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方法文章

通过甲状腺激素作用指示小鼠在体表征内分泌干扰化学物效应

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DOI：

10.3791/65657

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2023年10月6日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Cell Metabolism, Institute of Experimental Medicine, 2János Szentágothai PhD School of Neurosciences, Semmelweis University, 3Laboratory of Integrative Neuroendocrinology, Institute of Experimental Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

甲状腺激素作用指示小鼠模型的建立旨在利用其内源性调控机制，实现对局部甲状腺激素作用的组织特异性定量。最近的研究表明，该模型适用于通过离体（ex vivo）和体内（in vivo）方法，表征与甲状腺激素代谢相互作用的内分泌干扰化学物质。

摘要

甲状腺激素（TH）在细胞代谢和组织功能中发挥关键作用。TH 的稳态易受到内分泌干扰物（EDCs）的影响，这些物质可扰乱激素的生成或作用。许多环境污染物属于 EDCs，对人类健康和农业生产构成日益严重的威胁。这促使人们更加需要建立适当的检测系统，以评估潜在 EDCs 的效应。然而，现有方法面临诸多挑战。大多数检测系统依赖由多种、且常为复杂调控过程所调节的内源性标志物，因而难以区分直接效应与间接效应。此外， 体外 测试系统缺乏哺乳动物内分泌干扰物代谢和药代动力学的生理复杂性。此外，环境内分泌干扰物的暴露通常涉及多种化合物的混合物，包括 体内 产生的代谢物，因此相互作用的可能性不容忽视。这种复杂性使得环境内分泌干扰物（EDC）的表征变得困难。甲状腺激素作用指示小鼠（Thyroid Hormone Action Indicator, THAI）是一种转基因模型，携带甲状腺激素（TH）响应型荧光素酶报告系统，可用于评估组织特异性的TH作用。通过定量组织样本中荧光素酶报告基因的表达，可评价化学物质对局部甲状腺激素作用的组织特异性影响。此外，结合 体内 成像技术，THAI小鼠模型可用于对活体动物中潜在内分泌干扰物（EDCs）的影响进行纵向研究。该方法为测试长期暴露、复杂处理方案或撤药效应提供了有力工具，因为它能够在同一动物体内随时间推移评估局部甲状腺激素作用的变化。本报告描述了以下过程 体内 对THAI小鼠进行成像测量。本文讨论的方案重点在于建立并成像甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退小鼠模型，这些模型可用作对照。研究人员可根据具体需求调整或扩展所述处理方法，为后续研究提供基础性方法。

引言

甲状腺激素（TH）信号通路是细胞代谢的基本调控因子，对正常发育以及成年期组织的最佳功能至关重要1。在组织内部，TH的作用由复杂的分子机制精密调控，从而实现局部TH水平的组织特异性维持。不同组织对循环TH水平的相对自主性具有重要意义2,3,4。

许多化学物质可能干扰内分泌功能，并作为污染物存在于环境中。这些分子可能通过废水和农业生产进入食物链，从而影响牲畜和人类的健康，这一问题日益引起关注5,6,7。

解决这一问题的主要挑战之一在于所涉及化合物的数量庞大，其中包括已获授权的以及虽已被禁用但仍持续存在的分子。近年来，人们已投入大量努力开发用于筛查和鉴定各种化学物质干扰潜力的检测系统8,9,10,11。尽管这些方法在高通量筛选数千种化合物并识别潜在威胁方面表现出色，但要确定人类暴露于这些分子所造成的危害，仍必须对这些分子特定的in vivo效应进行深入分析。因此，在研究和表征内分泌干扰物（EDCs）时，需要采用多方面的综合方法。

在甲状腺激素（TH）调节的背景下，理解内分泌干扰物（EDC）暴露对不同组织的特异性影响，需要量化局部的TH活性。尽管已开发出多种用于此目的的体内模型，但大多数模型依赖内源性标志物作为其输出指标。尽管这些标志物具有生理相关性，但它们受到多种直接和间接调控机制的影响，使其结果解读更加困难。因此，在组织水平上表征EDC对TH调节的影响仍是一个重大挑战12,13。

