方法文章

利用选择性脊柱操作促进脑性瘫痪幼鼠的发育与生长

DOI：

10.3791/65659

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究阐述了选择性脊柱操作对脑性瘫痪幼鼠生长发育的影响，重点介绍了具体操作步骤和标准化方案。通过体质量测量、转棒实验、足错步评分、其他行为学测试以及生长激素检测来评估该方案的效果。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑性瘫痪（CP）是一种难治性儿科疾病，具有高发病率、高致残率和治疗困难的特点。目前针对脑性瘫痪有多种治疗方法，包括药物治疗和非药物治疗。中医外治法是非药物治疗中一种极具特色的治疗手段。推拿作为中医外治法之一，应用于脑性瘫痪的治疗，具有疗效良好、不良反应小、可操作性强等优点。选择性脊柱推拿作为中医外治法的一部分，可有效促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育。该操作主要分为四个步骤：第一步，采用摩法作用于脊柱及脊柱两侧，持续1分钟；用按揉法作用于脊柱，持续5分钟，再作用于脊柱两侧肌肉，持续5分钟。第二步，对脊柱区域的敏感局部穴位进行按揉，持续2分钟。第三步，对患侧肢体采用捻法治疗，持续1分钟。第四步，采用摩法沿从额部至脑后正中线的线路操作，持续1分钟。本研究旨在应用选择性脊柱推拿来治疗脑性瘫痪幼鼠，通过检测脑性瘫痪幼鼠的体重、转棒实验成绩、足错步评分及生长激素水平，以了解选择性脊柱推拿对脑性瘫痪幼鼠生长发育的影响。结果表明，该疗法可促进体重增长，改善平衡能力和运动功能，促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育，促进生长激素分泌，并提高背部敏感部位的温度。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑性瘫痪（CP）是由胎儿期或婴儿期脑部非进行性损伤引起的一组疾病，其特征为运动和姿势发育异常1，伴有包括体重增长缓慢在内的发育障碍2,3,4以及运动功能障碍。中国脑性瘫痪的发病率为2.48%，患病率为2.46‰（1-6岁）5。国外研究报道其患病率为2.4%-3.6%6。脑性瘫痪是导致儿童身体损伤和残疾的主要原因，其中平衡功能障碍和运动障碍显著影响日常生活活动能力1。脑性瘫痪可由早产、感染、遗传因素、新生儿缺血缺氧、新生儿黄疸等多种复杂且多样的致病因素引起7。脑性瘫痪的治疗目标是改善身体功能和生活质量8。目前，脑性瘫痪的治疗方法包括深部脑刺激9、机器人辅助步态训练10、腕踝针刺11以及经络针刺结合按摩疗法12。

传统医学（TCM） increasingly 被用作治疗脑性瘫痪（CP）的有效方法13,14。推拿作为其中的一部分，也发挥着一定作用。例如，选择性脊柱手法可通过调节DNA羟甲基化状态来调控神经发育，改善学习与记忆功能15。在治疗脑性瘫痪幼鼠时，选择性脊柱手法可能通过调节炎症因子TNF-α和IL-10基因启动子区域的甲基化水平，改善大脑皮层和海马区的炎症稳态16，并对脑性瘫痪幼鼠的平衡能力起到积极的治疗作用16。选择性脊柱手法可改善脑性瘫痪幼鼠的认知功能17。在脑性瘫痪幼鼠的治疗中应用选择性脊柱手法，观察发现其对幼鼠的生长发育也具有治疗效果18。

本研究旨在通过测量脑瘫幼鼠的体重、转棒实验19、足错步评分20,21 等行为学测试以及生长激素的检测，阐明选择性脊柱操作对脑瘫幼鼠生长发育的影响，为相关研究人员提供研究思路。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究经云南中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准编号：R-06202018）。所有动物实验操作遵循实验动物的减量、优化与替代3R原则。实验选用14只雄性、7只雌性健康SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠，平均体重为250–300 g。大鼠饲养于云南中医药大学SPF级动物房（合格证编号：SYXK（云南）K2022-0004），饲养环境为自然光照控制，12小时明暗循环，室温22–26 °C，相对湿度40%–50%。经1周适应性饲养后，按1:2的雌雄比例合笼交配。交配1周后，将妊娠大鼠单笼饲养，正常喂养，自由饮食饮水。待其自然分娩后，选取健康出生的仔鼠。将仔鼠分为假手术组（Sham）、对照组（Control）和治疗组（Treatment），以观察选择性脊柱手法干预对脑性瘫痪仔鼠生长发育的影响。每组选取6只雄性仔鼠用于实验。治疗组自出生后第5天开始接受选择性脊柱手法干预th 出生后第1天开始给药，连续治疗6天，随后休息1天。

