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胶质瘤干细胞系类球体药物敏感性筛选

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DOI：

10.3791/65655

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

体外药物敏感性筛选是发现抗癌药物组合的重要工具。在球体中培养的细胞会激活不同的信号通路，相较于单层细胞系，被认为更能代表体内模型。本方案描述了一种针对球状体细胞系的体外药物筛选方法。

摘要

体外药物敏感性筛选是发现抗癌药物联合疗法的重要工具。通常，这些体外药物筛选是在单层培养的细胞上进行的。然而，与三维（3D）球状体细胞模型相比，这些二维（2D）模型被认为准确性较低；这一点在胶质瘤干细胞系中尤为明显。在球状体中生长的细胞会激活不同的信号通路，相较于单层培养的细胞系，其更接近于体内模型。本方案描述了一种用于球状体细胞系的体外药物筛选方法，并以小鼠和人源胶质瘤干细胞系为例进行说明。该方案介绍了一种三维球状体药物敏感性和协同作用检测方法，可用于判断某种药物或药物组合是否诱导细胞死亡，以及两种药物是否存在协同效应。胶质瘤干细胞系被 改造为表达RFP。将细胞接种于低吸附、圆底的96孔板中，于过夜培养中形成球状体。随后加入药物，并利用IncuCyte活细胞成像系统 （一种集成在组织培养孵育箱中的荧光显微镜）通过随时间测量RFP信号来监测细胞生长情况。之后计算半数最大抑制浓度（IC50）、半数致死剂量（LD50）以及协同评分，以评估单独用药或联合用药的药物敏感性。该检测方法的三维特性 更真实地反映了肿瘤在体内的生长、行为及药物敏感性，从而为后续的临床前研究奠定基础。

引言

胶质母细胞瘤是一种毁灭性的高级别脑部肿瘤，其5年总生存率仅为5%1。胶质母细胞瘤等高级别胶质瘤（HGG）是儿童人群中癌症相关死亡的首要原因2，同时也是成人中最难治疗的肿瘤之一3。尽管在理解HGG分子驱动机制方面已取得显著进展，但治疗选择仍然有限3，这凸显了建立更准确预测临床治疗敏感性的药物筛选方法的迫切需求。

三维细胞培养主要用于模拟生理条件下具有相关性的细胞行为4此外，肿瘤微环境的三维结构可以被重建 体外 通过建立三维生长检测方法5类球体生长还会激活不同的信号通路，因此被认为更具有代表性 体内 模型6,7 与二维培养相比。儿童高级别胶质瘤干细胞 我们的小鼠NF1胶质瘤干细胞系天然以神经球形式生长，并将这些小鼠NF1胶质瘤细胞系用于中等通量药物筛选8此处使用的儿童细胞系源自大脑半球、中线及小脑部位的儿童高级别胶质瘤（HGG） 并由儿童脑肿瘤网络（Children's Brain Tumor Network）提供，且已进行完整表征（包括突变和基因表达谱）9这些细胞系经过改造以表达核定位的红色荧光蛋白（RFP），可用于监测 使用Incucyte活细胞成像系统检测增殖与存活情况。RFP信号强度代表存在的细胞数量。其他荧光素，如绿色荧光蛋白（GFP），也可同样使用。

儿童急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、上皮性恶性肿瘤及多种其他癌症的联合化疗是根除肿瘤并防止对单一药物产生耐药性的有效方法10,11然而，关于如何选择药物组合以实现对高级别胶质瘤（HGG）的治疗敏感性，目前相关信息仍然有限，这促使人们在研究中采用更为精确的类球体模型 体外 药物检测