为解决测量组织特异性甲状腺激素（TH）信号传导的难题，近期开发了甲状腺激素作用指示剂（Thyroid Hormone Action Indicator, THAI）小鼠模型。该模型能够在内源性条件下特异性地量化局部TH作用的变化。研究人员将一个对TH作用调控高度敏感的荧光素酶转基因导入小鼠基因组14。该模型已证明在回答多种需要量化局部组织TH信号变化的研究问题方面具有有效性14,15,16,17,18。

识别THAI模型的一个潜在用途是表征环境内分泌干扰物（EDCs）对甲状腺激素（TH）信号通路的组织特异性效应。该模型最近已成功用于研究四溴双酚A和地克珠利对TH信号通路的组织特异性影响。15. 本文提供了利用以下基线实验方案 体内 以THAI模型作为检测系统，利用成像技术表征干扰甲状腺功能的内分泌干扰物。该方法基于荧光素-荧光素酶反应的生物发光特性。本质上，转基因表达的荧光素酶可催化外源给予的荧光素发生氧化反应，产生的发光信号强度与组织中荧光素酶的含量成正比图1因此，所测定的生物学反应为荧光素酶活性，该指标已被验证为评估局部甲状腺激素作用的合适方法。14尽管THAI模型几乎适用于所有组织中甲状腺激素作用的定量分析， 体内 成像主要关注小肠中的甲状腺激素作用（腹侧成像）以及肩胛间棕色脂肪组织（BAT，背侧成像）14.

该方法的一个显著优势是 体内 成像技术的优势在于无需通过牺牲动物来进行测量，这使得研究者能够设计纵向和随访实验，作为自身对照研究，从而减少个体间偏差以及动物使用数量。这一特点在内分泌干扰物（EDC）表征中尤为重要，该方法在此方面的优势与多功能性此前已有报道。14,15.

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方案

本方案已通过实验医学研究所动物福利委员会的审查和批准（PE/EA/1490-7/2017，PE/EA/106-2/2021）。所展示的数据来自FVB/Ant背景14、3月龄雄性THAI小鼠（每组n = 3-6）。FVB/Ant背景的THAI动物皮肤上常出现高度色素沉着的斑点，可能干扰测量结果。因此，在去除毛发后，应检查成像区域皮肤上是否存在色素斑点。除非实验有特殊要求（如特定饮食），动物无需特殊的饲养条件。

1. 甲状腺功能亢进的治疗

注意：此处提供了一种在小鼠中诱导甲状腺功能亢进的通用实验方案。美国甲状腺协会（ATA）指南19对相关方法的背景进行了详细说明，并提到了其他可选方法。

  1. 溶解T3（3,5,3'-三碘甲腺原氨酸，参见 材料表) 溶于40 mM NaOH中，配制成浓度为5-10 mg/mL的储存液。
  2. 用生理盐水将储备液稀释至终浓度为 0.1 µg/µL。
  3. 将稀释后的T3溶液以每克体重10 µL的体积，经腹腔注射（i.p.）注入清醒动物体内。24小时后，动物被视为甲状腺功能亢进。
    注意：T3 处理可用其他任何类型的处理替代。处理方式不影响该方案的流程。 体内 成像

2. 甲状腺功能减退治疗

注意：此处仅提供在小鼠中诱导甲状腺功能减退症的一般实验方案。ATA 指南19 详细阐述了相关方法的背景，并提到了其他可选方案。

  1. 将饮食更换为无碘饲料，并在饮水中添加 KClO4 和甲巯咪唑（0.01% 甲巯咪唑，0.05% KClO4）（参见材料表）。
  2. 定期更换饮水溶液（每2-3天一次），使用新鲜配制的溶液，因为甲巯咪唑对光敏感且易快速降解。
  3. 治疗时间至少持续2周，但不超过4周。动物会出现体重下降和不适表现。若动物几乎不动、毛发大量脱落或意识严重减弱，应采用人道终点，按照机构批准的方案实施安乐死。
  4. 当与其他治疗联合使用时，应持续进行甲状腺功能减退治疗，以防止甲状腺功能减退可能恢复。

