通过甲状腺激素作用指示小鼠在体表征内分泌干扰化学物效应

摘要

甲状腺激素作用指示小鼠模型的建立旨在利用其内源性调控机制，实现对局部甲状腺激素作用的组织特异性定量。最近的研究表明，该模型适用于通过离体（ex vivo）和体内（in vivo）方法，表征与甲状腺激素代谢相互作用的内分泌干扰化学物质。

摘要

甲状腺激素（TH）在细胞代谢和组织功能中发挥关键作用。TH 的稳态易受到内分泌干扰物（EDCs）的影响，这些物质可扰乱激素的生成或作用。许多环境污染物属于 EDCs，对人类健康和农业生产构成日益严重的威胁。这促使人们更加需要建立适当的检测系统，以评估潜在 EDCs 的效应。然而，现有方法面临诸多挑战。大多数检测系统依赖由多种、且常为复杂调控过程所调节的内源性标志物，因而难以区分直接效应与间接效应。此外， 体外 测试系统缺乏哺乳动物内分泌干扰物代谢和药代动力学的生理复杂性。此外，环境内分泌干扰物的暴露通常涉及多种化合物的混合物，包括 体内 产生的代谢物，因此相互作用的可能性不容忽视。这种复杂性使得环境内分泌干扰物（EDC）的表征变得困难。甲状腺激素作用指示小鼠（Thyroid Hormone Action Indicator, THAI）是一种转基因模型，携带甲状腺激素（TH）响应型荧光素酶报告系统，可用于评估组织特异性的TH作用。通过定量组织样本中荧光素酶报告基因的表达，可评价化学物质对局部甲状腺激素作用的组织特异性影响。此外，结合 体内 成像技术，THAI小鼠模型可用于对活体动物中潜在内分泌干扰物（EDCs）的影响进行纵向研究。该方法为测试长期暴露、复杂处理方案或撤药效应提供了有力工具，因为它能够在同一动物体内随时间推移评估局部甲状腺激素作用的变化。本报告描述了以下过程 体内 对THAI小鼠进行成像测量。本文讨论的方案重点在于建立并成像甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退小鼠模型，这些模型可用作对照。研究人员可根据具体需求调整或扩展所述处理方法，为后续研究提供基础性方法。

引言

甲状腺激素（TH）信号通路是细胞代谢的基本调控因子，对正常发育以及成年期组织的最佳功能至关重要¹。在组织内部，TH的作用由复杂的分子机制精密调控，从而实现局部TH水平的组织特异性维持。不同组织对循环TH水平的相对自主性具有重要意义^2,3,4。

许多化学物质可能干扰内分泌功能，并作为污染物存在于环境中。这些分子可能通过废水和农业生产进入食物链，从而影响牲畜和人类的健康，这一问题日益引起关注^5,6,7。

解决这一问题的主要挑战之一在于所涉及化合物的数量庞大，其中包括已获授权的以及虽已被禁用但仍持续存在的分子。近年来，人们已投入大量努力开发用于筛查和鉴定各种化学物质干扰潜力的检测系统^8,9,10,

方案

本方案已通过实验医学研究所动物福利委员会的审查和批准（PE/EA/1490-7/2017，PE/EA/106-2/2021）。所展示的数据来自FVB/Ant背景¹⁴、3月龄雄性THAI小鼠（每组n = 3-6）。FVB/Ant背景的THAI动物皮肤上常出现高度色素沉着的斑点，可能干扰测量结果。因此，在去除毛发后，应检查成像区域皮肤上是否存在色素斑点。除非实验有特殊要求（如特定饮食），动物无需特殊的饲养条件。

1. 甲状腺功能亢进的治疗

注意：此处提供了一种在小鼠中诱导甲状腺功能亢进的通用实验方案。美国甲状腺协会（ATA）指南¹⁹对相关方法的背景进行了详细说明，并提到了其他可选方法。

1. 溶解T3（3,5,3'-三碘甲腺原氨酸，参见 材料表) 溶于40 mM NaOH中，配制成浓度为5-10 mg/mL的储存液。
2. 用生理盐水将储备液稀释至终浓度为 0.1 µg/µL。
3. 将稀释后的T3溶液以每克体重10 µL的体积，经腹腔注射（i.p.）注入清醒动物体内。24小时后，动物被视为甲状腺功能亢进。
   注意：T3 处理可用其他任何类型的处理替代。处理方式不影响该方案的流程。 体内 成像

结果

通常，测得的辐射亮度范围在10的数量级之间⁵ 至 10¹⁰ p/s/cm²然而，同一图像内不同动物之间以及不同图像之间的精确数值可能存在差异。因此，直接比较原始数据可能会产生误导。在所有实验中建立对照和背景信号至关重要，故强烈推荐采用自身对照设计。

图2展示了涉及低甲状腺素、正常甲状腺素和高甲状腺素小鼠的实验设置中，从腹侧和背侧视图获得的代表性图像和数据。在低甲状腺素小鼠中信号最低，通常低于颜色标尺的下限。

无毛区域（如足垫、尾部和鼻部）表现出相对较高的基础信号。重要的是，荧光素酶信号受甲状腺激素（TH）状态的影响，如图2所示。有趣的是，

讨论

内分泌干扰物（EDCs）对人类健康的威胁已得到广泛认可；然而，EDCs 的研究面临巨大挑战。这些挑战部分源于内分泌系统的复杂性。许多 EDCs 被发现可同时干扰多个内分泌系统²²。此外，在甲状腺激素（TH）代谢背景下，由于不同组织在调控 TH 作用方面存在特异性差异，因而增加了另一层复杂性。这种复杂性为通过表征 TH 在不同组织中的作用来扩展 TH 信号评估提供了新的视角。化合物的代谢进一步加剧了这一挑战，因为代谢过程可能增强或减弱其对内分泌系统的影响。需要指出的是，目前用于识别化合物的筛选方法已较为成熟且性能高效^8,11。然而，仍缺乏能够表征已识别化合物在组织特异性效应及其后果的测试系统。

THAI小鼠模型的建立旨在应对表征组织特异性甲状腺激素代谢的挑战。该模型在多种条件下的应用潜力已得到证实^14,15

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,5,3'-三碘甲腺原氨酸（T3）	Merck	T2877
实验动物，小鼠			THAI 小鼠
眼部保护凝胶	Oculotect		1000 IU/g
Falcon 管	Thermo Fisher Scientific		50 mL 容量
无碘饲料	Research Diets	定制
IVIS Lumina II 活体成像系统	Perkin Elmer	-
氯胺酮	Vetcentre	E1857
Living Image 软件 4.5	Perkin Elmer	-	随仪器提供
量筒			250 mL
甲巯咪唑	Merck	M8506
微量离心管	Eppendorf		用于稀释处理试剂
NaClO4	Merck	71852
Na-荧光素，底物	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
磷酸盐缓冲液	Chem Cruz	sc-362302
移液器	Gilson		用于稀释处理试剂
移液器吸头	Axygen		用于稀释处理试剂
剃须膏/脱毛剂/剃须刀			根据个人偏好选择
注射器	B Braun		1 mL 容量
注射器针头	B Braun		0.3 × 12 mm
赛拉嗪	Vetcentre	E1852