方案

所有实验方案均经费城儿童医院机构审查委员会（IRB）批准。

1. 三维球状细胞接种

  1. 制备胶质瘤干细胞培养基：在基础培养基中加入50 mL增殖添加剂和5 mL 100倍浓度的青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL），配制基础培养基 （500 mL）。为制备胶质瘤干细胞培养基，根据生产商说明，将表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）分别加入至终浓度为20 ng/mL和10 ng/mL。
    注：胶质瘤干细胞培养基在4 °C保存条件下可使用1周。
  2. 解离表达RFP的细胞：
    注：本示例中使用的小鼠NF1高级别胶质瘤（HGG）干细胞系为5746。
    1. 将胶质瘤细胞球转移至15 mL锥形管中，在离心机中离心（150 × g，5分钟）。弃去上清液，加入300 µL的Accutase溶液以解离细胞球（于37 °C孵育5分钟）。
    2. 加入1 mL胶质瘤干细胞培养基，通过轻柔吹打使细胞球分散。将解离后的细胞以150 × g离心5分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL胶质瘤干细胞培养基中。
  3. 使用细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度。若使用荧光细胞计数仪，将18 µL细胞悬液与2 µL的吖啶橙/碘化丙啶染色液混合。取12 µL该悬液加入血细胞计数板，计数悬液中活细胞与死细胞的数量。
  4. 将细胞稀释至最终浓度为每100 µL胶质瘤干细胞培养基中含有2,000个细胞。
    注：细胞浓度的调整可能因细胞系而异，可根据具体情况适当优化。
  5. 使用多通道移液器，采用反向移液法将100 µL细胞悬液（每100 µL含2,000个细胞）加入96孔圆底低吸附培养板的每个孔中。
    注：应使用圆底低吸附培养板，此类培养板有助于每个孔中形成单一胶质瘤细胞球。反向移液可避免气泡产生，从而防止干扰活细胞成像分析系统的图像采集。
  6. 以150 × g离心培养板5分钟。
    ​注：离心是启动三维神经球形成的關鍵步骤。
  7. 过夜培养，使每个孔中形成单一细胞球。

2. 用于协同作用检测的药物添加（图1）

  1. 确保96孔板的每个孔中分别加入药物1和药物2的特定浓度。建立一个浓度组合网格，使药物1的每种浓度与药物2的每种浓度均以双复孔形式组合。
  2. 对将要确定协同作用的两种药物进行系列稀释（药物1稀释5个浓度，药物2稀释7个浓度），使用胶质瘤干细胞培养基图1A).
    注意：本研究中采用50%的系列稀释法；但也可使用其他任何系列稀释方法。
    1. 稀释系列的浓度应比每孔所需的最终浓度高7倍。 例如，如果药物1的最高终浓度为1 µM， 配制第一浓度 药物1稀释系列的7 µM（1 mL，B管或I管） 图1A).
    2. 向稀释系列的每个附加试管（如图所示的试管 C-H 和 J-M）中加入 500 µL 胶质瘤干细胞培养基 图1).
    3. 从B管或I管中吸取500 µL药物混合液，加入稀释系列的下一管C管或J管中（分别含有500 µL胶质瘤干细胞培养基）。 充分混匀后，依次加入稀释系列中的下一管。设置DMSO对照（A管），并确保各处理组中DMSO浓度保持一致。
      注意：可对药物浓度和稀释系列进行调整。务必在记录中列出正确的药物浓度 补充文件 1 如果稀释系列发生改变。
  3. 向96孔板的每个孔中，通过反向移液法加入20 µL药物1和20 µL药物2，如图所示 图 1B，最终每孔体积为140 µL；药物组合设两个重复孔。 如果使用所提供的 IC50 和 LD50 下游分析，请按照所示药物布局进行 图1B.
    1. 在此实验中，还需测定每种药物单独作用（无另一种药物存在时）的效果。务必向其中加入20 µL DMSO对照培养基（A管） 图1B）与单一药物相比 孔 使每孔终体积为 140 µL。
    2. 确保孔中无气泡，以免影响成像。 
      注意：可对最终体积进行调整；但需确保相应调整第 2.2 步中的浓度。
  4. 将培养板放入活细胞成像仪中，使用类球体模块的单个类球体模式，在4倍放大条件下对每个孔中的每个类球体进行明场和RFP成像，监测其生长情况。
  5. 监测培养板 72 小时，定期对每孔进行成像 时间间隔，通常为2 h。
    ​注意：上传正确的孔板图；这将确保后续分析的准确性图1C).

