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用于小鼠脊髓挫伤模型的自动化撞击器

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DOI：

10.3791/65656

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2024年1月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了一种用于小鼠的新型自动化脊髓损伤挫伤装置，该装置能够精确地制备不同程度的脊髓损伤挫伤模型。

摘要

脊髓损伤（SCI）由车祸和跌倒等创伤性损伤引起，常导致永久性脊髓功能障碍。通过撞击脊髓建立脊髓损伤挫伤模型，可产生与临床实践中大多数脊髓损伤相似的病理变化。准确、可重复且操作便捷的动物模型对于脊髓损伤研究至关重要。本文介绍一种新型自动化小鼠脊髓损伤挫伤装置——广州暨南大学智能脊髓损伤系统，该系统能够准确、可重复且便捷地建立脊髓损伤挫伤模型。该系统可精确构建不同程度的脊髓损伤模型。 通过 激光测距传感器结合自动化移动平台与先进软件。我们利用该系统建立了三种程度的脊髓损伤小鼠模型，测定其Basso小鼠评分（BMS）分数，并进行行为学及染色检测，以验证该方法的准确性与可重复性。本文展示了使用该设备构建损伤模型的各个步骤，形成了一套标准化操作流程。该方法可稳定构建可重复的脊髓损伤挫伤小鼠模型，并通过简便的操作程序减少人为操作因素的影响。所建立的动物模型在研究脊髓损伤机制及相关治疗策略方面具有可靠性。

引言

脊髓损伤通常导致损伤节段以下的脊髓功能永久性障碍。其主要原因包括物体撞击脊柱和脊柱过度伸展，例如交通事故和跌倒1。由于目前针对脊髓损伤的有效治疗手段有限，利用动物模型阐明脊髓损伤的发病机制，将有助于开发适当的治疗策略。通过外力冲击脊髓所建立的脊髓损伤挫伤模型，能够产生与大多数临床脊髓损伤病例病理特征相似的动物模型2,3。因此，建立精确、可重复且操作便捷的脊髓损伤挫伤动物模型具有重要意义。

自1911年Allen首次建立脊髓损伤动物模型以来，在用于构建脊髓损伤动物模型的仪器开发方面已取得重大进展4,5。根据损伤机制，脊髓损伤模型可分为挫伤、压迫、牵张、脱位、横断或化学性损伤模型6。其中，挫伤模型通过外部力量使脊髓移位并造成损伤，最接近大多数脊髓损伤患者的临床病因。因此，挫伤模型已被众多研究者广泛应用于脊髓损伤研究中3,7。目前有多种仪器可用于建立脊髓损伤挫伤模型。纽约大学（New York University, NYU）多中心动物脊髓损伤研究（MASCIS）撞击器通过落锤装置产生脊髓挫伤8。经过多次改进后，MASCIS撞击器已被广泛用于构建脊髓损伤挫伤动物模型9。然而，当MASCIS撞击杆下落并撞击脊髓时，可能产生多次损伤，从而影响脊髓损伤模型的损伤程度。此外，实现机械精度以确保仪器的准确性及造模的可重复性也存在挑战。无限地平线撞击器（infinite horizon impactors）通过控制施加于脊髓的力而非重力下落来造成挫伤10。该设备通过计算机连接传感器，直接测量撞击器与脊髓之间的冲击力；当达到预设阈值时，撞击器立即回缩，从而避免重物反弹，提高精确度10,11。然而，使用这种精密电机模式造成损伤可能导致损伤程度和功能缺陷不一致6。俄亥俄州立大学（Ohio State University, OSU）装置通过电磁驱动器以瞬时速率压迫脊髓背侧表面12,13。该装置与无限地平线撞击器类似，均采用短距离压迫方式造成脊髓损伤。但其存在多种局限性，例如初始零点的确定会因脑脊液的存在而产生误差6,14。综上所述，尽管已有多种仪器可用于构建脊髓损伤挫伤动物模型，但它们均存在一定局限性，导致动物模型的准确性和可重复性不足。因此，为了更精确、便捷且可重复地建立小鼠脊髓损伤挫伤模型，亟需一种自动化、智能化的脊髓损伤撞击装置。

我们介绍一种新型的脊髓损伤撞击器——广州暨南大学智能脊髓损伤系统（G智能SCI系统；图1），用于制备脊髓损伤挫伤模型。该设备采用激光测距仪作为定位装置，结合自动化移动平台，可根据预设的撞击参数（包括撞击速度、撞击深度和停留时间）自动完成撞击操作。自动化操作减少了人为因素的干扰，提高了动物模型的准确性和可重复性。

