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方法文章

利用选择性脊柱操作促进脑性瘫痪幼鼠的发育与生长

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DOI：

10.3791/65659

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究阐述了选择性脊柱操作对脑性瘫痪幼鼠生长发育的影响，重点介绍了具体操作步骤和标准化方案。通过体质量测量、转棒实验、足错步评分、其他行为学测试以及生长激素检测来评估该方案的效果。

摘要

脑性瘫痪（CP）是一种难治性儿科疾病，具有高发病率、高致残率和治疗困难的特点。目前针对脑性瘫痪有多种治疗方法，包括药物治疗和非药物治疗。中医外治法是非药物治疗中一种极具特色的治疗手段。推拿作为中医外治法之一，应用于脑性瘫痪的治疗，具有疗效良好、不良反应小、可操作性强等优点。选择性脊柱推拿作为中医外治法的一部分，可有效促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育。该操作主要分为四个步骤：第一步，采用摩法作用于脊柱及脊柱两侧，持续1分钟；用按揉法作用于脊柱，持续5分钟，再作用于脊柱两侧肌肉，持续5分钟。第二步，对脊柱区域的敏感局部穴位进行按揉，持续2分钟。第三步，对患侧肢体采用捻法治疗，持续1分钟。第四步，采用摩法沿从额部至脑后正中线的线路操作，持续1分钟。本研究旨在应用选择性脊柱推拿来治疗脑性瘫痪幼鼠，通过检测脑性瘫痪幼鼠的体重、转棒实验成绩、足错步评分及生长激素水平，以了解选择性脊柱推拿对脑性瘫痪幼鼠生长发育的影响。结果表明，该疗法可促进体重增长，改善平衡能力和运动功能，促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育，促进生长激素分泌，并提高背部敏感部位的温度。

引言

脑性瘫痪（CP）是由胎儿期或婴儿期脑部非进行性损伤引起的一组疾病，其特征为运动和姿势发育异常1，伴有包括体重增长缓慢在内的发育障碍2,3,4以及运动功能障碍。中国脑性瘫痪的发病率为2.48%，患病率为2.46‰（1-6岁）5。国外研究报道其患病率为2.4%-3.6%6。脑性瘫痪是导致儿童身体损伤和残疾的主要原因，其中平衡功能障碍和运动障碍显著影响日常生活活动能力1。脑性瘫痪可由早产、感染、遗传因素、新生儿缺血缺氧、新生儿黄疸等多种复杂且多样的致病因素引起7。脑性瘫痪的治疗目标是改善身体功能和生活质量8。目前，脑性瘫痪的治疗方法包括深部脑刺激9、机器人辅助步态训练10、腕踝针刺11以及经络针刺结合按摩疗法12。

传统医学（TCM） increasingly 被用作治疗脑性瘫痪（CP）的有效方法13,14。推拿作为其中的一部分，也发挥着一定作用。例如，选择性脊柱手法可通过调节DNA羟甲基化状态来调控神经发育，改善学习与记忆功能15。在治疗脑性瘫痪幼鼠时，选择性脊柱手法可能通过调节炎症因子TNF-α和IL-10基因启动子区域的甲基化水平，改善大脑皮层和海马区的炎症稳态16，并对脑性瘫痪幼鼠的平衡能力起到积极的治疗作用16。选择性脊柱手法可改善脑性瘫痪幼鼠的认知功能17。在脑性瘫痪幼鼠的治疗中应用选择性脊柱手法，观察发现其对幼鼠的生长发育也具有治疗效果18。

本研究旨在通过测量脑瘫幼鼠的体重、转棒实验19、足错步评分20,21 等行为学测试以及生长激素的检测，阐明选择性脊柱操作对脑瘫幼鼠生长发育的影响，为相关研究人员提供研究思路。