1. 建立脑性瘫痪模型

  1. 将显微镜、眼科剪刀、镊子、缝合线、手术板、剪刀、棉签和手术所需的手套进行灭菌处理，并放置于手术室内。
  2. 在出生后第3天，暂时将幼鼠与其母鼠分离，将其放入单独的容器中，并转运至无菌手术室。
  3. 测量幼鼠体重。选择体重在7–9 g范围内的幼鼠纳入研究，排除不符合体重标准的个体。将幼鼠随机分为假手术组（Sham）、对照组（Control）和治疗组（Treatment）。
  4. 使用小动物吸入式气体麻醉机，以2%浓度的异氟烷诱导麻醉，并以1%浓度维持麻醉。
    注：本实验主要观察选择性脊柱操作对脑瘫幼鼠生长发育的影响。建模过程中已按照常规要求实施麻醉，额外镇痛可能影响观察结果。
    1. 将小动物气体麻醉机接通电源，并打开与诱导箱相连的阀门。
    2. 将幼鼠放入诱导箱中，旋转浓度调节旋钮，将异氟烷浓度调节至2%，以诱导麻醉。
    3. 当幼鼠意识丧失后，将其从诱导箱中取出，放置于手术板上，并关闭麻醉机通道1。
    4. 将幼鼠仰卧位固定，并连接麻醉吸入面罩以维持麻醉状态。
    5. 打开连接麻醉吸入面罩的通道，通过旋转浓度调节旋钮，将异氟烷浓度调节至1%以维持麻醉。
      注：麻醉后，通过用力提拉并夹捏幼鼠脚趾和尾部评估麻醉深度。若夹捏脚趾和尾部无反应，则表明麻醉深度已达到要求。
  5. 用75%酒精对幼鼠颈部皮肤消毒三次，在颈部皮肤上做一条纵向1 cm切口，暴露皮下组织。
    注：颈部皮肤做纵向切口不会造成皮肤缺损。
  6. 在解剖显微镜下切开左侧颈部皮肤，使用眼科镊钝性分离胸骨舌骨肌与左侧胸锁乳突肌。
    1. 找到左侧颈总动脉和迷走神经，并分离左侧颈总动脉与迷走神经。
    2. 在模型组中，使用电凝笔切断左侧颈总动脉。清理创面后缝合颈部切口。
    3. 在假手术组中，仅分离左侧颈总动脉与迷走神经，不进行结扎或切断。
  7. 术后将幼鼠俯卧位置于恒温水浴中复苏1小时。
    注：自然恢复后，四肢及全身皮肤颜色转为红润，幼鼠可自主活动四肢并独立爬行。
  8. 将对照组和治疗组复苏后的幼鼠置于37 °C恒温孵育箱中，保持俯卧位，通入5%氧气与95%氮气的混合气体以诱导缺氧，持续2小时后取出幼鼠。
  9. 将完成缺氧处理的幼鼠从缺氧箱中取出，置于含正常大气氧浓度的容器中，保持俯卧位，并放入37 °C恒温水浴中1小时。待完全恢复后，将幼鼠放回母鼠笼中。
    注：自然恢复后，四肢及全身皮肤呈红色，幼鼠可自主活动四肢并独立爬行。
  10. 将假手术组幼鼠置于含正常大气氧浓度的容器中，将容器放入37 °C恒温水浴中1小时。待完全恢复后，将幼鼠放回母鼠笼中继续喂养。
    注：自然恢复后，四肢及全身皮肤呈红色，幼鼠可自主活动四肢并独立爬行。全部手术操作均在中国台湾云南中医药大学SPF级动物房专用手术室内完成。在复苏和缺氧过程中，操作人员需持续观察幼鼠状态，防止因体位不当导致死亡。哺乳期母鼠使用SPF级繁殖饲料喂养；幼鼠出生后第21天（postnatal day 21）具备自主进食能力时断奶22,23,24，改用SPF级维持饲料喂养。

2. 翻正反射实验

  1. 第4天th 出生后第2天（第2天）nd 建模后第1天，进行翻正反射实验以验证模型是否成功（图1 和 表1).
    1. 提起幼鼠的尾巴，将其背部置于水平板上，用拇指和食指固定其腹部和颈部。检查幼鼠是否能恢复至正常体位。由于翻正反射丧失，幼鼠无法从异常体位恢复至正常体位的情况被记录为造模成功。16,25.
    2. 记录每组幼鼠从仰卧位翻转至俯卧位所需的时间。当用拇指和食指将幼鼠呈仰卧位夹持后同时松开时开始计时，允许幼鼠自行翻转至俯卧位，当前后爪均接触地面时停止计时。若幼鼠未能在20秒内恢复正常体位，则记录其翻正时间为20秒。

3. 手术前准备

  1. 建模后，将脑性瘫痪的幼鼠与其母鼠分离，并置于室温恒定为22-26 °C的手术室中2分钟，以适应周围环境。
  2. 佩戴一次性手套，保持手掌温和柔软，温度维持在36-37 °C。
  3. 将幼鼠轻轻放置于左手掌中。弯曲左手拇指覆盖幼鼠双眼持续2分钟，以形成暗视野，使幼鼠适应操作者手掌的环境。使用右手的食指和中指进行操作。
    注意：遮盖幼鼠眼睛可营造黑暗环境，避免因不安全和不确定的环境导致幼鼠躁动，从而影响实验结果。