方案

涉及动物的研究已通过暨南大学伦理委员会的审查和批准。

1. 动物麻醉与T10脊髓椎板切除术

  1. 本研究使用8周龄雌性成年C57/6J小鼠。通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和 diazepam (5 mg/kg)对小鼠进行麻醉。通过检测痛觉反射消失判断麻醉是否成功。在眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
  2. 使用剃毛器剃除小鼠背部毛发，暴露皮肤。用碘伏和酒精交替擦拭三遍，对皮肤进行消毒。
  3. 使用手术刀在小鼠背部正中做一条2.5 cm长的纵向切口，用镊子暴露T9-T11节段的脊柱。
  4. 使用脊柱固定器双侧固定T10关节突。确保脊柱稳定固定。剥离椎旁肌，并使用微型磨钻切除棘突和椎板，以暴露T10节段的脊髓。

使用 G smart SCI 系统对 T10 脊髓进行挫伤

  1. 打开开关，等待设备自动恢复至初始状态。将脊柱固定器放入G smart SCI系统中，并用螺钉固定。
  2. 通过操作触摸屏（图2A）设置损伤参数，包括冲击速度（1 m/s）、冲击深度（分别为三组小鼠设置0.5 mm、0.8 mm和1.1 mm）以及停留时间（500 ms）15。
  3. 移动平台，使激光测距仪对准暴露的脊髓中心（图2B）。
  4. 点击触摸屏上的“准备”按钮（图2C），撞击头将根据设定参数自动调整至特定高度，载物台会自动将脊髓撞击部位移至撞击头下方。
  5. 手动按压撞击头以进一步确定撞击位置。点击开始按钮，撞击头将根据设定参数撞击脊髓。
  6. 将小鼠从设备中取出，在体视显微镜（20倍）下观察以确认脊髓损伤情况（图3）。为判断模型构建是否成功，需观察局部充血、塌陷及脊膜破裂等现象。
  7. 使用3-0缝线逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤。将小鼠置于保温箱中，等待其恢复。

3. 术后护理

  1. 术后每天皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），持续7天。每8小时手动排空膀胱，直至膀胱功能恢复。
  2. 术后14天，拆除缝合线。

4. 脊髓损伤效应的检测

  1. 计算小鼠术后第一天的BMS评分16,17.
  2. 第30天th 术后第几天，进行动物行为学实验，包括 CatWalk、足错步和转棒实验16,17Catwalk：记录距离为45 cm；最大运行时间8 s；相机增益28.02；强度阈值0.01。足部错误：每只小鼠记录60步。转棒实验：转速20 rpm；记录小鼠跌落时间，若超过120 s则记为120 s。
  3. 术后第31天，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）对小鼠进行麻醉 地西泮 （5 mg/kg）麻醉后，用4% PFA灌注处死小鼠。小心取出脊髓，截取损伤部位上下各5 mm用于石蜡包埋。对小鼠脊髓损伤中心部位制备5 µm切片，并进行苏木精-伊红染色。17.
  4. 使用商业软件进行统计分析。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行比较；p < 0.05 被认为具有统计学意义。 < 0.05 被视为具有显著性。

结果

对24只雌性小鼠（8周龄）进行椎板切除术，操作方法如上所述。假手术组小鼠（n=6）未接受脊髓损伤处理，其余小鼠分别接受不同深度的脊髓压迫损伤，包括0.5 mm组（n=6）、0.8 mm组（n=6）和1.1 mm组（n=6）。术后每月定期记录BMS评分（图4）。不同组别小鼠术后的BMS评分存在显著差异。术后1个月时，0.5 mm组小鼠的术后评分为4至6分，恢复水平与假手术组相似；0.8 mm组和1.1 mm组小鼠的术后评分均为1至2分。术后1个月，0.8 mm组恢复至4至6分，而1.1 mm组小鼠几乎未见恢复。

1个月后，进行动物行为学检测，包括足错步实验、转棒实验和步态分析实验。在足错步实验（图5A）中，0.5 mm组与假手术组之间的后肢足错步率无显著差异。然而，0.8 mm组的后肢足错步率与其他各组相比存在显著差异。1.1 mm组小鼠的足错步率为100%，因为其后肢无法支撑身体接触地面，与其他各组相比差异显著。在转棒实验（图5B）中，记录了不同组别小鼠坠落前的潜伏时间。0.8 mm组和1.1 mm组与其他组相比均存在显著差异，但假手术组与0.5 mm组结果相似。在步态分析实验（图6）中，记录并分析了不同组别小鼠的步态规律性指数和后肢最大接触面积。不同组小鼠之间的规律性指数和后肢最大接触面积均存在显著差异，提示不同脊髓损伤深度的小鼠在行走功能上存在显著差异。因此，利用该装置可成功建立具有不同脊髓损伤深度且后肢功能存在显著差异的小鼠模型。