3. IC50、LD50 和协同作用评分的计算（图 2 和 图 3）

  1. 使用活细胞成像软件分析每个孔在每个时间点的RFP强度。所用分析参数详见补充文件（补充文件2）。
    注意：可根据需要使用不同的分析参数。
  2. 导出每个孔的RFP数据为总红色整合RFP强度，并确保 导出原始的未分组数据（图2A）。
    注意：如果使用提供的模板（补充文件1）计算IC50和LD50，则必须遵循步骤3.2。
  3. 将原始数据粘贴至提供的Excel表格中，计算每种药物组合的（1）相对于仅含DMSO组的倍数变化的平均值和标准差（此计算无需0小时的数据），以及（2）相对于0小时的Log2倍数变化的平均值和标准差（图2B，示例见补充文件1）。
  4. 在电子表格中调整药物1和药物2的最大浓度（图2B）。
    注意：务必正确调整药物1和药物2的浓度，否则将导致LD50和IC50值计算错误。
  5. 使用合适的数据分析软件（本研究中使用GraphPad）计算IC50值。在计算IC50时，使用步骤3.4中确定的相对于仅含DMSO组的平均倍数变化及倍数变化的标准差，并将药物1和药物2的IC50表格复制到数据分析软件中（Log(抑制剂) vs. 归一化响应，可变斜率）（图3A）。
    1. 仅使用添加了单一化合物的孔的数据进行IC50计算。在数据分析软件中使用药物浓度的Log值，该值已在提供的电子表格中自动计算。
  6. 计算协同作用评分：
    1. 使用每种组合的平均 相对于仅含DMSO组的倍数变化 ，通过软件或网站计算协同作用评分。 例如， https://synergyfinder.fimm.fi/12 （参数设置：LL4曲线拟合，ZIP方法用于协同评分）。 补充文件1 可自动计算生成协同输入表所需的数值，该表可上传至 SynergyFinder （图3B）。 补充文件3中提供了协同输入表示例。
      注意：评分高于10表示具有协同作用，低于-10表示具有拮抗作用，介于-10至10之间的值表示相加效应。 
  7. 计算LD50值：
    1. 针对药物1的每种浓度，计算药物2的LD50。补充文件会自动计算每种浓度下的Log2值及其标准差（图3C）。
    2. 将相对于0小时的Log2倍数变化的平均值和标准差，以及重复次数输入数据分析软件（本研究中为2次），并通过确定Log2 = -1时对应的浓度来计算LD50值及LD50标准差（Log2 = -1表示与0小时相比信号损失50%时的Log2值）。在这些计算中，使用Log(抑制剂) vs. 响应，可变斜率四参数模型。
      注意：数据分析软件不会自动计算对应Log2 = -1值的药物浓度，但可通过用户自定义方程将该值添加至软件报告的计算结果中（图3C）。请确保在数据分析软件中使用药物浓度的Log值，该值已在提供的电子表格中自动计算。补充文件4展示了GraphPad软件中的IC50和LD50分析面板。

结果

以曲美替尼（MEK抑制剂）和GDC-0941（PI3K抑制剂）为例，评估了这两种药物对小鼠胶质瘤干细胞系5746（表达RFP）中两条RAS下游效应通路的协同作用（图4）。图4A展示了在0小时和72小时分别用曲美替尼和GDC-0941联合处理后的同一肿瘤球体图像，这些图像直接导出自活细胞成像软件。IC50和LD50的计算方法如GraphPad所示（图4B、D），协同作用通过SynergyFinder软件进行计算（图4C）。图4B显示了IC50计算结果，包括两种药物各自的LogIC50、Hill斜率、IC50值，以及95%置信区间和拟合优度。图4C展示了每种药物单独使用的剂量-反应曲线（药物浓度与抑制率百分比的关系）、一个以颜色编码的矩阵图（显示每种药物组合对生长抑制的百分比），以及两种药物之间协同评分的三维图；本例中协同评分为22.356。图4D显示了药物单独使用或联合使用时LD50值的计算结果，其中重要的是LogLD50和LD50值及其相应的95%置信区间。如预期所示，随着GDC-0941浓度降低，曲美替尼的LD50值也相应降低。需要特别注意的是，LD50是细胞死亡的标志，表示相对于实验起始点有50%的细胞死亡。