4. 将大鼠分为对照组和处理组

  1. 建模后第二天（P5），通过翻正反射试验验证模型，并将幼鼠随机分为对照组和治疗组。对治疗组幼鼠进行选择性脊柱操作。
  2. 将幼鼠置于俯卧位，确保脊柱始终保持水平直线状态（图2A）。
  3. 使用摩法对脊柱及两侧区域进行1分钟按摩，随后采用按揉法对脊柱及其两侧肌肉进行5分钟操作。
    1. 使用摩法按摩脊柱及两侧皮肤，以放松幼鼠并充分缓解其紧张状态。在幼鼠安静无躁动后，以每分钟100–120次的频率持续摩擦1分钟。
      1. 以右手食指、中指和无名指为接触面，从头至尾方向在颈椎、胸椎和腰椎的皮肤表面做环形摩擦运动，注意不扰动皮下组织。
      2. 以右手食指、中指和无名指为接触面，按照动物解剖学标准26，从头至尾依次在斜方肌、浅臀肌、颈菱形肌、胸菱形肌、背阔肌和腹外斜肌的皮肤表面做环形运动，注意不扰动皮下组织。
    2. 先对脊柱进行5分钟的按揉处理，再对脊柱两侧肌肉进行5分钟的按揉。
      1. 以每分钟120次的频率对脊柱进行5分钟按揉操作，使用右手食指或中指作为接触面。从头至尾方向在颈椎、胸椎和腰椎的皮肤表面做环形按揉，同时结合向下按压（1.77 ± 0.54 N），确保力量作用至颈椎、胸椎、腰椎及棘上韧带。
      2. 以每分钟120次的频率对脊柱两侧肌肉进行5分钟按揉操作，使用右手食指或中指作为接触面。根据动物解剖学标准26，从头至尾方向在斜方肌、浅臀肌、颈菱形肌、胸菱形肌、背阔肌和腹外斜肌的皮肤表面做环形按揉并施加1.77 ± 0.54 N的压力，使力量作用至上述肌肉组织（图2B）26。
  4. 以每分钟100–120次的频率，对敏感脊柱穴位点（如肝俞、心俞、脾俞、肾俞和肺俞27）进行2分钟的按揉操作。使用右手食指或中指作为接触面，在脑瘫幼鼠局部穴位（如肝俞、心俞、脾俞、肾俞和肺俞）的皮肤表面进行环形按揉并施加向下压力（1.77 ± 0.54 N）。
    注：穴位选择依据中国针灸学会实验针灸研究分会制定的"动物针灸穴位图谱"（图3）28。
  5. 以每分钟25次的频率，对患肢进行1分钟的捻法局部刺激。
    1. 用右手拇指与食指夹住脑瘫幼鼠的患肢，使两指施力对称，操作时用力轻柔、动作轻巧。来回摩擦幼鼠的桡侧腕长伸肌、指总伸肌、尺侧腕伸肌、指骨、指间关节、腓肠肌、半腱肌、跖骨及跖间关节。
  6. 以每分钟100–120次的频率，使用摩法从额部中线至脑后部操作1分钟。以右手食指为接触面，在幼鼠额部至后脑中部的假想连线上（即百会、风府、大椎一线）进行操作（图3）。
    注：按摩主要作用于皮肤，在脑瘫幼鼠头部皮肤表面做环形运动，无需带动皮下肌肉运动。
  7. 操作结束后，将幼鼠单独放置30分钟，再放回母鼠笼中。
    注：随着日龄增长，幼鼠体毛逐渐增厚，因此在按摩操作过程中需去除各组幼鼠背部毛发，以避免影响实验效果。

5. 检测局部穴位的温度

  1. 使用红外热成像仪检测操作前后局部穴位区域的温度。
    1. 在进行选择性脊柱按摩前，使用数据线将手机的Type-C接口与红外成像设备的USB接口连接，并打开电源按钮。
    2. 点击分析进入软件的手机终端，选择拍照进入拍照模式，然后点击右下角图片模式中的图片。
    3. 将摄像头对准幼鼠背部的大椎穴、心俞穴和肾俞穴区域（图3），进行温度拍摄。点击拍照完成图像采集，并以JPG格式保存。
    4. 使用数据线将计算机与设备连接，并将保存的图像上传至安装有Fotric软件的计算机进行分析。
      1. 在PC上打开Fotric软件，打开本地文件，找到图像所在位置。
      2. 选择热图工作区，选中待分析的图像，进入分析界面。
      3. 在分析界面中，选择右侧热图像框中的图片，并打开锁定。
      4. 选择缩放功能，调整热图像与左侧框内背景图像的大小使其重合，然后关闭右侧的锁定。
      5. 在顶部工具栏中找到设置测量矩形，并在图中标记待检测的穴位区域。
      6. 点击右侧的报告以记录温度值。

