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方法文章

假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具

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DOI：

10.3791/65658

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2023年11月21日

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1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement, University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science, University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy, Universities of Kent and Greenwich at Medway

通讯作者： Alessandra Ruggiero <Alessandra.Ruggiero@univr.it>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

假病毒（PVs）是一类复制缺陷型病毒颗粒，可用于在比操作真实病毒更安全的条件下研究宿主与病毒之间的相互作用。本文展示了一项详细方案，说明如何利用SARS-CoV-2假病毒检测新冠疫苗接种后患者血清的中和能力。

摘要

假病毒（PVs）是一种分子工具，除在基因治疗中用于递送目的基因这一较为人熟知的应用外，还可用于研究宿主与病毒之间的相互作用，并检测血清样本的中和能力。假病毒不具备复制能力，因为其病毒基因组被分割在不同的质粒中，且这些质粒不会被整合进假病毒颗粒中。这一安全且多功能的系统使得假病毒可在生物安全二级实验室中使用。本文介绍一种基于三种质粒的慢病毒假病毒通用制备方法：（1）携带报告基因的骨架质粒，用于监测感染过程；（2）包装质粒，携带生成假病毒所需的所有结构蛋白基因；（3）包膜表面糖蛋白表达质粒，决定病毒的嗜性并介导病毒进入宿主细胞。在本研究中，使用严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白作为包膜糖蛋白，用于制备非复制型SARS-CoV-2假病毒慢病毒。

简而言之，采用标准方法将三种不同的质粒共转染至包装细胞（HEK293T）中。转染48小时后，收集含有假病毒（PVs）的上清液，过滤后储存于-80 °C。通过检测感染后48小时靶细胞系中报告基因（荧光素酶）的表达情况，来评估SARS-CoV-2假病毒的感染性。相对发光单位（RLUs）数值越高，表明感染/转导效率越高。此外，将具有感染性的假病毒加入系列稀释的血清样本中，以研究假病毒进入靶细胞过程中的中和作用，该过程通过RLU强度的降低来衡量：RLU值越低，代表中和活性越高。

引言

假病毒（PVs）是微生物学中用于研究宿主-病毒以及病原体-病原体相互作用的分子工具1,2,3,4。PVs 包含一个内层部分，即保护病毒基因组的病毒核心，以及一个外层部分，即位于病毒表面决定其嗜性的包膜糖蛋白5。假病毒在靶细胞中不具备复制能力，因其不包含生成新病毒颗粒所需的全部遗传信息。这种独特的特性组合使 PVs 成为野生型病毒的一种安全替代方案。而野生型病毒具有高度致病性，不能在 BSL 2 实验室中用于分析6。

可通过报告基因监测假病毒（PVs）的感染性，该基因通常编码荧光蛋白（GFP、RFP、YFP）或产生化学发光产物的酶（荧光素酶）。该报告基因包含在用于假病毒生产的质粒之一中，并被整合至假病毒的基因组中7。

目前存在多种类型的假病毒（PV）核心，包括基于HIV-1基因组的慢病毒衍生颗粒。相较于其他载体平台，基于HIV-1的假病毒最大的优势在于其能够天然地整合到靶细胞的基因组中。8尽管HIV-1是一种高度传染性的病毒，也是导致艾滋病的病原体，但由于多年来对慢病毒载体进行了大量优化，这些载体在使用上是安全的。随着引入2nd-代慢病毒载体，其中病毒基因被剔除，但不影响转导能力9. 3rd 和 4th 多代技术改进通过将慢病毒基因组进一步拆分至不同的质粒中，提高了慢病毒载体操作的安全性10, 11最新一代的PVs通常用于生产慢病毒载体以进行基因治疗。

假病毒（PV）可用于研究病毒与宿主细胞之间的相互作用，涵盖病毒的产生和感染两个阶段。假病毒尤其常用于假病毒中和试验（PVNA）。PVNA已得到广泛验证，通过靶向假病毒包膜上的病毒糖蛋白，来评估血清或血浆的中和能力12,13。中和活性以50%抑制浓度（IC50）表示，定义为阻断50%病毒颗粒进入细胞所需的血清/血浆稀释度14。在本实验方案中，我们描述了一种PVNA的建立方法，用于检测在接受加强疫苗接种前后采集的血清中针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的抗体活性。