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方案

本研究经云南中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准编号：R-06202018）。所有动物实验操作遵循实验动物的减量、优化与替代3R原则。实验选用14只雄性、7只雌性健康SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠，平均体重为250–300 g。大鼠饲养于云南中医药大学SPF级动物房（合格证编号：SYXK（云南）K2022-0004），饲养环境为自然光照控制，12小时明暗循环，室温22–26 °C，相对湿度40%–50%。经1周适应性饲养后，按1:2的雌雄比例合笼交配。交配1周后，将妊娠大鼠单笼饲养，正常喂养，自由饮食饮水。待其自然分娩后，选取健康出生的仔鼠。将仔鼠分为假手术组（Sham）、对照组（Control）和治疗组（Treatment），以观察选择性脊柱手法干预对脑性瘫痪仔鼠生长发育的影响。每组选取6只雄性仔鼠用于实验。治疗组自出生后第5天开始接受选择性脊柱手法干预th 出生后第1天开始给药，连续治疗6天，随后休息1天。

1. 建立脑性瘫痪模型

  1. 将显微镜、眼科剪刀、镊子、缝合线、手术板、剪刀、棉签和手术所需的手套进行灭菌处理，并放置于手术室内。
  2. 在出生后第3天，暂时将幼鼠与其母鼠分离，将其放入单独的容器中，并转运至无菌手术室。
  3. 测量幼鼠体重。选择体重在7–9 g范围内的幼鼠纳入研究，排除不符合体重标准的个体。将幼鼠随机分为假手术组（Sham）、对照组（Control）和治疗组（Treatment）。
  4. 使用小动物吸入式气体麻醉机，以2%浓度的异氟烷诱导麻醉，并以1%浓度维持麻醉。
    注：本实验主要观察选择性脊柱操作对脑瘫幼鼠生长发育的影响。建模过程中已按照常规要求实施麻醉，额外镇痛可能影响观察结果。
    1. 将小动物气体麻醉机接通电源，并打开与诱导箱相连的阀门。
    2. 将幼鼠放入诱导箱中，旋转浓度调节旋钮，将异氟烷浓度调节至2%，以诱导麻醉。
    3. 当幼鼠意识丧失后，将其从诱导箱中取出，放置于手术板上，并关闭麻醉机通道1。
    4. 将幼鼠仰卧位固定，并连接麻醉吸入面罩以维持麻醉状态。
    5. 打开连接麻醉吸入面罩的通道，通过旋转浓度调节旋钮，将异氟烷浓度调节至1%以维持麻醉。
      注：麻醉后，通过用力提拉并夹捏幼鼠脚趾和尾部评估麻醉深度。若夹捏脚趾和尾部无反应，则表明麻醉深度已达到要求。
  5. 用75%酒精对幼鼠颈部皮肤消毒三次，在颈部皮肤上做一条纵向1 cm切口，暴露皮下组织。
    注：颈部皮肤做纵向切口不会造成皮肤缺损。
  6. 在解剖显微镜下切开左侧颈部皮肤，使用眼科镊钝性分离胸骨舌骨肌与左侧胸锁乳突肌。
    1. 找到左侧颈总动脉和迷走神经，并分离左侧颈总动脉与迷走神经。
    2. 在模型组中，使用电凝笔切断左侧颈总动脉。清理创面后缝合颈部切口。
    3. 在假手术组中，仅分离左侧颈总动脉与迷走神经，不进行结扎或切断。
  7. 术后将幼鼠俯卧位置于恒温水浴中复苏1小时。
    注：自然恢复后，四肢及全身皮肤颜色转为红润，幼鼠可自主活动四肢并独立爬行。
  8. 将对照组和治疗组复苏后的幼鼠置于37 °C恒温孵育箱中，保持俯卧位，通入5%氧气与95%氮气的混合气体以诱导缺氧，持续2小时后取出幼鼠。
  9. 将完成缺氧处理的幼鼠从缺氧箱中取出，置于含正常大气氧浓度的容器中，保持俯卧位，并放入37 °C恒温水浴中1小时。待完全恢复后，将幼鼠放回母鼠笼中。
    注：自然恢复后，四肢及全身皮肤呈红色，幼鼠可自主活动四肢并独立爬行。
  10. 将假手术组幼鼠置于含正常大气氧浓度的容器中，将容器放入37 °C恒温水浴中1小时。待完全恢复后，将幼鼠放回母鼠笼中继续喂养。
    注：自然恢复后，四肢及全身皮肤呈红色，幼鼠可自主活动四肢并独立爬行。全部手术操作均在中国台湾云南中医药大学SPF级动物房专用手术室内完成。在复苏和缺氧过程中，操作人员需持续观察幼鼠状态，防止因体位不当导致死亡。哺乳期母鼠使用SPF级繁殖饲料喂养；幼鼠出生后第21天（postnatal day 21）具备自主进食能力时断奶22,23,24，改用SPF级维持饲料喂养。