3. 体内成像

  1. 启动与之兼容的软件 体内 成像系统（参见 材料表).
  2. 登录并等待 "成像向导" 面板以加载。它是窗口左下角的一个较小面板。
  3. 在 "成像向导" 点击以启动相机冷却 初始化 在 "图像向导面板". 这将使仪器运行设置程序，并等待其完成。 "成像向导面板" 变为蓝色，当相机温度足够低且仪器就绪时，面板上的绿灯将亮起。
  4. 将加热垫的温度设置为30–37 °C，以保持被测动物的体温。
    注意：在等待相机温度达到最佳状态期间，请继续执行实验方案。
  5. 请勿在仪器附近饲养或处理动物。避免有过多毛发在仪器周围空气中漂浮。
  6. 用氯胺酮-赛拉嗪腹腔注射麻醉1-3只动物（氯胺酮50 mg/kg体重，赛拉嗪10 mg/kg体重，参见 材料表或者，如果配备了异氟烷麻醉系统，请遵循机构批准的方案使用异氟烷麻醉，替代氯胺酮-赛拉嗪混合物。
    注意：甲状腺功能减退小鼠对氯胺酮-赛拉嗪更为敏感；应使用半剂量。
  7. 麻醉期间使用眼用保护凝胶。
  8. 通过捏压足垫检查屈足反射。无屈足反射表明动物已达到外科麻醉平面。
  9. 麻醉生效后，使用最合适的脱毛方法（如脱毛器、剃刀、脱毛膏等）去除成像部位的毛发。确保成像部位无残留毛发，以防止生物发光信号散射。
  10. 溶解Na-荧光素（见 材料表) 溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为15 mg/mL。荧光素对光敏感，应避免直接暴露于光线下。将溶液储存于棕色管中或用铝箔包裹。
  11. 对剃毛动物经腹腔注射每克体重10 µL的荧光素溶液
  12. 将动物放置于仪器中，使相机中心点标记“+”与垫子上的对应位置对齐。若不确定放置是否准确，可通过查看网格线并拍摄一张“照片”进行确认。
  13. 底物给药后等待15分钟，再进行第一次测量。在此期间，设置成像时间 "图像向导" 将面板设置为3分钟以检测发光，并勾选相应的复选框 照片 和 发光“照片”必须与发光信号同时获取，以确定所测信号的来源。
    注意：底物摄取和组织分布需 15 分钟以达到最佳效果。荧光素注射后 15–20 分钟，发光信号达到平台期。平台期后信号开始缓慢下降。
  14. 点击进行第一次测量 测量 在 "成像向导" 面板
  15. 如果同时进行腹侧和背侧成像，在完成第一部分成像后，立即重新摆放动物位置，以便对第二个身体部位进行成像。
  16. 成像完成后，将动物放回笼中，并对下一组动物继续进行实验。
  17. 让动物恢复，通常最多需要1-2小时。将装有温水的试管放置在动物附近以促进恢复，并监测呼吸和灌注等生命体征。
  18. 决定被测量动物的去向。本文所呈现的数据中，被测量动物依据机构批准的安乐死程序进行处死 离体 测量。然而，这并非必要。应考虑实施安乐死或进行后续实验是否符合伦理。