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方案

本方案已获得维罗纳大学伦理委员会批准，并遵循其指南（批准协议编号 1538）。已从参与研究的人类受试者获得知情书面同意。全血样本采集自正在接种抗 SARS-CoV-2 疫苗的医护人员（HCW）志愿者。这些样本采集于含有抗凝剂的塑料管中，用于后续血清的分离15。

以下所有操作均须在二级生物安全柜中进行，并在无菌条件下操作。病毒操作必须小心谨慎，所有废弃物必须用稀释的漂白剂溶液进行中和处理。本实验方案的总体流程见图1。

SARS-CoV-2 假病毒感染实验示意图、细胞感染过程、数据分析结果。
图 1：中和实验的图示。（A）假病毒（PV）制备，（B）假病毒滴定，以及（C）中和实验。所有操作均在二级生物安全柜中无菌条件下进行。在进行中和实验（C）之前，必须通过滴定步骤（B）标准化假病毒的感染活性水平。本图使用 BioRender 绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

1. SARS-CoV-2 假病毒的制备与感染性检测

  1. 在6孔板（6WP）中接种5 × 105个HEK293T细胞，使用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，高糖，10%胎牛血清（FBS），1% L-谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素），使细胞密度适合所用转染试剂的要求。若使用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染（按制造商说明配制试剂），确保转染当天细胞密度达到40–60%。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。
  2. 转染前，将用过的细胞培养基更换为不含抗生素的新鲜培养基（DMEM，高糖，10% FBS，1% L-谷氨酰胺），以提高转染效率。
    注意：接种后第二天，HEK293T细胞即可进行转染。
  3. 根据制造商说明，使用合适的转染试剂对贴壁生长的HEK293T细胞进行转染。若使用PEI，请配制两种混合液，并按以下步骤操作。
    1. 配制混合液A：在100 µL低血清培养基中加入500 ng pCMV-dR8.91包装质粒16、750 ng pCSFLW报告基因质粒16以及450 ng表达SARS-CoV-2刺突蛋白的质粒。
    2. 配制混合液B：在100 µL低血清培养基中加入17.5 µL PEI（浓度：1 mg/mL）。
    3. 将两种混合液在室温（RT）孵育5分钟。随后，将混合液B（含PEI）加入混合液A（含DNA）中，轻轻混匀。
    4. 在室温下孵育20–30分钟，每隔3–4分钟轻弹管壁以促进混合。最后，将混合液加入HEK293T细胞中。
  4. 转染后16–20小时，更换为新鲜的完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养，使转染细胞产生假病毒（PVs）。
  5. 转染后72小时，收集含有假病毒的上清液。在室温下以1600 ×g离心7分钟，去除细胞碎片和死亡细胞，然后通过0.45 µm醋酸纤维素滤膜过滤。
  6. 可选步骤：为提高最终假病毒滴度的产量，可进行多次转染，合并含有假病毒的培养上清，并使用浓缩管进行浓缩。
  7. 可直接进行后续步骤（“假病毒滴定”，第2节），或将含假病毒的培养基分装至合适离心管中，于-80 °C保存备用。另准备一份400–500 µL的分装样品用于滴定。
    注意：分装保存可避免反复冻融，确保不同实验间的可重复性。

2. PVs 滴定

  1. 使用含有PV的新鲜培养基进行后续步骤，或解冻用于检测的分装样品（步骤1.7），以对新制备的病毒原液进行滴定。将同一PV原液分装后冷冻保存可确保实验的可重复性。
  2. 向96孔板（96WP）中所有用于检测病毒原液的孔内加入50 µL完全DMEM（或与所用靶细胞系相容的完全培养基），每种样品设两个复孔，并保持A行为空白。向A行各孔加入100 µL PV原液。根据待测样品的数量，预留一列不加病毒作为“仅细胞”对照（图2）。
  3. 用移液器将A行中的50 µL液体转移至B行，依次操作至G行，以获得原液的系列稀释。弃去最后一行多余的液体体积。
  4. 去除旧培养基后，用DPBS 1x洗涤细胞两次，随后使用含1x胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS 1x）消化细胞使其脱落。将细胞重悬并调整密度至4 × 105 个细胞/mL。
    注：本实验中，PV感染在易感细胞系HEK293T/ACE2上进行检测；该细胞系来源于HEK293T细胞，通过慢病毒载体转导使其表达ACE2受体。
  5. 向每个孔中加入50 µL细胞悬液，确保每孔细胞数量为2 × 104 个。
  6. 在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
  7. 孵育结束后，按照试剂盒说明书进行荧光素酶检测。向各孔加入100 µL荧光素酶检测试剂，室温避光孵育2分钟。将每孔内容物转移至黑色96孔板（需与所用酶标仪兼容），并在96孔板读数仪中读取发光值。
    注：用于检测荧光素酶信号的发光仪将生成包含原始未处理数据的电子表格文件，用于后续分析（本例中为Excel文件）。病毒的感染性将以相对发光单位（RLU）表示（详见第4.1节）。