2. 翻正反射实验

  1. 第4天th 出生后第2天（第2天）nd 建模后第1天，进行翻正反射实验以验证模型是否成功（图1 和 表1).
    1. 提起幼鼠的尾巴，将其背部置于水平板上，用拇指和食指固定其腹部和颈部。检查幼鼠是否能恢复至正常体位。由于翻正反射丧失，幼鼠无法从异常体位恢复至正常体位的情况被记录为造模成功。16,25.
    2. 记录每组幼鼠从仰卧位翻转至俯卧位所需的时间。当用拇指和食指将幼鼠呈仰卧位夹持后同时松开时开始计时，允许幼鼠自行翻转至俯卧位，当前后爪均接触地面时停止计时。若幼鼠未能在20秒内恢复正常体位，则记录其翻正时间为20秒。

3. 手术前准备

  1. 建模后，将脑性瘫痪的幼鼠与其母鼠分离，并置于室温恒定为22-26 °C的手术室中2分钟，以适应周围环境。
  2. 佩戴一次性手套，保持手掌温和柔软，温度维持在36-37 °C。
  3. 将幼鼠轻轻放置于左手掌中。弯曲左手拇指覆盖幼鼠双眼持续2分钟，以形成暗视野，使幼鼠适应操作者手掌的环境。使用右手的食指和中指进行操作。
    注意：遮盖幼鼠眼睛可营造黑暗环境，避免因不安全和不确定的环境导致幼鼠躁动，从而影响实验结果。