4. 数据分析

  1. 在软件中打开 "ClickInfo" 文件。窗口右侧将打开一个名为 "Tool Palette" 的面板，用于图像分析与编辑。
  2. 在图像左上角将比例转换为辐射亮度。
  3. 点击 “Image Adjust"。
  4. 确定图像的最佳 binning 和颜色标度。确保所有图像使用相同的设置。
  5. 在 "ROI tools" 上点击 "Tool palette"。
  6. 通过点击 "ROI tools" 中的 "Place ROI" 来选择感兴趣区域。根据实验设计，使用相同大小或不同大小的感兴趣区域均可能具有意义。
  7. 点击 "Measure ROIs"。将弹出一个新窗口，显示已放置的感兴趣区域的数据。使用 Windows 快捷键 ctr + c-ctrl + v 将数据导出至所选的数据整理或统计分析软件中。
  8. 数据可导出为总通量或平均辐射亮度。根据当前实验条件选择最相关的变量。
  9. 根据实验设计继续进行数据分析。建议对每个动物单独计算（处理值－背景值）作为“单个动物中的测量效应""。

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结果

通常，测得的辐射亮度范围在10的数量级之间5 至 1010 p/s/cm2然而，同一图像内不同动物之间以及不同图像之间的精确数值可能存在差异。因此，直接比较原始数据可能会产生误导。在所有实验中建立对照和背景信号至关重要，故强烈推荐采用自身对照设计。

图2展示了涉及低甲状腺素、正常甲状腺素和高甲状腺素小鼠的实验设置中，从腹侧和背侧视图获得的代表性图像和数据。在低甲状腺素小鼠中信号最低，通常低于颜色标尺的下限。

无毛区域（如足垫、尾部和鼻部）表现出相对较高的基础信号。重要的是，荧光素酶信号受甲状腺激素（TH）状态的影响，如图2所示。有趣的是，

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讨论

内分泌干扰物（EDCs）对人类健康的威胁已得到广泛认可；然而，EDCs 的研究面临巨大挑战。这些挑战部分源于内分泌系统的复杂性。许多 EDCs 被发现可同时干扰多个内分泌系统22。此外，在甲状腺激素（TH）代谢背景下，由于不同组织在调控 TH 作用方面存在特异性差异，因而增加了另一层复杂性。这种复杂性为通过表征 TH 在不同组织中的作用来扩展 TH 信号评估提供了新的视角。化合物的代谢进一步加剧了这一挑战，因为代谢过程可能增强或减弱其对内分泌系统的影响。需要指出的是，目前用于识别化合物的筛选方法已较为成熟且性能高效8,11。然而，仍缺乏能够表征已识别化合物在组织特异性效应及其后果的测试系统。

THAI小鼠模型的建立旨在应对表征组织特异性甲状腺激素代谢的挑战。该模型在多种条件下的应用潜力已得到证实14,15

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由项目编号RRF-2.3.1-21-2022-00011资助，该项目名为“国家转化神经科学实验室”，在欧盟复苏与韧性基金的支持下，通过赛切尼计划Plus框架实施。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,5,3'-三碘甲腺原氨酸（T3）MerckT2877
实验动物，小鼠THAI 小鼠
眼部保护凝胶Oculotect1000 IU/g
Falcon 管Thermo Fisher Scientific50 mL 容量
无碘饲料Research Diets定制
IVIS Lumina II 活体成像系统Perkin Elmer-
氯胺酮VetcentreE1857
Living Image 软件 4.5Perkin Elmer-随仪器提供
量筒250 mL
甲巯咪唑MerckM8506
微量离心管Eppendorf用于稀释处理试剂
NaClO4Merck71852
Na-荧光素，底物Goldbio103404-75-7
NaOHMerck101052833
磷酸盐缓冲液Chem Cruzsc-362302
移液器Gilson用于稀释处理试剂
移液器吸头Axygen用于稀释处理试剂
剃须膏/脱毛剂/剃须刀根据个人偏好选择
注射器B Braun1 mL 容量
注射器针头B Braun0.3 × 12 mm
赛拉嗪VetcentreE1852

参考文献

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