的宽度应等于大鼠腹部最粗处的周长，布料长度应等于从大鼠鼻尖至尾根的距离（见图2）。
- 将布料对折后，剪去左上角，角度约为45°–65°，形成一个直角梯形（见图3A）。
- 用棉线将左侧两边紧密缝合。可参考图1B和图3B进行操作。
- 在布料两侧各剪一个小孔，供大鼠的前肢和后肢穿过（见图3C）。两个前肢之间的距离决定了背心上前孔的间距，两个后肢之间的距离决定了背心下孔的间距。
- 以前肢腋窝至髂骨前缘的纵向距离作为背心上前孔与下孔之间的间距；以肩关节周长确定背心上前孔的周长；以髋关节周长确定背心下孔的周长。
- 在每个孔旁边缝制一条长布带，可从背心开口端交叉缠绕大鼠身体，用于固定大鼠。
- 在制作背心前，先称量大鼠体重并测量其体型。为验证本方案适用于不同体重的大鼠，分别选取体重为220 g、300 g、400 g和520 g的大鼠，独立测量其身体尺寸参数a至f（如图2所示）。
- 大鼠穿背心的方法
- 操作前佩戴手套。将大鼠背心中部和背部位置用一只手固定在桌面上，另一只手抓住大鼠尾巴，从饲养笼中轻轻将其放入背心中。
- 当大鼠向前移动时，其头部将到达背心的头部位置。此时用双手小心地将大鼠左右前肢从背心孔中拉出。
- 从背心开口端取下绑带，由左向右交叉后，牢固缠绕大鼠躯干，并在躯干对侧打结以确保固定牢靠。在固定完前肢后，重复相同操作固定后肢。
- 在将大鼠四肢从背心孔中拉出时，需注意避免被咬伤或被爪子抓伤。绑带的松紧度应调节适当，既不能过紧导致大鼠肢体局部缺血缺氧，也不能过松致使大鼠容易逃脱（见视频1）。
- 固定架与S形铁钩
- 固定架由两个重型铁盘（长24 cm，宽12 cm，高2 cm）和焊接在每个铁盘上的铁柱（长60 cm）组成。通过螺纹连接结构，在两个铁柱上同一高度处固定一根坚固的铁棒（长145 cm），该结构可调节并保持铁棒在固定高度（见图4A）。
- 将穿着背心的大鼠连接至铁棒时，使用S形钩（直径11 cm）。将钩子一端绕在背心的布带上，另一端挂在铁棒上。使用两个S形钩将大鼠牢固固定在铁棒上。整体结构请参见图1D和图4B。
图 2：大鼠体型示意图及对应的大鼠背心尺寸。 在该示意图中，参数 a 表示大鼠前肢与躯干连接处背部的横向距离。该数值用作大鼠背心前肢穿孔之间的间距测量值。类似地，参数 b 表示大鼠后肢双侧与躯干连接处背部的横向距离。该测量值决定了大鼠背心后肢穿孔之间的间距。参数 c 表示大鼠腹部最粗部位的周长，可用作大鼠背心布料的宽度测量值。参数 d 表示从大鼠腋窝至其髂骨前缘的距离，用于确定背心上下穿孔之间的纵向距离。参数 e 对应于从大鼠鼻尖至尾基部的纵向距离，作为大鼠背心布料的长度测量值。参数 f 表示连接前肢与大鼠躯干的关节周长，用作前肢穿过的孔洞周长。参数 g 表示连接后肢与大鼠躯干的关节周长，用于确定后肢穿过的孔洞周长。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 体重 (g) | 体型参数 (cm) | ||||||
| a | b | c | d | e | f | g | |
| 220 | 6.0 | 7.0 | 15.0 | 8.0 | 19.0 | 5.0 | 7.0 |
| 300 | 7.0 | 7.5 | 17.0 | 10.0 | 21.0 | 6.0 | 8.0 |
| 400 | 8.0 | 8.5 | 19.0 | 11.5 | 23.0 | 6.5 | 9.0 |
| 520 | 8.0 | 10.0 | 20.0 | 12.5 | 26.0 | 7.0 | 9.5 |
表1. 不同体重大鼠体形参数的测量结果。
