需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于小鼠脊髓挫伤模型的自动化撞击器

3.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65656

⸱

2024年1月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了一种用于小鼠的新型自动化脊髓损伤挫伤装置，该装置能够精确地制备不同程度的脊髓损伤挫伤模型。

摘要

脊髓损伤（SCI）由车祸和跌倒等创伤性损伤引起，常导致永久性脊髓功能障碍。通过撞击脊髓建立脊髓损伤挫伤模型，可产生与临床实践中大多数脊髓损伤相似的病理变化。准确、可重复且操作便捷的动物模型对于脊髓损伤研究至关重要。本文介绍一种新型自动化小鼠脊髓损伤挫伤装置——广州暨南大学智能脊髓损伤系统，该系统能够准确、可重复且便捷地建立脊髓损伤挫伤模型。该系统可精确构建不同程度的脊髓损伤模型。 通过 激光测距传感器结合自动化移动平台与先进软件。我们利用该系统建立了三种程度的脊髓损伤小鼠模型，测定其Basso小鼠评分（BMS）分数，并进行行为学及染色检测，以验证该方法的准确性与可重复性。本文展示了使用该设备构建损伤模型的各个步骤，形成了一套标准化操作流程。该方法可稳定构建可重复的脊髓损伤挫伤小鼠模型，并通过简便的操作程序减少人为操作因素的影响。所建立的动物模型在研究脊髓损伤机制及相关治疗策略方面具有可靠性。

引言

脊髓损伤通常导致损伤节段以下的脊髓功能永久性障碍。其主要原因包括物体撞击脊柱和脊柱过度伸展，例如交通事故和跌倒1。由于目前针对脊髓损伤的有效治疗手段有限，利用动物模型阐明脊髓损伤的发病机制，将有助于开发适当的治疗策略。通过外力冲击脊髓所建立的脊髓损伤挫伤模型，能够产生与大多数临床脊髓损伤病例病理特征相似的动物模型2,3。因此，建立精确、可重复且操作便捷的脊髓损伤挫伤动物模型具有重要意义。

自1911年Allen首次建立脊髓损伤动物模型以来，在用于构建脊髓损伤动物模型的仪器开发方面已取得重大进展4,5。根据损伤机制，脊髓损伤模型可分为挫伤、压迫、牵张、脱位、横断或化学性损伤模型6。其中，挫伤模型通过外部力量使脊髓移位并造成损伤，最接近大多数脊髓损伤患者的临床病因。因此，挫伤模型已被众多研究者广泛应用于脊髓损伤研究中3,7。目前有多种仪器可用于建立脊髓损伤挫伤模型。纽约大学（New York University, NYU）多中心动物脊髓损伤研究（MASCIS）撞击器通过落锤装置产生脊髓挫伤8。经过多次改进后，MASCIS撞击器已被广泛用于构建脊髓损伤挫伤动物模型9。然而，当MASCIS撞击杆下落并撞击脊髓时，可能产生多次损伤，从而影响脊髓损伤模型的损伤程度。此外，实现机械精度以确保仪器的准确性及造模的可重复性也存在挑战。无限地平线撞击器（infinite horizon impactors）通过控制施加于脊髓的力而非重力下落来造成挫伤10。该设备通过计算机连接传感器，直接测量撞击器与脊髓之间的冲击力；当达到预设阈值时，撞击器立即回缩，从而避免重物反弹，提高精确度10,11。然而，使用这种精密电机模式造成损伤可能导致损伤程度和功能缺陷不一致6。俄亥俄州立大学（Ohio State University, OSU）装置通过电磁驱动器以瞬时速率压迫脊髓背侧表面12,13。该装置与无限地平线撞击器类似，均采用短距离压迫方式造成脊髓损伤。但其存在多种局限性，例如初始零点的确定会因脑脊液的存在而产生误差6,14。综上所述，尽管已有多种仪器可用于构建脊髓损伤挫伤动物模型，但它们均存在一定局限性，导致动物模型的准确性和可重复性不足。因此，为了更精确、便捷且可重复地建立小鼠脊髓损伤挫伤模型，亟需一种自动化、智能化的脊髓损伤撞击装置。

我们介绍一种新型的脊髓损伤撞击器——广州暨南大学智能脊髓损伤系统（G智能SCI系统；图1），用于制备脊髓损伤挫伤模型。该设备采用激光测距仪作为定位装置，结合自动化移动平台，可根据预设的撞击参数（包括撞击速度、撞击深度和停留时间）自动完成撞击操作。自动化操作减少了人为因素的干扰，提高了动物模型的准确性和可重复性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

涉及动物的研究已通过暨南大学伦理委员会的审查和批准。

1. 动物麻醉与T10脊髓椎板切除术

  1. 本研究使用8周龄雌性成年C57/6J小鼠。通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和 diazepam (5 mg/kg)对小鼠进行麻醉。通过检测痛觉反射消失判断麻醉是否成功。在眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
  2. 使用剃毛器剃除小鼠背部毛发，暴露皮肤。用碘伏和酒精交替擦拭三遍，对皮肤进行消毒。
  3. 使用手术刀在小鼠背部正中做一条2.5 cm长的纵向切口，用镊子暴露T9-T11节段的脊柱。
  4. 使用脊柱固定器双侧固定T10关节突。确保脊柱稳定固定。剥离椎旁肌，并使用微型磨钻切除棘突和椎板，以暴露T10节段的脊髓。

