胶质瘤干细胞系类球体药物敏感性筛选

摘要

体外药物敏感性筛选是发现抗癌药物组合的重要工具。在球体中培养的细胞会激活不同的信号通路，相较于单层细胞系，被认为更能代表体内模型。本方案描述了一种针对球状体细胞系的体外药物筛选方法。

摘要

体外药物敏感性筛选是发现抗癌药物联合疗法的重要工具。通常，这些体外药物筛选是在单层培养的细胞上进行的。然而，与三维（3D）球状体细胞模型相比，这些二维（2D）模型被认为准确性较低；这一点在胶质瘤干细胞系中尤为明显。在球状体中生长的细胞会激活不同的信号通路，相较于单层培养的细胞系，其更接近于体内模型。本方案描述了一种用于球状体细胞系的体外药物筛选方法，并以小鼠和人源胶质瘤干细胞系为例进行说明。该方案介绍了一种三维球状体药物敏感性和协同作用检测方法，可用于判断某种药物或药物组合是否诱导细胞死亡，以及两种药物是否存在协同效应。胶质瘤干细胞系被 改造为表达RFP。将细胞接种于低吸附、圆底的96孔板中，于过夜培养中形成球状体。随后加入药物，并利用IncuCyte活细胞成像系统 （一种集成在组织培养孵育箱中的荧光显微镜）通过随时间测量RFP信号来监测细胞生长情况。之后计算半数最大抑制浓度（IC50）、半数致死剂量（LD50）以及协同评分，以评估单独用药或联合用药的药物敏感性。该检测方法的三维特性 更真实地反映了肿瘤在体内的生长、行为及药物敏感性，从而为后续的临床前研究奠定基础。

引言

胶质母细胞瘤是一种毁灭性的高级别脑部肿瘤，其5年总生存率仅为5%¹。胶质母细胞瘤等高级别胶质瘤（HGG）是儿童人群中癌症相关死亡的首要原因²，同时也是成人中最难治疗的肿瘤之一³。尽管在理解HGG分子驱动机制方面已取得显著进展，但治疗选择仍然有限³，这凸显了建立更准确预测临床治疗敏感性的药物筛选方法的迫切需求。

三维细胞培养主要用于模拟生理条件下具有相关性的细胞行为⁴此外，肿瘤微环境的三维结构可以被重建 体外 通过建立三维生长检测方法⁵类球体生长还会激活不同的信号通路，因此被认为更具有代表性 体内 模型^6,7 与二维培养相比。儿童高级别胶质瘤干细胞 我们的小鼠NF1胶质瘤干细胞系天然以神经球形式生长，并将这些小鼠NF1胶质瘤细胞系用于中等通量药物筛选⁸此处使用的儿童细胞系源自大脑半球、中线及小脑部位的儿童高级别胶质瘤（HGG） 并由儿童脑肿瘤网络（Children's....

方案

所有实验方案均经费城儿童医院机构审查委员会（IRB）批准。

1. 三维球状细胞接种

1. 制备胶质瘤干细胞培养基：在基础培养基中加入50 mL增殖添加剂和5 mL 100倍浓度的青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL），配制基础培养基 （500 mL）。为制备胶质瘤干细胞培养基，根据生产商说明，将表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）分别加入至终浓度为20 ng/mL和10 ng/mL。
   注：胶质瘤干细胞培养基在4 °C保存条件下可使用1周。
2. 解离表达RFP的细胞：
   注：本示例中使用的小鼠NF1高级别胶质瘤（HGG）干细胞系为5746。
   1. 将胶质瘤细胞球转移至15 mL锥形管中，在离心机中离心（150 × g，5分钟）。弃去上清液，加入300 µL的Accutase溶液以解离细胞球（于37 °C孵育5分钟）。
   2. 加入1 mL胶质瘤干细胞培养基，通过轻柔吹打使细胞球分散。将解离后的细胞以150 × g离心5分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL胶质瘤干细胞培养基中。
3. 使用细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度。若使用荧光细胞计数仪，将18 µL细胞悬液与2 µL的吖啶橙/碘化丙啶染色液混合。取12 µL该悬液加入血细胞计数板....

结果

以曲美替尼（MEK抑制剂）和GDC-0941（PI3K抑制剂）为例，评估了这两种药物对小鼠胶质瘤干细胞系5746（表达RFP）中两条RAS下游效应通路的协同作用（图4）。图4A展示了在0小时和72小时分别用曲美替尼和GDC-0941联合处理后的同一肿瘤球体图像，这些图像直接导出自活细胞成像软件。IC50和LD50的计算方法如GraphPad所示（图4B、D），协同作用通过SynergyFinder软件进行计算（图4C）。图4B显示了IC50计算结果，包括两种药物各自的LogIC50、Hill斜率、IC50值，以及95%置信区间和拟合优度。图4C展示了每种药物单独使用的剂量-反应曲线（药物浓度与抑制率百分比的关系）、一个以颜色编码的矩阵图（显示每种药物.......

讨论

本方案描述了已有效用于评估胶质瘤类球体模型中药物敏感性的三维药物筛选实验⁸。该三维类球体检测系统专为更准确地进行临床前联合化疗研究而设计，适用于在球体中培养的胶质瘤细胞系。对于高级别胶质瘤（HGG），此方法为识别该致命性疾病潜在的药物敏感性提供了框架。然而，该系统的潜在应用不仅限于胶质瘤，也可 用于评估其他多种疾病三维模型中的新型治疗手段。

本研究的目的是提高预测的准确性 体外 药物筛选，以优先选择在临床前研究中最具成功潜力、并最终有望进入临床应用的药物组合。特别是在胶质瘤中，利用 体外 药物筛选在临床转化方面的应用仍然有限，部分原因在于使用了非理想的血清培养胶质瘤细胞系¹³，二维单层培养实验的应用^4, 并关注IC50（生长抑制50%）而非LD50（与实验开始时相比细胞数量减少50%）值¹⁴. 体外 胶质瘤干.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	CELLTREAT	229411	15 mL 聚丙烯离心管，无菌
96孔板	S-bio	MS9096UZ	96孔圆底超低吸附板
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	细胞解离溶液
吖啶橙/碘化丙啶染色液	Logos Biosystems	F23001	用于细胞计数的活/死细胞染色剂
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	人重组型bFGF
细胞计数仪	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL 双荧光细胞计数仪
离心机	Eppendorf	5810R	用于细胞和培养板的离心
DMSO	Pierce	20688	化合物溶剂
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	人重组型EGF
Eppendorf 管	Costar	07-200-534	微量离心管
Excel	Microsoft		Microsoft Excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	药物1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	IC50 和 LD50 的计算
血细胞计数板	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	嵌入组织培养孵育箱中的荧光显微镜，可按特定时间间隔对每个孔成像
Incucyte 软件	Sartorius	Incucyte 2022B	增殖数据的分析
培养基	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult（小鼠和大鼠）增殖培养基套装，包含基础培养基和生长补充物
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	添加至培养基中的抗生素
曲美替尼	Selleckchem	S2673	药物2