图3：大鼠背心外观及使用方法示意图。（A）大鼠背心的平面外观图。背心形状呈直角梯形，左右两侧分别设有供大鼠上下肢穿过的开口。（B）大鼠背心展开后的外观图。头部固定部分形成一个半封闭腔体，该结构是诱导大鼠进入背心的关键组件。（C）穿着背心的大鼠侧面图。当大鼠四肢穿过衣物开口后，绑带在躯干腹侧交叉，并在背部以适当张力固定，从而实现大鼠相对固定。（D）穿着背心的大鼠腹部视图。背心的腹侧部分暴露大鼠腹部皮肤，便于对腹部穴位进行针刺操作。请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1：为大鼠穿上夹克。 本视频展示了一只为大鼠穿上夹克的典型过程。 请点击此处下载该视频。
图 4：图示说明升高的固定架的物理外观及使用方法。（A） 升高的固定架。该支架主要由两个垂直的铁柱（长60 cm）焊接在每个托盘上，以及一根平行于地面的长水平铁杆（长145 cm）组成。通过螺钉将水平杆固定在与垂直柱相同高度的位置。 （B） 大鼠固定于固定架上。穿戴大鼠背心的大鼠使用每只两个S形钩将其牢固地固定在固定架上。 (C) 在多只大鼠中同时进行电针治疗。为防止大鼠尾巴活动可能造成的相互干扰，需在大鼠之间保持适当间距，其距离相当于一只大鼠尾巴的长度。 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 电针操作步骤
- 常规制备
- 将固定架放置在水平的桌面或地面上。
- 在针刺操作前，使用电动剃须刀去除穴位周围的毛发，以确保穴位充分暴露。当需要针刺的穴位位于大鼠腹部时，例如关元（CV4，约在脐下25 mm处），应适当缩短大鼠衣物的宽度，以暴露腹部穴位。
- 从大鼠背心未覆盖的腹部正中线间隙处定位穴位（参见 图3D）然后插入针头。
- 当针刺部位位于大鼠头部时，例如百会穴（GV20，位于顶骨中点），需在头部相应位置做一小切口，充分暴露GV20周围的皮肤（参见 图1C).
- 在对大鼠四肢穴位进行针刺时，例如上肢内关（PC6，位于前肢内侧，桡骨与尺骨缝之间，距腕关节约3 mm处）或下肢足三里（ST36，位于膝关节后外侧，腓骨小头下方约2 mm处），由于穴位暴露明显，可用一只手辅助固定肢体，另一只手直接进行针刺操作。
- 当针灸穴位位于大鼠背部或腰部时，例如肾俞（BL23，位于第二腰椎下方，距背部正中线6 mm处），应在大鼠背心中央剪开一个约2 cm宽的开口，以充分暴露相应部位的皮肤（参见 图1C).
- 将大鼠穿上外套。用酒精棉片对穴位局部皮肤进行消毒后，开始针灸操作。
- 针刺技术：准确定位穴位。将无菌一次性针灸针（0.16 mm × 7 mm）插入大鼠穴位至适当深度。
- 电针操作
- 将电极导线缠绕在水平铁杆上。此步骤可降低因重力作用导致电针夹从针柄脱落的风险。然后，将电极导线末端牢固地连接至针柄上。
- 打开电源，选择合适的频率、电流和时间参数。本实验中，参数设置为 2 Hz、1 mA 和 15 min。参数调整完毕后，开始电针治疗过程（参见 视频 2 和 视频 3).
- 大鼠同步电针治疗：治疗过程中，使用S形钩将同组大鼠共同悬挂在铁棒上，使其同时接受电针干预。
- 注意：铁棒不仅应足够坚固，还应具有足够的长度，以便同时处理一组大鼠。本实验中，在确保大鼠之间保持适当间距且互不干扰的前提下，可同时处理3-4只大鼠（参见 图4C).
- 观察大鼠在电针治疗期间的反应：根据以下因素评估该固定方法用于大鼠电针治疗的适用性，包括完成操作所需人员数量、固定一只大鼠所需时间、大鼠在电针治疗过程中的反应、操作过程中脱落的针数，以及操作期间可能发生的意外死亡情况。
- 去除针头
- 预设时间结束后，电针仪将自动关闭。取下连接针柄的小夹子，小心地从大鼠皮下取出针灸针，从而结束电针治疗过程。
- 松开束缚带，提起大鼠背心的头套，将大鼠置于笼子上方。大鼠即可自行从背心中脱出并独立进入笼内（参见 视频 4).