4. 将大鼠分为对照组和处理组

  1. 建模后第二天（P5），通过翻正反射试验验证模型，并将幼鼠随机分为对照组和治疗组。对治疗组幼鼠进行选择性脊柱操作。
  2. 将幼鼠置于俯卧位，确保脊柱始终保持水平直线状态（图2A）。
  3. 使用摩法对脊柱及两侧区域进行1分钟按摩，随后采用按揉法对脊柱及其两侧肌肉进行5分钟操作。
    1. 使用摩法按摩脊柱及两侧皮肤，以放松幼鼠并充分缓解其紧张状态。在幼鼠安静无躁动后，以每分钟100–120次的频率持续摩擦1分钟。
      1. 以右手食指、中指和无名指为接触面，从头至尾方向在颈椎、胸椎和腰椎的皮肤表面做环形摩擦运动，注意不扰动皮下组织。
      2. 以右手食指、中指和无名指为接触面，按照动物解剖学标准26，从头至尾依次在斜方肌、浅臀肌、颈菱形肌、胸菱形肌、背阔肌和腹外斜肌的皮肤表面做环形运动，注意不扰动皮下组织。
    2. 先对脊柱进行5分钟的按揉处理，再对脊柱两侧肌肉进行5分钟的按揉。
      1. 以每分钟120次的频率对脊柱进行5分钟按揉操作，使用右手食指或中指作为接触面。从头至尾方向在颈椎、胸椎和腰椎的皮肤表面做环形按揉，同时结合向下按压（1.77 ± 0.54 N），确保力量作用至颈椎、胸椎、腰椎及棘上韧带。
      2. 以每分钟120次的频率对脊柱两侧肌肉进行5分钟按揉操作，使用右手食指或中指作为接触面。根据动物解剖学标准26，从头至尾方向在斜方肌、浅臀肌、颈菱形肌、胸菱形肌、背阔肌和腹外斜肌的皮肤表面做环形按揉并施加1.77 ± 0.54 N的压力，使力量作用至上述肌肉组织（图2B）26。
  4. 以每分钟100–120次的频率，对敏感脊柱穴位点（如肝俞、心俞、脾俞、肾俞和肺俞27）进行2分钟的按揉操作。使用右手食指或中指作为接触面，在脑瘫幼鼠局部穴位（如肝俞、心俞、脾俞、肾俞和肺俞）的皮肤表面进行环形按揉并施加向下压力（1.77 ± 0.54 N）。
    注：穴位选择依据中国针灸学会实验针灸研究分会制定的"动物针灸穴位图谱"（图3）28。
  5. 以每分钟25次的频率，对患肢进行1分钟的捻法局部刺激。
    1. 用右手拇指与食指夹住脑瘫幼鼠的患肢，使两指施力对称，操作时用力轻柔、动作轻巧。来回摩擦幼鼠的桡侧腕长伸肌、指总伸肌、尺侧腕伸肌、指骨、指间关节、腓肠肌、半腱肌、跖骨及跖间关节。
  6. 以每分钟100–120次的频率，使用摩法从额部中线至脑后部操作1分钟。以右手食指为接触面，在幼鼠额部至后脑中部的假想连线上（即百会、风府、大椎一线）进行操作（图3）。
    注：按摩主要作用于皮肤，在脑瘫幼鼠头部皮肤表面做环形运动，无需带动皮下肌肉运动。
  7. 操作结束后，将幼鼠单独放置30分钟，再放回母鼠笼中。
    注：随着日龄增长，幼鼠体毛逐渐增厚，因此在按摩操作过程中需去除各组幼鼠背部毛发，以避免影响实验效果。

5. 检测局部穴位的温度

  1. 使用红外热成像仪检测操作前后局部穴位区域的温度。
    1. 在进行选择性脊柱按摩前，使用数据线将手机的Type-C接口与红外成像设备的USB接口连接，并打开电源按钮。
    2. 点击分析进入软件的手机终端，选择拍照进入拍照模式，然后点击右下角图片模式中的图片。
    3. 将摄像头对准幼鼠背部的大椎穴、心俞穴和肾俞穴区域（图3），进行温度拍摄。点击拍照完成图像采集，并以JPG格式保存。
    4. 使用数据线将计算机与设备连接，并将保存的图像上传至安装有Fotric软件的计算机进行分析。
      1. 在PC上打开Fotric软件，打开本地文件，找到图像所在位置。
      2. 选择热图工作区，选中待分析的图像，进入分析界面。
      3. 在分析界面中，选择右侧热图像框中的图片，并打开锁定。
      4. 选择缩放功能，调整热图像与左侧框内背景图像的大小使其重合，然后关闭右侧的锁定。
      5. 在顶部工具栏中找到设置测量矩形，并在图中标记待检测的穴位区域。
      6. 点击右侧的报告以记录温度值。

6. 检测脑瘫幼鼠的运动平衡功能

  1. 使用转棒实验检测行为功能19 用于检测假手术组、对照组和治疗组大鼠在第61天的运动功能st 出生后一天
    1. 参数设置：打开电源开关，选择 做实验 进入下一步，请选择 阳性，大鼠，时间 5 分钟 进入下一步，然后选择 加速度时间：10 秒，转速：10 转/分钟.
    2. 然后，将大鼠放置于跑台上，通过点击开始测试 运行 待其稳定后，调节每次运行的运行状态 开启每只大鼠训练一次，每次5分钟，然后开始进行三次测试。
    3. 训练结束后，将幼鼠放置于转棒仪跑道上。待其稳定后，点击 运行，并调整运行状态至 开启5 分钟结束时，选择 日期 记录每只大鼠首次从转棒仪跑轮上跌落的时间和速度，即运行时间数据。
  2. 使用足错步测试20,21 评估假手术组、对照组和治疗组大鼠右侧前肢运动功能的平衡能力st 出生后一天
    1. 将幼鼠置于水平梯的起始端，记录其穿过梯子到达另一端的视频（梯长100 cm，每级梯间距为2 cm）。每次训练结束后，对每只幼鼠以5分钟间隔进行三次正式测试。
    2. 使用慢速回放观察动物穿过梯子时的右前肢，按照评分标准进行评分，如评分标准所示（表2).