药物剂量-反应矩阵实验示意图，包含稀释过程、浓度网格及分析表格。
图1：建立双药协同作用的96孔板实验。（A）药物1和药物2的1/2倍比稀释系列示意图。每种药物的起始浓度应为最终各孔中浓度的7倍。（B）接种5746个RFP荧光球体后的96孔板在0小时的图像。如图所示，药物1的稀释系列按行加入，共7个稀释梯度及一个DMSO对照；药物2的稀释系列按列加入，每次加入两列，共5个稀释梯度及一个DMSO对照。（C）在活细胞成像系统软件中上传的孔板图谱示例。请点击此处查看该图的放大版本。

96孔板数据导出流程；药物协同分析设置，Excel集成，浓度输入。
图2：获取数据的导出。（A）在72小时的测量后，导出每个孔和每个时间点的总红色物体整合强度。分组设置为无。在导出选项中（右侧），选择按重复样本组织和目标位置为剪贴板。（B）将导出的数据粘贴至电子表格中指定的单元格（补充文件1）。根据提示更新每种药物的最高浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

Excel 中的 IC50、LD50 数据输入表格，显示用于协同分析的药物活性实验设置。
图 3：获取数据的处理。（A）可复制到数据分析软件中进行分析的 IC50 输入表格（补充文件 4，IC50 面板）。这些表格在 补充文件 1 中自动生成。（B）通过将活性数据表复制到 补充文件 3 中，可生成适用于 SynergyFinder 程序的协同作用输入表。该文件需上传至 https://synergyfinder.fimm.fi/，并按提示进行选项设置，系统将自动计算协同评分和协同矩阵。（C）可复制到数据分析软件中进行分析的 LD50 输入表格（补充文件 4，LD50 面板）。这些表格在 补充文件 1 中自动生成。底部展示了 LD50 值如何被添加至数据分析软件中报告的结果中。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞生长抑制实验；IC50/LD50结果；图表；细胞图像；药物处理分析。
图4：Trametinib与GDC-0941在5746号胶质瘤干细胞球中的协同作用研究结果示例。（A）5746 RFP细胞球在10 nM Trametinib和1000 nM GDC-0941处理后0小时和72小时的图像。（B）IC50计算结果输出，显示IC50值及其标准差。（C）SynergyFinder程序输出结果。左侧：抑制曲线；中部：抑制率百分比表格；右侧：协同作用图谱，显示Trametinib与GDC-0941的协同得分为22.3。（D）LD50计算结果输出，显示LD50值及其标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：用于分析 Incucyte 中 RFP 信号的参数。请点击此处下载该文件

补充文件 2：用于处理生成数据的电子表格，并生成用于 GraphPad 和 SynergyFinder 的输入表格。请点击此处下载该文件。

补充文件 3：SynergyFinder 输入表的电子表格。请点击此处下载该文件

补充文件 4：用于计算 IC50 和 LD50 值的 GraphPad 文件 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了已有效用于评估胶质瘤类球体模型中药物敏感性的三维药物筛选实验8。该三维类球体检测系统专为更准确地进行临床前联合化疗研究而设计，适用于在球体中培养的胶质瘤细胞系。对于高级别胶质瘤（HGG），此方法为识别该致命性疾病潜在的药物敏感性提供了框架。然而，该系统的潜在应用不仅限于胶质瘤，也可 用于评估其他多种疾病三维模型中的新型治疗手段。

本研究的目的是提高预测的准确性 体外 药物筛选，以优先选择在临床前研究中最具成功潜力、并最终有望进入临床应用的药物组合。特别是在胶质瘤中，利用 体外 药物筛选在临床转化方面的应用仍然有限，部分原因在于使用了非理想的血清培养胶质瘤细胞系13，二维单层培养实验的应用4, 并关注IC50（生长抑制50%）而非LD50（与实验开始时相比细胞数量减少50%）值14. 体外 胶质瘤干细胞的球体生长实验用于在临床前模型中优先筛选待评估的药物组合。在药物组合的优先排序过程中，需考虑以下几点：1）较低的LD50值，关注细胞死亡而非仅抑制增殖，可提高潜在成功率；2）理想情况下，这些LD50值应低于Cmax值，即在临床试验的药代动力学研究中可安全达到的最高血清浓度 如可获取；3）A 高协同得分，若两种药物具有协同作用，则表明二者在作用机制上存在协同效应。尽管该点并非鉴定高效药物组合所必需，但协同作用可在不增加药物毒性的情况下增强药效。