6. 检测脑瘫幼鼠的运动平衡功能

  1. 使用转棒实验检测行为功能19 用于检测假手术组、对照组和治疗组大鼠在第61天的运动功能st 出生后一天
    1. 参数设置：打开电源开关，选择 做实验 进入下一步，请选择 阳性，大鼠，时间 5 分钟 进入下一步，然后选择 加速度时间：10 秒，转速：10 转/分钟.
    2. 然后，将大鼠放置于跑台上，通过点击开始测试 运行 待其稳定后，调节每次运行的运行状态 开启每只大鼠训练一次，每次5分钟，然后开始进行三次测试。
    3. 训练结束后，将幼鼠放置于转棒仪跑道上。待其稳定后，点击 运行，并调整运行状态至 开启5 分钟结束时，选择 日期 记录每只大鼠首次从转棒仪跑轮上跌落的时间和速度，即运行时间数据。
  2. 使用足错步测试20,21 评估假手术组、对照组和治疗组大鼠右侧前肢运动功能的平衡能力st 出生后一天
    1. 将幼鼠置于水平梯的起始端，记录其穿过梯子到达另一端的视频（梯长100 cm，每级梯间距为2 cm）。每次训练结束后，对每只幼鼠以5分钟间隔进行三次正式测试。
    2. 使用慢速回放观察动物穿过梯子时的右前肢，按照评分标准进行评分，如评分标准所示（表2).

7. 蛋白质印迹法

  1. 按照先前所述方法对组织样本进行蛋白质印迹分析29。
    注意：裂解液的用量根据组织块的大小确定。所用抗体如下：一抗为抗生长激素抗体（0.5 µg [0.5 ng/泳道]）；抗生长激素受体抗体（1/1000）；内参抗体为抗β-肌动蛋白抗体（1/2000）；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG H&L（1/10000）。

8. 检测手部力量

  1. 佩戴用于检测按摩操作力度的设备至进行按摩的手部。将设备的传感器芯片固定在用于按摩幼鼠的手指上，并打开Power按钮。
  2. 将存储手动测试软件的硬盘接口连接至计算机，并在URL输入框中输入手动测试仪的专用IP地址。
  3. 在计算机上安装SpringVR客户端，点击进入采集界面，并在右下角选择Finger Pattern以测试操作力度。
  4. 选择Pressure选项并点击Start，开始记录操作者在操作过程中的手动施力。软件将自动记录按摩力度强度，并在本地磁盘生成数据表，文件名中包含PressureSensor的数据将保存于此。

9. 数据统计

注意：采用 SPSS26.0 软件进行统计分析，Graphpad Prism9.0.0 制作柱状图，Image J 用于蛋白条带的灰度值分析。

  1. 所有数据均以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示并进行分析和呈现。
    注意：检验标准为 α = 0.05，当 P ≤ 0.05 时认为差异具有统计学意义。由于数据通过方差分析和正态性检验，符合正态分布特征且方差齐性，因此采用 Fisher 检验。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

选择性脊柱操作可促进脑性瘫痪幼鼠的体重增长。
治疗期间，在出生后第3、14、28、42和61天测量体重（图4，表3）。出生后第3天，假手术组体重为5.53 ± 0.035 g，对照组体重为3.15 ± 0.43 g。治疗组体重为4.42 ± 0.13 g，在建模前与假手术组和对照组相比无显著差异。

出生后第14天，假手术组的体重为35.97 ± 1.019 g，对照组的体重为28.00 ± 0.7403 g，治疗组的体重为33.78 ± 3.705 g。治疗组与假手术组之间的体重差异无统计学意义。治疗组与对照组相比，体重差异具有统计学显著性（P < 0.01）。

第28天th 出生后第1天，假手术组的体重为104.9 ± 3.534 g，对照组的体重为80.35 ± 6.767 g，治疗组的体重为96.73 ± 7.638 g。治疗组与对照组相比，差异具有统计学意义（P < 0.01).

出生后第42天，假手术组的体重为194.1 ± 4.333 g，对照组的体重为138.0 ± 6.029 g，治疗组的体重为173.9 ± 5.433 g。治疗组与对照组之间的体重差异具有统计学意义（P < 0.0001）。

出生后第61天，假手术组的体重为321.5 ± 5.675 g，对照组的体重为230.3 ± 5.198 g，治疗组的体重为268.9 ± 15.22 g。P < 0.0001 被认为具有统计学显著性。治疗组与对照组之间的体重差异具有统计学显著性（P < 0.0001）。

选择性脊柱操作可改善脑性瘫痪患者的运动平衡功能。
第61天st 出生后第1天，在治疗结束后，我们进行了疲劳转棒实验。各组首次跌落时间分别为：假手术组 296.1 ± 1.65 s，对照组 102.7 ± 7.73 s，治疗组 220.1 ± 8.04 s。假手术组与对照组之间差异具有显著性（P < 0.0001）。治疗组与对照组之间的差异具有统计学显著性（P < 0.0001），且治疗组与假手术组之间的差异具有统计学显著性（P < 0.0001) (图5, 表4)

第61天st 出生后一天，治疗结束时，假手术组和对照组的足错步评分分别为 5.53 ± 0.03 和 3.15 ± 0.43。治疗组的评分为 4.42 ± 0.13，显著低于假手术组（P < 0.0001）。治疗组的评分显著高于对照组（P < 0.0001）。与治疗组和假手术组相比，差异具有统计学意义（P < 0.0001) (图6, 表5).