7. 蛋白质印迹法

  1. 按照先前所述方法对组织样本进行蛋白质印迹分析29。
    注意：裂解液的用量根据组织块的大小确定。所用抗体如下：一抗为抗生长激素抗体（0.5 µg [0.5 ng/泳道]）；抗生长激素受体抗体（1/1000）；内参抗体为抗β-肌动蛋白抗体（1/2000）；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG H&L（1/10000）。

8. 检测手部力量

  1. 佩戴用于检测按摩操作力度的设备至进行按摩的手部。将设备的传感器芯片固定在用于按摩幼鼠的手指上，并打开Power按钮。
  2. 将存储手动测试软件的硬盘接口连接至计算机，并在URL输入框中输入手动测试仪的专用IP地址。
  3. 在计算机上安装SpringVR客户端，点击进入采集界面，并在右下角选择Finger Pattern以测试操作力度。
  4. 选择Pressure选项并点击Start，开始记录操作者在操作过程中的手动施力。软件将自动记录按摩力度强度，并在本地磁盘生成数据表，文件名中包含PressureSensor的数据将保存于此。

9. 数据统计

注意：采用 SPSS26.0 软件进行统计分析，Graphpad Prism9.0.0 制作柱状图，Image J 用于蛋白条带的灰度值分析。

  1. 所有数据均以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示并进行分析和呈现。
    注意：检验标准为 α = 0.05，当 P ≤ 0.05 时认为差异具有统计学意义。由于数据通过方差分析和正态性检验，符合正态分布特征且方差齐性，因此采用 Fisher 检验。

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结果

选择性脊柱操作可促进脑瘫幼鼠的体重增长。
治疗期间，在出生后第 3、14、28、42 和 61 天测量体重（图 4，表 3）。出生后第 3 天，假手术组体重为 5.53 ± 0.035 g，对照组体重为 3.15 ± 0.43 g。治疗组体重为 4.42 ± 0.13 g，在建模前与假手术组和对照组相比无显著差异。

出生后第14天，假手术组的体重为35.97 ± 1.019 g，对照组的体重为28.00 ± 0.7403 g，治疗组的体重为33.78 ± 3.705 g。治疗组与假手术组之间的体重差异无统计学意义。治疗组与对照组相比，体重差异具有统计学显著性（P < 0.01）。

第28天th 出生后第1天，假手术组的体重为104.9 ± 3.534 g，对照组的体重为80.35 ± 6.767 g，治疗组的体重为96.73 ± 7.638 g。治...

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讨论

由于缺血和缺氧是脑性瘫痪的重要致病因素，国际公认建立脑性瘫痪模型的方法是结合缺氧制备脑性瘫痪模型16,31,32,33。脑性瘫痪发生时会导致全面性发育迟缓，包括体重和运动功能，这可能与生长激素分泌水平有关34。本研究采用选择性脊柱操作治疗脑性瘫痪幼鼠，治疗期间监测体重变化，并进行Rotarod实验、足错步评分及生长激素检测。治疗前后观察局部穴位温度变化。在建立缺血-缺氧模型后，脑性瘫痪幼鼠出现体重下降，但随着按摩疗程的延长，治疗组的体重增长显著优于对照组，且在调节生长激素分泌方面也具有明显优势。这些结果表明，选择性脊柱操作可有效改善脑性瘫痪幼鼠的生长发育状况。此外，由于采用结扎左侧颈总动脉并结合缺氧的方法建立模型，必然造成左侧皮层损伤，从而导致运动功能障碍。治疗后，我们通过Rotarod实验和足错步评分检测脑性瘫痪幼鼠的行为能力

