假病毒（PVs）是一类复制缺陷型病毒颗粒，可用于在比操作真实病毒更安全的条件下研究宿主与病毒之间的相互作用。本文展示了一项详细方案，说明如何利用SARS-CoV-2假病毒检测新冠疫苗接种后患者血清的中和能力。
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方法文章
假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
假病毒（PVs）是一种分子工具，除在基因治疗中用于递送目的基因这一较为人熟知的应用外，还可用于研究宿主与病毒之间的相互作用，并检测血清样本的中和能力。假病毒不具备复制能力，因为其病毒基因组被分割在不同的质粒中，且这些质粒不会被整合进假病毒颗粒中。这一安全且多功能的系统使得假病毒可在生物安全二级实验室中使用。本文介绍一种基于三种质粒的慢病毒假病毒通用制备方法：（1）携带报告基因的骨架质粒，用于监测感染过程；（2）包装质粒，携带生成假病毒所需的所有结构蛋白基因；（3）包膜表面糖蛋白表达质粒，决定病毒的嗜性并介导病毒进入宿主细胞。在本研究中，使用严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白作为包膜糖蛋白，用于制备非复制型SARS-CoV-2假病毒慢病毒。
简而言之，采用标准方法将三种不同的质粒共转染至包装细胞（HEK293T）中。转染48小时后，收集含有假病毒（PVs）的上清液，过滤后储存于-80 °C。通过检测感染后48小时靶细胞系中报告基因（荧光素酶）的表达情况，来评估SARS-CoV-2假病毒的感染性。相对发光单位（RLUs）数值越高，表明感染/转导效率越高。此外，将具有感染性的假病毒加入系列稀释的血清样本中，以研究假病毒进入靶细胞过程中的中和作用，该过程通过RLU强度的降低来衡量：RLU值越低，代表中和活性越高。
引言
假病毒（PVs）是微生物学中用于研究宿主-病毒以及病原体-病原体相互作用的分子工具1,2,3,4。PVs 包含一个内层部分，即保护病毒基因组的病毒核心，以及一个外层部分，即位于病毒表面决定其嗜性的包膜糖蛋白5。假病毒在靶细胞中不具备复制能力，因其不包含生成新病毒颗粒所需的全部遗传信息。这种独特的特性组合使 PVs 成为野生型病毒的一种安全替代方案。而野生型病毒具有高度致病性，不能在 BSL 2 实验室中用于分析6。
可通过报告基因监测假病毒（PVs）的感染性，该基因通常编码荧光蛋白（GFP、RFP、YFP）或产生化学发光产物的酶（荧光素酶）。该报告基因包含在用于假病毒生产的质粒之一中，并被整合至假病毒的基因组中7。
目前存在多种类型的假病毒（PV）核心，包括基于HIV-1基因组的慢病毒衍生颗粒。相较于其他载体平台，基于HIV-1的假病毒最大的优势在于其能够天然地整合到靶细胞的基因组中。8
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方案
本方案已获得维罗纳大学伦理委员会批准，并遵循其指南（批准协议编号 1538）。已从参与研究的人类受试者获得知情书面同意。全血样本采集自正在接种抗 SARS-CoV-2 疫苗的医护人员（HCW）志愿者。这些样本采集于含有抗凝剂的塑料管中，用于后续血清的分离15。
以下所有操作均须在二级生物安全柜中进行，并在无菌条件下操作。病毒操作必须小心谨慎，所有废弃物必须用稀释的漂白剂溶液进行中和处理。本实验方案的总体流程见图1。
图 1：中和实验的图示。（A）假病毒（PV）制备，（B）假病毒滴定，以及....
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结果
本方案描述了SARS-CoV-2假病毒（PVs）的制备方法，以及将这些假病毒用于分析接种抗COVID-19疫苗个体血清/血浆中和活性的下游应用17。此外，本方案还可用于制备每种受关注的SARS-CoV-2变异株（VOC）的假病毒，以检测中和反应的演变情况。尽管本方案主要用于促进对COVID-19疫苗接种后体液免疫应答的研究，但也可经适当调整，用于便捷地检测不同血清/血浆对多种病毒的中和能力13,18,19。
图4A 显示了血清稀释倍数（Log(稀释倍数)）随相对光单位（RLU）信号增加而变化的情况。因此，样本稀释倍数越高，病毒进入被抑制的程度越低（图4A）。这一结果进一步以中和百分比的形式表示（
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讨论
尽管使用野生型病毒可以模拟真实的感染过程，但慢病毒假病毒（lentiviral PVs）是一种更安全的选择，可用于研究与病毒进入和感染相关的机制，同时无需满足处理致病性病毒所需的严格安全要求4,20,21。假病毒由复制缺陷型的病毒核心组成，其外层包裹着作为研究对象的致病性病毒的表面包膜糖蛋白。
基于HIV-1的假病毒（PVs）是最广泛使用的平台之一，本实验方案中即采用该平台生产SARS-CoV-2假病毒颗粒。报告基因可根据假病毒的用途而有所不同；本方案中选用荧光素酶报告基因，可对所产假病毒的感染性提供简便、快速且灵敏的检测读数。
基于慢病毒的假病毒（PV）被广泛应用于研究抗HIV-1体液免疫反应22。在由SARS-CoV-2引起的近期CO.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢医护人员志愿者的贡献。本项目由意大利大学与科研部（MUR）2023/2027 年卓越部门计划资助。AR 和 DZ 获得了 PRIN2022 项目（欧盟资金；NextGenerationEU）的支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm 滤膜 | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6 孔板 | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96 孔板 | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 离心过滤装置 | Merck | 10403892 | |
| 黑色不透光 96 孔微孔板 | Perkin Elmer | 60005270 | |
| DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| 磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS 1x） | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| 胎牛血清 | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism 7 版本 | graphpad dotmatics | NA | 在稿件中，我们用“数据分析程序”替代该商品名 |
| HEK293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 细胞 | ATCC | CRL-3216 | HEK293T 细胞通过慢病毒载体转导以过表达 ACE2。 |
| L-谷氨酰胺 | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| 酶标仪 - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | 在稿件中，我们用“酶标仪 ”替代该商品名' |
| Opti-MEM 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | 在稿件中，我们用“低血清培养基' ”替代该商品名 |
| p8.91 包装质粒 | Di Genova 等，2021 | 由 Nigel Temperton 教授惠赠（参考文献 16） | |
| pCSFLW 报告质粒 | Di Genova 等，2021 | 由 Nigel Temperton 教授惠赠（参考文献 16） | |
| 青霉素/链霉素 | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| 支化聚乙烯亚胺（PEI）（25 kDa） | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE（MT126） | Addgene | 145839 | 该质粒用于构建 HEK293T/ACE2 细胞 |
| 表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的质粒 | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| Steadylite Plus 报告基因检测试剂盒 | Perkin Elmer | 6066759 | 在稿件中，我们用“荧光素酶读数试剂”替代该商品名 |
| 胰蛋白酶 EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
参考文献
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
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重印与许可