选择性脊柱操作可通过调节脑性瘫痪中生长激素的分泌水平。
在出生后第32天采集组织样本，选取脑性瘫痪大鼠的下丘脑进行Western blot分析，并选用相应的初级和次级抗体：初级抗体包括抗生长激素抗体、抗生长激素受体抗体，内参为抗β-肌动蛋白抗体；次级抗体为羊抗兔IgG H&L (HRP) (1/10000)。选择性脊柱操作可通过调节生长激素（GH）和生长激素受体（GHR）的表达，促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育（图7，表6）29。

促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育可提高海马中5-羟色胺和去甲肾上腺素的含量，从而改善其学习与记忆能力30。

选择性脊柱手法可有效提高局部穴位温度（图8，表7）。
采用红外热成像技术检测治疗组治疗前后局部穴位区域的温度。结果显示，治疗前温度维持在32.92 ± 0.55 °C，治疗后即刻为36.32 ± 0.15 °C，治疗后2分钟为35.32 ± 0.28 °C，治疗结束后5分钟为34.61 ± 0.17 °C，治疗结束后10分钟为34.28 ± 0.60 °C。与治疗前即刻温度相比，治疗后2分钟、5分钟和10分钟局部穴位区域的温度差异具有统计学意义（P < 0.05）。经选择性脊柱手法干预后，治疗组局部穴位区域的温度升高，并在一定程度上得以维持。

Rodent righting reflex analysis, bar chart results showing treatment effects on reflex time.
图1翻正反射。 (A右侧反射实验的示意图。右侧反射测试在第4天进行th 出生后第一天（造模后第二天）以验证造模成功。B各组翻正反射实验的柱状图（n = 6，均值 ± 标准差）。注：ns 表示无显著差异 P > 0.05，且无统计学差异。**** 表示 P < 0.0001，表明差异极显著。 请点击此处以查看此图的放大版本。

新生儿遗传学研究与实验手套；用于研究的小鼠幼崽检查。
图 2：选择性脊柱操作。（A）操作前对幼崽的处理。将新生大鼠置于操作者手掌中并保持安静，此为野外营地中的操作环境。（B）选择性脊柱操作示意图。按压并揉捏脊柱两侧的肌肉。请点击此处查看该图的放大版本。

人体与大鼠脊柱针灸穴位图，标注穴位；解剖结构与反射通路示意图。
图3：人体与SD大鼠背部穴位分布图。 （A）人体，（B）SD大鼠。C7：第七颈椎；GV14：大椎（GV14），位置：第七颈椎与第一胸椎之间，背部中线；T3：第三胸椎；BL13：肺俞（BL13），位置：第三胸椎下方两肋之间；T5：第五胸椎；BL15：心俞穴，位置：第五胸椎下缘两侧肋间隙；T7：第七胸椎；BL17：膈俞穴，位置：第七胸椎下缘下方肋间隙；BL18：肝俞穴，位置：第七胸椎下缘下方肋间隙；T11：第十一胸椎；GV6：脊中穴，位置：第十一与第十二胸椎棘突之间；BL20：脾俞穴，位置：第十二胸椎下方两肋之间；L2：第二腰椎；GV4：命门（GV4），位置：背部正中线，第二腰椎棘突下方凹陷处；BL23：肾俞穴，位置：第二腰椎两侧。GV20：百会（GV20），位置：顶骨中线；GV16：风府穴，位置：枕骨嵴后方枕寰枢关节背侧凹陷处。人体穴位的位置与动物在解剖位置上的穴位具有高度一致性。异常反应点靠近受神经支配体表的投射点。请点击此处查看该图的放大版本。

比较假手术组、对照组和治疗组在五个时间点的体重（克）的柱状图
图4：各组体重测量的柱状图（n = 6，均值 ± 标准差）。 注：ns P >0.05，无统计学差异；**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，差异具有统计学意义。请点击此处查看此图的放大版本。

转棒实验各组首次跌落时间的柱状图；假手术组、对照组、治疗组之间的统计学差异。
图5：各组在转棒实验中首次跌落时间的柱状图（n = 6，均值 ± 标准差）。 注：****P < 0.0001，差异具有统计学意义。 请点击此处查看该图的放大版本。

脚失误评分的柱状图；假手术组、对照组、治疗组之间的比较；统计学显著性。
图6：各组脚失误评分的柱状图（n = 6，均值 ± 标准差）。 注：****P < 0.0001，差异具有统计学显著性。 请点击此处查看此图的放大版本。