SARS-CoV-2 PV 连续稀释示意图，96孔板设置，病毒感染研究，细胞培养。
图 2：用于PV滴定的96孔板代表性布局。 将固定体积的含PV上清液加入A行第1-11列，并进行连续稀释。最后一列留作“仅细胞”对照。本图使用BioRender绘制。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 中和实验

  1. 将患者的血清在冰上解冻。通过在 56 °C 孵育 30 分钟以灭活血清样本。
  2. 在 96 孔板中，向以下各孔中每孔加入 50 µL 新鲜的完全 DMEM 培养基（或与所用靶细胞系相容的完全培养基）：从 B 行（第 1–10 列）至 H 行（第 1–10 列）。在 A 行（第 1–10 列）每孔加入 95 µL 新鲜的完全 DMEM 培养基。在第 11 列和第 12 列的孔中分别加入 50 µL 和 100 µL 完全 DMEM 培养基。这些孔将分别作为感染对照（病毒对照，VC）和未感染对照（仅细胞，CC）（图 3）。
  3. 在 A 行（第 1–10 列）每孔加入 5 µL 热灭活的血清/血浆样本。每个样本设两个复孔。使用多通道移液器混匀第一行中的样本，然后将含有血清的培养基从 A 行转移 50 µL 至 B 行。重复此操作直至最后一行（图 3）。弃去剩余的 50 µL。
  4. 解冻所需数量的假病毒（PV）分装样品，并稀释至 ≥ 104 RLU/mL。使用多通道移液器向每孔（第 1 至第 11 列）加入 50 µL 含稀释后假病毒的培养基，使热灭活血清/血浆与病毒的终体积比为 1:1。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 1 小时，使血清样本中的抗体与假病毒表面的 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合。
  5. 准备至少 5 mL 易感细胞（HEK293T/ACE2）悬液，细胞密度为 4 × 105 个细胞/mL。向每孔加入 50 µL 细胞悬液，并在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 48 小时。
  6. 孵育结束后，按照制造商说明书进行荧光素酶检测读数，具体操作如步骤 2.7 所述。
    注意：用于荧光素酶检测的发光仪将生成一个包含原始未处理数据的电子表格文件（本例中为 .xlsx 格式），用于后续分析（即荧光素酶检测文件）。

用于ELISA实验中血清分析的连续稀释微孔板示意图。
图3：基于血清稀释的微孔板示意图。 鲜红色代表较高浓度的血清，亮蓝色列（第11列）代表感染细胞对照（VC，病毒对照），浅蓝色列（第12列）代表未感染细胞（CC，细胞对照）。本图使用BioRender绘制。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 滴定分析

  1. 在荧光素酶检测文件中，将名称/标题分配给相应的样品。
  2. 将RLU测量值乘以稀释倍数（从网格顶部到底部：20x、40x、80x、160x、320x、640x、1,280x、2,560x），得到RLU/mL。如果使用了不同的稀释倍数，请相应调整乘数。
  3. 计算每种PV制备物的平均RLU/mL。

5. PVs 中和实验分析

  1. 在荧光素酶检测的电子表格文件（本例中为 .xlsx 格式）中，为待测样品分配相应的标题。输入样品的稀释倍数（40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1,280倍、2,560倍、5,120倍）。计算稀释倍数的 Log10 值。
  2. 计算未感染对照组和感染对照组的平均 RLU 值（图3，分别为第11列和第12列）。这些数值将在步骤5.5的归一化处理中使用。
  3. 新建一个用于数据分析的文档。选择 X/Y 分析，将 X 设为 数值，Y 设为 在并列的子列中输入两份重复值。
  4. 将 Log10（稀释倍数）值作为 X 数值输入，将样品的两份重复 RLU 值输入 Y 列。
  5. 转到 分析 > 归一化 > 全选 当前工作表中的所有样品。在 0% 如何定义？ 和 100% 如何定义？ 中分别输入平均 VC 和 CC 值，然后点击 确定。
  6. 在归一化后的数据表中，转到 分析 > XY 分析 > 非线性分析（曲线拟合）。选中所有样品后点击 确定。在 剂量-反应 - 抑制 类型中，选择 log(抑制剂) 对归一化响应 - 可变斜率。
  7. 在 约束条件 下，将 HillSlope 更改为 必须小于 0。
  8. 在 输出 选项中，勾选 生成汇总表和图表，然后点击 确定 以获得最终分析结果。补充文件1 中提供了包含分析模板的工作表。