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披露

作者声明本研究不存在任何竞争性经济利益或其他利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金面上项目（82374614）、云南省科技厅重大生物医药项目（202102AA100016）、云南省科技厅应用基础研究联合重点项目 云南省科学技术厅—云南中医药大学（201901AI070004）；云南省高校针灸推拿防治脑病重点实验室（2019YGZ04）；云南省科学技术厅—云南省基础研究计划青年项目（202101AU070002）；云南省教育厅科学研究基金研究生项目（2023Y0433）；云南省教育厅科研基金（2023Y0462）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔板北京兰杰科生物科技有限公司11510蛋白质浓度测定
抗β-肌动蛋白抗体AbacmAb8227稀释比例：1/2000
抗生长激素抗体AbacmAb1268820.5 µg（0.5 ng/泳道）
抗生长激素受体抗体AbacmAb202964稀释比例：1/1000
基础手术显微镜操作上海宇彦科学仪器有限公司SM-101在建模过程中，在显微镜下分离颈总动脉
BCA 显色剂碧云天生物技术有限公司P0010蛋白质浓度测定
化学发光成像系统上海勤翔科学仪器有限公司100240073蛋白质条带成像
直接上样彩色预染蛋白 Marker北京康润诚业生物科技有限公司（GenStar）M221蛋白质印迹法
DK-30自动制冰机河南兄弟仪器设备有限公司SHDX0023制冰
ECL 化学发光底物试剂盒北京兰杰科生物科技有限公司BL520B将曝光胶片中的潜影转化为可见影像
电热恒温水浴锅TAISITE INSTRUMENTDK-98-II建模后对幼年大鼠进行复苏
电子天平昆山友科纬电子科技有限公司CN-LQC10002幼年大鼠的体重被测量
德国小型白色电凝笔止血器HaohangL55×W125×H37用于凝固左侧颈总动脉
手套江苏扬子利德医疗器械有限公司Q/320684 YZYL001-2017用于按摩操作
甘氨酸北京索莱宝科技有限公司货号#G8200电泳溶液，配置转移液
Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP） AbacmAb6721稀释比例：1/10000
智能型实验室超纯水机重庆华创水处理工程有限公司N/A过滤（15 L）
异氟烷山东安特畜牧科技有限公司15198麻醉通过诱导在幼年大鼠中维持
LinkIRFOTIRCV1.3.2.134红外图像分析软件
低温高速组织研磨机武汉赛维尔生物科技有限公司SKZ3F20200191组织研磨
甲醇广东光华科技股份有限公司20220519配置转移液
Mini-PROTEAN Tetra博乐生命医疗产品（上海）有限公司552BR 233193电泳
Multiskan Spectrum 微孔板分光光度计TECAN火花检测组织蛋白的吸光度和浓度
压力感应智能手套济南超感智能科技有限公司Miiglove用于测量操作者的手部操作力量
PVDF膜默克密理博公司 IPVH00010 蛋白质印迹法
冷藏离心机Hettich Precision Technology (Zhuhai) Co., LTDMIKRO 220R离心
三合一热成像仪研究FOTIRC226S（384 × 288）温度测量
RIPA 裂解液北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）R0010裂解组织
SHA-CA 数显水浴恒温振荡器常州奥华仪器有限公司SHA-CA幼年大鼠被用于缺氧实验
六鼠疲劳转棒仪上海多易实业有限公司DO01104RT703CP运动功能被检测到
脱脂奶粉广州赛国生物科技有限公司（BIOFROXX）1172GR500限制液体
SPF 级繁殖饲料SPF（北京）生物技术有限公司A1EC30005A1S4285266哺乳期雌性大鼠被喂食
SPF 维持饲料SPF（北京）生物技术有限公司A1EC30005A1S4285267断奶后给幼崽喂食
外科手术板上海宇彦科学仪器有限公司51002在幼年大鼠中建立了模型手术台
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