Western blot 分析；GHN、GHR 蛋白表达；Sham、对照、处理组；25kDa、70kDa 条带。
图 7：生长激素及其受体的 Western blot 条带。 采用 Western blot 检测各组生长激素在分子生物学水平的表达情况，观察选择性脊柱操作对生长激素的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

实验处理期间随时间变化的热成像图与温度变化柱状图。
图8：治疗前后温度监测。（上图）由红外热成像仪拍摄的热成像图。局部穴位区域的温度（°C）在推拿治疗前后由红外热成像仪记录。（A）推拿治疗前。（B）治疗结束时即刻的温度。（C）治疗后2分钟的局部穴位温度。（D）治疗结束后5分钟的局部穴位温度。（E）治疗后10分钟的局部穴位温度。（下图）治疗前后温度监测的柱状图（n = 3，均值 ± 标准差）。*P < 0.05，P < 0.01，* * * * *P < 0.001，* * * *P < 0.0001，差异具有统计学意义。请点击此处查看该图的放大版本。

组别病例数 (n)翻正反射/s
假手术组60.77 ± 0.10
对照组619.00 ± 2.04*
治疗组619.77 ± 0.55#

表1：脑性瘫痪幼鼠翻正反射的时间统计（均值 ± 标准差；n = 6） 每组幼鼠在第4天进行翻正反射测试th 出生后第2天（第2天）nd 建模后一天）以验证模型是否成功。* 与假手术组相比， P < 0.0001；# 与对照组比较， P < 0.0001.

评分评估标准
1当幼鼠被放置在水平梯子上时，其足部在承重时滑脱，影响行走
2当幼鼠被放置在梯子上时，其足部在承重时发生滑动，但不影响行走
3当幼鼠被放置在水平梯子上时，其足部快速移动至梯子的下一步，并在移动中承重
4当幼鼠被放置在水平梯子上时，其足部部分着地，并在承重的情况下横跨梯子移动
5当幼鼠被放置在水平梯子上时，其足部置于一个台阶上，并迅速移动至另一个台阶
6当幼鼠被放置在水平梯子上时，其足垫正确且完全地放置于台阶上，并充分承受身体重量

表2：足错步测试评分标准表

时间（天）病例数（n）组别
假手术组对照组治疗组
P368.52 ± 0.278.60 ± 0.088.45 ± 0.28D
P14635.97 ± 1.0128.00 ± 0.74*33.78 ± 3.70Ñ
P286104.9 ± 3.5380.35 ± 6.76*96.73 ± 7.63Ñ
P426194.1 ± 4.33138.0 ± 6.02*173.9 ± 5.43#D
P616321.5 ± 5.67230.3 ± 5.19*268.9 ± 15.22#D

表3：各组体重检测结果（均值 ± 标准差）（g）。 注：Ñ 与对照组比较，P < 0.01；° 与假手术组比较，P < 0.01；à 与对照组比较，P < 0.001；* 与假手术组比较，P < 0.0001；# 与对照组比较，P < 0.0001；D 与假手术组比较，P < 0.0001。

组别病例数 (n)转棒/时间/s
假手术组6296.1 ± 1.65
对照组6102.7 ± 7.73*
治疗组6220.1 ± 8.04#D

表4：各组幼鼠转棒实验结果（均值 ± 标准差）（秒）。 注：* 与假手术组比较，P < 0.0001；# 与对照组比较，P < 0.0001；D 与假手术组比较，P < 0.0001。

组别病例数 (n)足错步评分
假手术组65.53 ± 0.03
对照组63.15 ± 0.43*
治疗组64.42 ± 0.13#D

表5：各组足错步分数（均值 ± 标准差）。 注：* 与假手术组比较，P < 0.0001；# 与对照组比较，P < 0.0001；D 与假手术组比较，P < 0.0001。

组别GHGHR
假手术组2.325 ± 0.8301.469 ± 0.265
对照组1.563 ± 0.070#1.563 ± 0.070Ñ
治疗组2.471 ± 0.956*2.471 ± 0.956&

表6：生长激素和生长激素受体Western blot条带灰度值数据（n = 10）。GH：* 治疗组与对照组之间的两两比较（P = 0.020 < 0.05）显示差异具有统计学意义；# 假手术组与对照组之间的两两比较（P = 0.022 < 0.05）显示差异显著；治疗组与假手术组之间的两两比较无统计学意义（P = 0.076 > 0.05）；GHR：& 治疗组与对照组之间的两两比较（P = 0.024 < 0.05）显示差异显著；Ñ 假手术组与模型组之间的两两比较（P = 0.021 < 0.05）显示差异具有统计学意义；治疗组与假手术组之间的两两比较无统计学意义（P = 0.085 > 0.05）。

治疗时间病例数 (n)温度
治疗前332.92 ± 0.55
立即336.32 ± 0.15*
2分钟后335.32 ± 0.28#
5分钟后334.61 ± 0.17Ñ
10分钟后334.28 ± 0.60Dà