最后，我们切取了小鼠的脊髓（图7A），并制备切片进行苏木精-伊红（HE）染色（图7C）。在脊髓图像和HE染色切片中均观察到不同程度的损伤。综上所述，我们利用所提出的仪器成功建立了不同等级的脊髓损伤小鼠模型。

配备冲击头、激光测距仪、微驱动器和触摸屏控制的力学测试装置
图1中国广州暨南大学智能脊髓损伤系统（G智能SCI系统） 固定脊柱固定器以将小鼠固定在载物台上。设定撞击参数 通过 触摸屏。使用侧向微调驱动器调整载体的侧向位置，并通过触摸屏调节额向位置。激光测距仪用于确认冲击位置并测量冲击高度，以确保冲击头能够按照设定的打击位置和深度精确撞击。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显示实验装置中冲击参数设置和运动控制的触摸屏界面。
图2：操作触摸屏界面。（A）在参数页面中，可设置损伤参数，包括冲击速度（0.5–2.0 m/s）、冲击深度（0–3 mm）和停留时间（500–2 ms）。（B）在移动页面中，可设置冲击头高度和脊髓固定器位置。（C）在准备页面中，点击准备按钮后，系统将根据设定参数自动调整冲击头和载物台至指定位置；点击开始按钮后，冲击头将依据设定参数撞击脊髓。请点击此处查看该图的放大版本。

骨缺损愈合比较；四阶段实验；不同钻孔尺寸的术后视图。
图3：损伤后的脊髓。（A）假手术组。脊柱固定器固定了T10椎体，经椎板切除术后暴露脊髓，但未造成损伤。（B）0.5 mm组。脊髓在0.5 mm深度撞击后出现轻微损伤，并伴有少量充血。（C）0.8 mm组。脊髓在0.8 mm深度撞击后出现中度损伤，并有明显充血。（D）1.1 mm组。脊髓在1.1 mm深度撞击后出现严重损伤，并伴有大量充血。请点击此处查看该图的放大版本。

BMS 评分曲线图，天数 vs 评分；假手术组 vs 0.5、0.8、1.1 mm；统计分析；随时间进展情况
图4：BMS 评分结果。 小鼠的 BMS 评分从术后第1天记录至术后1个月（n = 6 /组）。采用单因素方差分析进行比较，*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。 请点击此处查看该图的高清版本。

运动协调性评估结果；柱状图比较后肢踩踏错误次数和转杆仪上的停留时间。
图5：踩踏实验与转杆实验。（A）不同脊髓损伤程度小鼠的后肢踩踏错误次数（每组 n = 6）。采用单因素方差分析进行比较，*** p < 0.001。（B）不同脊髓损伤程度小鼠在加速转杆仪上的跌落潜伏期比较（每组 n = 6）。采用单因素方差分析进行比较，* p < 0.05，*** p < 0.001。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

足迹模式、3D打印强度图、柱状图；步态分析、规则性指数、接触面积。
图6：Catwalk测试。（A, C）不同程度脊髓损伤小鼠的规则性指数（n = 6 /组）。* p < 0.05，*** p < 0.001，采用单因素方差分析比较。（B, D）后肢最大接触面积由软件自动分析（n = 6 /组）。** p < 0.01，*** p < 0.001，采用单因素方差分析比较。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。请点击此处查看此图的放大版本。

脊髓损伤对比、测量示意图、神经组织切片、组织学分析。
图7：脊髓及苏木精-伊红（H&E）染色。 （A）术后1个月不同损伤程度小鼠的脊髓情况。（B）放大图像。（C）不同损伤程度小鼠脊髓损伤部位的H&E染色结果。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

脊髓损伤可导致感觉和运动功能障碍，进而引发严重的身体和心理障碍。在中国，不同省份脊髓损伤的发病率每百万人中为14.6至60.6例18。脊髓损伤患病率的上升将给医疗系统带来更大压力。目前，针对脊髓损伤的有效治疗手段有限，因其病理机制和修复过程尚未被充分阐明19。因此，有必要建立准确且可重复的脊髓损伤动物模型，以深入研究脊髓损伤的病理机制及修复过程。为此，我们开发了一种精确、可重复且操作简便的脊髓损伤仪器。