视频 2. 腰部穴位针刺操作。 本视频展示了完整且连贯的操作流程，包括将大鼠穿上固定背心、将针灸针插入腰部穴位，以及随后连接电针仪的过程。请点击此处下载该视频。
视频 3. 腹部与下肢穴位针刺。 本视频展示了完整且连贯的操作流程，包括将大鼠穿上固定夹克、将针灸针插入位于腹部和下肢的穴位，以及随后连接电针仪的过程。请点击此处下载该视频。
视频 4. 移除大鼠背心。 本视频展示了从大鼠身上移除背心的常规操作。 请点击此处下载该视频。
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结果
在本实验中，共选取12只大鼠进行电针治疗，并观察其在固定方法下的反应（如表2所示）。在12只大鼠中，仅有1只在15分钟的电针留针期间表现出剧烈挣扎。由于其剧烈活动，针具中途脱落，占大鼠总数的8.33%。该结果表明，所采用的固定方法总体上具有显著的稳定性和可靠性。尽管有1只大鼠出现挣扎情况，但其余大多数大鼠在整个治疗过程中均保持针具固定良好。此外，在为期2个月的实验过程中，采用该方法对大鼠进行电针治疗时，未记录到任何大鼠死亡案例，提示该固定方法对大鼠具有良好的安全性。
此外，在表3中，我们将该固定方法与文献中报道的另外四种方法进行了比较9,10,13,14。首先，在稳定性方面，除第五种使用新制大鼠固定架的方法稳定性略差外，其余方法均实现了相对可靠的固定。在操作时间...
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讨论
电针已被证明对多种疾病具有良好的治疗效果，如认知功能障碍16,17、心肌损伤18和炎症性疼痛19。为了理解其作用机制，主要采用大鼠开展动物实验。在操作过程中对动物进行固定对于获得准确结果至关重要。尽管许多研究在动物麻醉后实施电针，但这种做法可能影响脑功能，降低实验的准确性。此外，长期使用麻醉会延长针刺操作时间，并增加动物死亡的风险。然而，已有报道的非麻醉固定方法也存在局限性，已在表3中进行了详细讨论。
本研究提出了一种新方案，该方案结合使用自制的大鼠背心与抬高的固定架。本方案的关键在于，根据大鼠的体型制作尺寸合适的大鼠背心，并依据需要针刺的穴位位置对其进行进一步个性化调整。在穿戴大鼠背心时，一个实用的技巧是利用大鼠天生趋向黑暗和喜欢钻洞的习性，引导其主动进入头部装置。一旦大鼠头部被固定，后续的固定操作将变得简便许多。
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披露
所有作者均已声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
作者谨向研究人员之家的Figdraw科研绘图平台致以诚挚感谢，该平台提供了用于制作本文图2的素材，授权许可证编号：URUUO5699e。本研究工作得到了国家自然科学基金（81873380，82074566）、湖北省自然科学基金（2022CFCO43）以及国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目（[2022]5号，[2022]75号）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 75% 酒精 | 山东利康医疗科技有限公司 | 2002-0059 | 消毒 |
| 针灸针 | 北京罗亚山川医疗设备有限公司 | 针刺 | |
| 成年Sprague-Dawley（SD）大鼠 | 辽宁长生生物技术有限公司 | SCXK 2020-0001 | 受体 固定处理 |
| 升高的固定架 | 台州赛爱科学教学研究仪器设备 有限公司 | / | 固定大鼠 |
| Hans电子针灸仪 | 北京华云安特科技有限公司 | HANS-200A | 电针 |
| 医用棉球 | 江苏三和医用材料有限公司 | 20172142357 | 消毒 |
| 宠物电动剪毛器 | 奉化溪口鲁褒刀具 &安普与剪刀电器厂 | / | 剃除大鼠的毛发 |
| 镊子 | 青岛舒尔茨生物技术有限公司 | 捏紧棉球 |
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