表7：治疗前后体温监测结果（均值 ± 标准差）（°C）。 注：* 与治疗前相比，P < 0.0001；# 与治疗前相比，P < 0.001；D 与治疗后0分钟相比，P < 0.001；Ñ 与治疗前相比，P < 0.01；à 与治疗前相比，P < 0.05。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于缺血和缺氧是脑性瘫痪的重要致病因素，国际公认建立脑性瘫痪模型的方法是结合缺氧制备脑性瘫痪模型16,31,32,33。脑性瘫痪发生时会导致全面性发育迟缓，包括体重和运动功能，这可能与生长激素分泌水平有关34。本研究采用选择性脊柱操作治疗脑性瘫痪幼鼠，治疗期间监测体重变化，并进行Rotarod实验、足错步评分及生长激素检测。治疗前后观察局部穴位温度变化。在建立缺血-缺氧模型后，脑性瘫痪幼鼠出现体重下降，但随着按摩疗程的延长，治疗组的体重增长显著优于对照组，且在调节生长激素分泌方面也具有明显优势。这些结果表明，选择性脊柱操作可有效改善脑性瘫痪幼鼠的生长发育状况。此外，由于采用结扎左侧颈总动脉并结合缺氧的方法建立模型，必然造成左侧皮层损伤，从而导致运动功能障碍。治疗后，我们通过Rotarod实验和足错步评分检测脑性瘫痪幼鼠的行为能力35,36,37，发现经选择性脊柱操作后，脑性瘫痪大鼠的运动功能得到改善38。因此，选择性脊柱操作可有效促进脑性瘫痪幼鼠的生长发育并改善其运动功能。

传统中医按摩基于穴位和经络系统。本实验的设计主要是观察传统中医按摩对脑性瘫痪幼鼠生长发育的影响。按摩治疗主要作用于足太阳膀胱经的第一、第二侧线以及督脉，但与针刺不同，按摩的刺激点位置并不明确。按摩是一种体表刺激方式，操作者以手指进行腹部操作，接触面具有一定面积范围，约为直径1.0 cm的圆形区域。经络本身也具有一定范围，然而人手指的接触面积大于SD大鼠的穴位区域，这意味着在操作过程中不可避免地会涉及一些非穴位部位。因此，在本研究分组时，未单独设立非经络按摩组作为对照。

选择性脊柱推拿在操作过程中选取脊柱及脊柱两侧肌肉进行刺激，可缓解局部肌肉痉挛，促进局部血液循环，改善相应神经支配区域的功能，从而达到疏通经络、调和气血及整体调节治疗的效果。该疗法充分体现了中医整体观念、中医经络理论与脊神经支配原理的有机结合，在对脑性瘫痪进行局部治疗的同时兼顾整体调节8。

在操作过程中，通过对脊柱及其两侧的肌肉和韧带进行按摩治疗，即对督脉以及足太阳膀胱经第一、第二侧线进行按摩刺激，可起到沟通背部穴位、脊髓与大脑之间联系的作用。因此，当我们在幼鼠背部穴位进行手法操作时，能够刺激背部的穴位和经络，推动气血运行，调节机体脏腑功能，进而影响脊髓和大脑的功能，促进幼鼠的生长发育。总体而言，通过刺激督脉及足太阳膀胱经第一、第二侧线，可激发全身之阳气，增强机体整体抗病能力，体现了中医的整体观念16,29,38,39,40,41。督脉起于人体下腹部，沿脊柱上行至头顶部，具有调节人体阳气的作用39。足太阳膀胱经主要循行于督脉两侧，五脏的背俞穴均位于足太阳膀胱经的第一侧线上，参与脏腑疾病的治疗42,43。经络系统包括浮络、孙络以及皮部。因此，当我们在脑瘫幼鼠背部皮肤实施该操作时，可沿经络走向进行手法操作，有效刺激浮络、孙络和皮部。通过刺激穴位与经络以促进气血运行，调节机体脏腑功能，最终实现幼鼠体重的增加8。

我们在脑瘫患儿背部足太阳膀胱经上发现了条索状反应点，并采用红外热成像技术检测到部分穴位存在温度异常。结合脊神经支配原理，我们发现这些反应点靠近神经支配区域在体表的投射点，这与选择性脊神经根切断术治疗脑瘫的原理相一致（图3）44。穴位具有贯通经络、运行气血、联络体表与脏腑器官的作用45,46。因此，在治疗脑瘫幼鼠时，采用选择性脊柱手法作用于背部穴位，以激活局部穴位，疏通经络、气血，使穴位处于热敏化状态47。治疗操作后，仍可维持一定的温度。

采用在右侧肢体进行旋转手法，可缓解局部肌肉组织的痉挛，减轻局部经络阻滞，改善局部功能障碍。最后选择对头部进行推拿治疗，是因为头为诸阳之会，是五脏六腑精气与血液汇聚之处。对该部位进行治疗，可调和阴阳，达到整体康复的效果16,18。综上所述，选择性脊柱手法可有效改善脑性瘫痪幼鼠的体重、运动功能及生长激素水平，促进其生长发育。