许多设备被用于建立脊髓损伤的挫伤模型，包括 NYU-MASCIS 撞击器、无限地平线撞击器（infinite horizon impactor）和 OSU 撞击器8,9,12,13,20。这些设备操作复杂，且由于操作人员熟练程度不同，可能产生较大的误差。此外，这些设备在设计上存在多种缺陷，导致其准确性和可重复性较差6。脊髓损伤的具体位置决定了其严重程度，因此在建立脊髓损伤模型的过程中，定位方法决定了建模的准确性21。G smart SCI 系统采用激光测距仪定位脊髓损伤部位，并根据测距数据调节撞击头的高度，以设定打击深度。另一种采用激光定位的撞击装置是印第安纳大学医学院开发的路易斯维尔损伤系统装置（Louisville injury system apparatus, LISA）撞击器15。尽管 LISA 使用了激光定位，但仍需人工判断并调节撞击头的高度以实现可控打击深度，从而增加了人为干预。同时，LISA 采用气动打击和笔记本电脑控制，需要更大的实验空间，提高了运行成本10。G smart SCI 系统通过半自动化操作流程减少了人为误差，并因其轻量化设计而便于移动。

根据设定的参数，该设备可精确损伤小鼠的脊髓，从而建立不同严重程度的脊髓损伤模型。本研究中，具有不同程度脊髓损伤的小鼠在后肢功能上表现出显著差异。重要的是，该检测方法具有可重复性，能够稳定地构建脊髓损伤（SCI）模型。

在该实验方案中，最关键的步骤包括准确执行椎板切除术、稳定小鼠脊柱，以及使用激光进行精确定位，以确保实验的准确性和可重复性。在设计过程中，我们对设备进行了一些改进：发现撞击后载物台难以快速返回测距点，因此增加了返回测距点的按钮；此外，原有设备无法快速调节所需参数，故我们添加了数字键盘用于输入。第一版中电磁驱动充电较慢的问题也已得到改进。目前该设备仅限于建立胸段脊髓损伤挫伤小鼠模型。未来还需开展研究，以支持该仪器在大鼠脊髓损伤模型或颈段脊髓损伤模型建立中的应用。

此外，来自堪萨斯大学医学院的 Bilgen 博士描述了一种计算机控制的撞击装置，该装置可诱导中枢神经系统（CNS）损伤，包括创伤性脑损伤（TBI）和脊髓损伤（SCI）22。与我们的装置类似，该装置也采用了多种商业化设备和系统，因此已成功实现商业化并得到应用23。我们所描述的设备具有自动化、精确性和便捷性的特点，未来有望实现商业化，惠及更多脊髓损伤研究领域的科研人员。

综上所述，我们设计了一种用于建立脊髓损伤挫伤模型的自动化小鼠脊髓撞击器。该设备通过激光测距仪提高了准确性，并通过自动化操作流程减少了人为误差。此外，G smart SCI 系统相比其他设备更易于操作和携带，为脊髓损伤研究带来了便利。重要的是，该设备可根据实验需求，准确且可重复地建立不同类型的小鼠脊髓损伤模型。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82102314，资助对象：ZSJ；项目编号：32170977，资助对象：HSL）以及广东省自然科学基金（项目编号：2022A1515010438，资助对象：ZSJ；项目编号：2022A1515012306，资助对象：HSL）的支持。本研究还得到暨南大学第一附属医院临床前沿技术项目（项目编号：JNU1AF-CFTP-2022-a01206，资助对象：HSL）的支持。此外，本研究也得到广州市科技计划项目（项目编号：202201020018，资助对象：HSL；项目编号：2023A04J1284，资助对象：ZSJ；项目编号：2023A03J1024，资助对象：HSL）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M PBS（粉末，pH 7.2–7.4）Solarbio Life SciencesP1010
2,2,2-三溴乙醇Macklin75-80-9
4% 多聚甲醛组织固定液Biosharp life scienceBL539A
生物显微镜LeicaLCC50 HD
CatWalk Noldus Information TechnologyCatWalk XT 9.1
盖玻片CITOTEST Scientific10212432C
包埋机常州中威电子仪器BMJ-A
无水乙醇大茂64-17-5
FootFaultScanClever Sys Inc.-
载玻片CITOTEST Scientific80302-2104
苏木精-伊红染色试剂盒碧云天生物技术C0105S
微型研磨钻 飞宇生物19-7010
小鼠脊柱固定器RWD Life Science68094
石蜡切片机Thermoshandon finesse 325
小鼠转棒仪Ugo Basile47600
体视显微镜KUY NICESZM-7045
叔戊醇Macklin75-85-4
二甲苯中国医药集团#10023418

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