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结果

本方案描述了SARS-CoV-2假病毒（PVs）的制备方法，以及将这些假病毒用于分析接种抗COVID-19疫苗个体血清/血浆中和活性的下游应用17。此外，本方案还可用于制备每种受关注的SARS-CoV-2变异株（VOC）的假病毒，以检测中和反应的演变情况。尽管本方案主要用于促进对COVID-19疫苗接种后体液免疫应答的研究，但也可经适当调整，用于便捷地检测不同血清/血浆对多种病毒的中和能力13,18,19。

图4A 显示了血清稀释倍数（Log(稀释倍数)）随相对光单位（RLU）信号增加而变化的情况。因此，样本稀释倍数越高，病毒进入被抑制的程度越低（图4A）。这一结果进一步以中和百分比的形式表示（

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讨论

尽管使用野生型病毒可以模拟真实的感染过程，但慢病毒假病毒（lentiviral PVs）是一种更安全的选择，可用于研究与病毒进入和感染相关的机制，同时无需满足处理致病性病毒所需的严格安全要求4,20,21。假病毒由复制缺陷型的病毒核心组成，其外层包裹着作为研究对象的致病性病毒的表面包膜糖蛋白。

基于HIV-1的假病毒（PVs）是最广泛使用的平台之一，本实验方案中即采用该平台生产SARS-CoV-2假病毒颗粒。报告基因可根据假病毒的用途而有所不同；本方案中选用荧光素酶报告基因，可对所产假病毒的感染性提供简便、快速且灵敏的检测读数。

基于慢病毒的假病毒（PV）被广泛应用于研究抗HIV-1体液免疫反应22。在由SARS-CoV-2引起的近期CO...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢医护人员志愿者的贡献。本项目由意大利大学与科研部（MUR）2023/2027 年卓越部门计划资助。AR 和 DZ 获得了 PRIN2022 项目（欧盟资金；NextGenerationEU）的支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 滤膜SARSTEDT83 1826
6 孔板SARSTEDT83 3920
96 孔板SARSTEDT8,33,924
Amicon Ultra-15 离心过滤装置Merck10403892
黑色不透光 96 孔微孔板Perkin Elmer60005270
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） SIGMA-ALDRICHD6546 - 500ML
磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS 1x）AUROGENEAU-L0615-500
胎牛血清AUROGENEAU-S1810-500
Graphpad Prism 7 版本graphpad dotmaticsNA在稿件中，我们用“数据分析程序”替代该商品名
HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
HEK293T/ACE2 细胞ATCCCRL-3216HEK293T 细胞通过慢病毒载体转导以过表达 ACE2。
L-谷氨酰胺 AUROGENEAU-X0550-100
酶标仪 - Victor3Perkin ElmerHH35000500在稿件中，我们用“酶标仪 ”替代该商品名' 
Opti-MEM 培养基Thermo Fisher Scientific11058021在稿件中，我们用“低血清培养基' ”替代该商品名
p8.91 包装质粒Di Genova 等，2021由 Nigel Temperton 教授惠赠（参考文献 16）
pCSFLW 报告质粒Di Genova 等，2021由 Nigel Temperton 教授惠赠（参考文献 16）
青霉素/链霉素AUROGENEAU-L0022-100
支化聚乙烯亚胺（PEI）（25 kDa）SIGMA-ALDRICH408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE（MT126）Addgene145839该质粒用于构建 HEK293T/ACE2 细胞
表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的质粒AddgenepGBW-m4137382
Steadylite Plus 报告基因检测试剂盒Perkin Elmer6066759在稿件中，我们用“荧光素酶读数试剂”替代该商品名
胰蛋白酶 EDTA 1xAUROGENEAU-L0949-100

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