使用 G smart SCI 系统对 T10 脊髓进行挫伤

  1. 打开开关，等待设备自动恢复至初始状态。将脊柱固定器放入G smart SCI系统中，并用螺钉固定。
  2. 通过操作触摸屏（图2A）设置损伤参数，包括冲击速度（1 m/s）、冲击深度（分别为三组小鼠设置0.5 mm、0.8 mm和1.1 mm）以及停留时间（500 ms）15。
  3. 移动平台，使激光测距仪对准暴露的脊髓中心（图2B）。
  4. 点击触摸屏上的“准备”按钮（图2C），撞击头将根据设定参数自动调整至特定高度，载物台会自动将脊髓撞击部位移至撞击头下方。
  5. 手动按压撞击头以进一步确定撞击位置。点击开始按钮，撞击头将根据设定参数撞击脊髓。
  6. 将小鼠从设备中取出，在体视显微镜（20倍）下观察以确认脊髓损伤情况（图3）。为判断模型构建是否成功，需观察局部充血、塌陷及脊膜破裂等现象。
  7. 使用3-0缝线逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤。将小鼠置于保温箱中，等待其恢复。

3. 术后护理

  1. 术后每天皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），持续7天。每8小时手动排空膀胱，直至膀胱功能恢复。
  2. 术后14天，拆除缝合线。

4. 脊髓损伤效应的检测

  1. 计算小鼠术后第一天的BMS评分16,17.
  2. 第30天th 术后第几天，进行动物行为学实验，包括 CatWalk、足错步和转棒实验16,17Catwalk：记录距离为45 cm；最大运行时间8 s；相机增益28.02；强度阈值0.01。足部错误：每只小鼠记录60步。转棒实验：转速20 rpm；记录小鼠跌落时间，若超过120 s则记为120 s。
  3. 术后第31天，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）对小鼠进行麻醉 地西泮 （5 mg/kg）麻醉后，用4% PFA灌注处死小鼠。小心取出脊髓，截取损伤部位上下各5 mm用于石蜡包埋。对小鼠脊髓损伤中心部位制备5 µm切片，并进行苏木精-伊红染色。17.
  4. 使用商业软件进行统计分析。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行比较；p < 0.05 被认为具有统计学意义。 < 0.05 被视为具有显著性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

对24只雌性小鼠（8周龄）进行椎板切除术，操作方法如上所述。假手术组小鼠（n=6）未接受脊髓损伤处理，其余小鼠分别接受不同深度的脊髓压迫损伤，包括0.5 mm组（n=6）、0.8 mm组（n=6）和1.1 mm组（n=6）。术后每月定期记录BMS评分（图4）。不同组别小鼠术后的BMS评分存在显著差异。术后1个月时，0.5 mm组小鼠的术后评分为4至6分，恢复水平与假手术组相似；0.8 mm组和1.1 mm组小鼠的术后评分均为1至2分。术后1个月，0.8 mm组恢复至4至6分，而1.1 mm组小鼠几乎未见恢复。

1个月后，进行动物行为学检测，包括足错步实验、转棒实验和步态分析实验。在足错步实验（图5A）中，0.5 mm组与假手术组之间的后肢足错步率无显著差异。然而，0.8 mm组的后肢足错步率与其他各组相比存在显著差异。1.1 mm组小鼠的足错步率为100%，因为其后肢无法支撑身体接触地面，与其他各组相比差异显著。在转棒实验（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

脊髓损伤可导致感觉和运动功能障碍，进而引发严重的身体和心理障碍。在中国，不同省份脊髓损伤的发病率每百万人中为14.6至60.6例18。脊髓损伤患病率的上升将给医疗系统带来更大压力。目前，针对脊髓损伤的有效治疗手段有限，因其病理机制和修复过程尚未被充分阐明19。因此，有必要建立准确且可重复的脊髓损伤动物模型，以深入研究脊髓损伤的病理机制及修复过程。为此，我们开发了一种精确、可重复且操作简便的脊髓损伤仪器。