重要的是， 体外 评估药物敏感性仍是发现可缩小肿瘤的新型疗法或药物组合的重要工具。本文介绍的方案利用三维球状体生长检测系统，可确定药物敏感性及协同作用，从而用于在临床前模型中优先筛选待评估的药物组合。

该实验方案包含多个关键步骤。我们将在96孔板的每个孔中测量单个克隆的生长情况。使用低吸附性圆底孔板至关重要，以确保细胞不会贴壁生长，同时促进球状体的形成。圆底孔可保证单个球状体始终位于96孔板的同一位置。

接种细胞后，必须对培养板进行离心，以确保所有接种的细胞聚集在圆底孔的最低点，并形成单个三维细胞球。每个孔的总体积必须为 140 µL，以保证每孔中相应药物的最终浓度正确。

向96孔板加样时， 请使用反向移液技术，这可以降低在孔中产生气泡的风险。气泡会阻碍活细胞成像仪对每个孔的正确成像，导致荧光强度不准确，从而影响后续的结果分析。

所提供的板布局和电子表格是针对所描述的实验方案而设计的。如果偏离了该铺板方式，将导致错误的IC50和LD50值计算结果。当输入最高浓度时，电子表格会自动计算相应的稀释梯度。每次实验均需更新最高浓度，否则将导致错误的IC50和LD50值计算。

Graphpad 使用对数浓度来计算 IC50 和 LD50 值。这些对数浓度已在提供的电子表格中自动计算，可直接复制到软件中。若不使用对数浓度，将导致 IC50 和 LD50 值计算错误。

我们正在使用天然以球状形式生长的细胞系。可通过本方案将贴壁细胞强制形成球状，但无法保证其能够增殖。每个孔中接种的细胞数量可能因细胞系而异，需根据各细胞系独特的生长特性进行调整，此参数易于修改。建议的稀释曲线仅为参考，可对药物浓度及稀释系列进行调整。然而，若更改了稀释系列，则必须在补充文件1中准确列出相应的药物浓度，否则计算得到的IC50和LD50值将不准确。用户可选择不同的板式布局，例如仅使用一个 重复而非两个重复，此时必须相应更新电子表格以反映此变更。

接种后，偶尔会在单个孔中形成多个3D细胞球。在此情况下，重复离心步骤（150 x g）可使这些细胞球融合为一个单一的细胞球。如果发生接种错误，导致孔板布局不同，可修改所提供的电子表格以反映新的孔板图谱。如果某个数据点为异常值并需从分析中剔除，可更新所提供的电子表格。

该系统的主要局限性在于其使用的是自然形成球状结构的细胞系，而非单层贴壁生长的细胞系。如果细胞系无法形成球状体，则应采用传统的二维增殖检测方法。相较于常规的二维单层培养，采用此类三维类器官样生长检测的主要优势在于，其细胞结构和激活的信号通路能更真实地反映体内所观察到的情况。 体内 人类疾病模型，强调这些方法的转化潜力与适用性。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管CELLTREAT22941115 mL 聚丙烯离心管，无菌
96孔板S-bioMS9096UZ96孔圆底超低吸附板
AccutaseSTEMCELL Technologies7922细胞解离溶液
吖啶橙/碘化丙啶染色液Logos BiosystemsF23001用于细胞计数的活/死细胞染色剂
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2人重组型bFGF
细胞计数仪Logos BiosystemsL20001LUNA-FL 双荧光细胞计数仪
离心机Eppendorf5810R用于细胞和培养板的离心
DMSOPierce20688化合物溶剂
EGFSTEMCELL Technologies78006.2人重组型EGF
Eppendorf 管Costar07-200-534微量离心管
ExcelMicrosoftMicrosoft Excel
GDC-0941SelleckchemS1065药物1
GraphPadGraphPadGraphPad Prism 9IC50 和 LD50 的计算
血细胞计数板Logos BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3嵌入组织培养孵育箱中的荧光显微镜，可按特定时间间隔对每个孔成像
Incucyte 软件SartoriusIncucyte 2022B增殖数据的分析
培养基STEMCELL Technologies5702NeuroCult（小鼠和大鼠）增殖培养基套装，包含基础培养基和生长补充物
青霉素-链霉素 Gibco15140122添加至培养基中的抗生素
曲美替尼SelleckchemS2673药物2

参考文献

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