许多设备被用于建立脊髓损伤的挫伤模型，包括 NYU-MASCIS 撞击器、无限地平线撞击器（infinite horizon impactor）和 OSU 撞击器8,9,12,13,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82102314，资助对象：ZSJ；项目编号：32170977，资助对象：HSL）以及广东省自然科学基金（项目编号：2022A1515010438，资助对象：ZSJ；项目编号：2022A1515012306，资助对象：HSL）的支持。本研究还得到暨南大学第一附属医院临床前沿技术项目（项目编号：JNU1AF-CFTP-2022-a01206，资助对象：HSL）的支持。此外，本研究也得到广州市科技计划项目（项目编号：202201020018，资助对象：HSL；项目编号：2023A04J1284，资助对象：ZSJ；项目编号：2023A03J1024，资助对象：HSL）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M PBS（粉末，pH 7.2–7.4）Solarbio Life SciencesP1010
2,2,2-三溴乙醇Macklin75-80-9
4% 多聚甲醛组织固定液Biosharp life scienceBL539A
生物显微镜LeicaLCC50 HD
CatWalk Noldus Information TechnologyCatWalk XT 9.1
盖玻片CITOTEST Scientific10212432C
包埋机常州中威电子仪器BMJ-A
无水乙醇大茂64-17-5
FootFaultScanClever Sys Inc.-
载玻片CITOTEST Scientific80302-2104
苏木精-伊红染色试剂盒碧云天生物技术C0105S
微型研磨钻 飞宇生物19-7010
小鼠脊柱固定器RWD Life Science68094
石蜡切片机Thermoshandon finesse 325
小鼠转棒仪Ugo Basile47600
体视显微镜KUY NICESZM-7045
叔戊醇Macklin75-85-4
二甲苯中国医药集团#10023418

参考文献

  1. Venkatesh, K., Ghosh, S. K., Mullick, M., Manivasagam, G., Sen, D. Spinal cord injury: pathophysiology, treatment strategies, associated challenges, and future implications. Cell and Tissue Research. 377 (2), 125-151 (2019).
  2. Chiu, C. W., Cheng, H., Hsieh, S. L. Contusion Spinal Cord Injury Rat Model. Bio Protocol. 7 (12), e2337(2017).
  3. Thygesen, M. M., Guldbæk-Svensson, F., Rasmussen, M. M., Lauridsen, H. Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl. Journal of Visualized Experiments. (152), 60337(2019).
  4. Anderson, T. E. A controlled pneumatic technique for experimental spinal cord contusion. Journal of Neuroscience Methods. 6 (4), 327-333 (1982).
  5. Allen, A. R. SURGERY OF EXPERIMENTAL LESION OF SPINAL CORD EQUIVALENT TO CRUSH INJURY OF FRACTURE DISLOCATION OF SPINAL COLUMN: A PRELIMINARY REPORT. Journal of the American Medical Association. LVII (11), 878-880 (1911).
  6. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  7. Yan, R., et al. A modified impactor for establishing a graded contusion spinal cord injury model in rats. Annals of Translational Medicine. 10 (8), 436(2022).
  8. Gruner, J. A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. Journal of Neurotrauma. 9 (2), 123-126 (1992).
  9. Ghnenis, A. B., et al. Evaluation of the Cardiometabolic Disorders after Spinal Cord Injury in Mice. Biology (Basel). 11 (4), 495(2022).
  10. Scheff, S. W., Rabchevsky, A. G., Fugaccia, I., Main, J. A., Lumpp, J. E. Jr Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device. Journal of Neurotrauma. 20 (2), 179-193 (2003).
  11. Hong, Y. R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Scientific Reports. 12 (1), 3636(2022).
  12. Noyes, D. H. Electromechanical impactor for producing experimental spinal cord injury in animals. Medical & Biological Engineering & Computing. 25 (3), 335-340 (1987).
  13. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury technique with dynamic sensitivity. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  14. Pearse, D. D., et al. Histopathological and behavioral characterization of a novel cervical spinal cord displacement contusion injury in the rat. Journal of Neurotrauma. 22 (6), 680-702 (2005).
  15. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. Journal of Visualized Experiments. (124), 54988(2017).
  16. Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A Mouse Model of Bilateral Cervical Contusion-Compression Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
  17. Ji, Z. S., et al. Highly bioactive iridium metal-complex alleviates spinal cord injury via ROS scavenging and inflammation reduction. Biomaterials. 284, 121481(2022).
  18. Chen, C., Qiao, X., Liu, W., Fekete, C., Reinhardt, J. D. Epidemiology of spinal cord injury in China: A systematic review of the chinese and english literature. Spinal Cord. 60 (12), 1050-1061 (2022).
  19. Flack, J. A., Sharma, K. D., Xie, J. Y. Delving into the recent advancements of spinal cord injury treatment: a review of recent progress. Neural Regeneration Research. 17 (2), 283-291 (2022).
  20. Khuyagbaatar, B., Kim, K., Kim, Y. H. Conversion Equation between the Drop Height in the New York University Impactor and the Impact Force in the Infinite Horizon Impactor in the Contusion Spinal Cord Injury Model. Journal of Neurotrauma. 32 (24), 1987-1993 (2015).
  21. Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic Spinal Cord Injury: An Overview of Pathophysiology, Models and Acute Injury Mechanisms. Frontiers in Neurology. 10, 282(2019).
  22. Bilgen, M. A new device for experimental modeling of central nervous system injuries. Neurorehabilitation and Neural Repair. 19 (3), 219-226 (2005).
  23. Khan, M., et al. GSNOR and ALDH2 alleviate traumatic spinal cord injury. Brain Research. 1758, 147335(2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

挫伤性损伤模型小鼠脊髓Basso小鼠评分行为学检测苏木精-伊红染色激光测距传感器转棒实验Catwalk步态分析
用于小鼠脊髓挫伤模型的自动化撞击器
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。