在操作过程中仍有一些重要事项需要注意。首先，应注意在治疗前使幼鼠适应手掌温度，并确保摇动条件稳定。操作者需佩戴一次性手套，以避免因直接接触操作者皮肤而导致雌性大鼠弃仔。操作前，操作人员必须接受统一的操作培训，并在通过考核后方可进行操作。本研究中使用了特定的手法测试仪进行检测，以确保操作的标准化。由于我们观察到脑瘫幼鼠在生长过程中体重发生变化，因此必须定期检查手法操作。按压和揉捏时，向下的压力应保持垂直，力度应由轻到重，平稳而持续，以使刺激感充分到达机体深层组织，切忌使用迅猛暴力。揉捏的范围应先小后大，力度应先轻后重。揉法操作需达到肌肉和韧带层次。通过手法测试仪监测，手动施加的力为1.77 ± 0.54 N。相比之下，摩擦操作仅作用于皮肤表面。此外，脑瘫幼鼠的皮肤较为娇嫩，操作不当可能导致皮肤损伤。

作为中医的一种外治疗法，选择性脊柱手法是脑瘫现有治疗方法的有效补充，也是一种多样化的脑瘫治疗手段。该方法兼顾整体与局部治疗，可为脑瘫患儿提供全面的康复干预，同时为患儿家庭及社会带来更好的经济效益和社会效益。然而，该技术也存在一些不足之处：由于操作者对手法的理解和掌握程度不同，手法的统一性较差，可能导致治疗效果出现偏差，疗效尚不确切。下一步需使该手法达到统一规范的标准。尽管我们已证实选择性脊柱手法对脑瘫幼鼠的生长发育具有积极影响，并可通过调节炎症稳态发挥治疗作用，但其对神经可塑性及白质再生的作用机制仍需进一步研究。

由于选择性脊柱手法具有确切的疗效和科学理论依据，基于选择性脊柱手法的操作理论，该手法体系可拓展用于治疗其他儿科疾病，如儿童生长发育迟缓、语言发育迟缓等。这为大多数医务工作者和研究人员提供了研究思路，丰富了治疗体系。因此，本文有助于推广和应用该技术。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明本研究不存在任何竞争性经济利益或其他利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到国家自然科学基金面上项目（82374614）、云南省科技厅重大生物医药项目（202102AA100016）、云南省科技厅应用基础研究联合重点项目 云南省科学技术厅—云南中医药大学（201901AI070004）；云南省高校针灸推拿防治脑病重点实验室（2019YGZ04）；云南省科学技术厅—云南省基础研究计划青年项目（202101AU070002）；云南省教育厅科学研究基金研究生项目（2023Y0433）；云南省教育厅科研基金（2023Y0462）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔板北京兰杰科生物科技有限公司11510蛋白质浓度测定
抗β-肌动蛋白抗体AbacmAb8227稀释比例：1/2000
抗生长激素抗体AbacmAb1268820.5 µg（0.5 ng/泳道）
抗生长激素受体抗体AbacmAb202964稀释比例：1/1000
基础手术显微镜操作上海宇彦科学仪器有限公司SM-101在建模过程中，在显微镜下分离颈总动脉
BCA 显色剂碧云天生物技术有限公司P0010蛋白质浓度测定
化学发光成像系统上海勤翔科学仪器有限公司100240073蛋白质条带成像
直接上样彩色预染蛋白 Marker北京康润诚业生物科技有限公司（GenStar）M221蛋白质印迹法
DK-30自动制冰机河南兄弟仪器设备有限公司SHDX0023制冰
ECL 化学发光底物试剂盒北京兰杰科生物科技有限公司BL520B将曝光胶片中的潜影转化为可见影像
电热恒温水浴锅TAISITE INSTRUMENTDK-98-II建模后对幼年大鼠进行复苏
电子天平昆山友科纬电子科技有限公司CN-LQC10002幼年大鼠的体重被测量
德国小型白色电凝笔止血器HaohangL55×W125×H37用于凝固左侧颈总动脉
手套江苏扬子利德医疗器械有限公司Q/320684 YZYL001-2017用于按摩操作
甘氨酸北京索莱宝科技有限公司货号#G8200电泳溶液，配置转移液
Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP） AbacmAb6721稀释比例：1/10000
智能型实验室超纯水机重庆华创水处理工程有限公司N/A过滤（15 L）
异氟烷山东安特畜牧科技有限公司15198麻醉通过诱导在幼年大鼠中维持
LinkIRFOTIRCV1.3.2.134红外图像分析软件
低温高速组织研磨机武汉赛维尔生物科技有限公司SKZ3F20200191组织研磨
甲醇广东光华科技股份有限公司20220519配置转移液
Mini-PROTEAN Tetra博乐生命医疗产品（上海）有限公司552BR 233193电泳
Multiskan Spectrum 微孔板分光光度计TECAN火花检测组织蛋白的吸光度和浓度
压力感应智能手套济南超感智能科技有限公司Miiglove用于测量操作者的手部操作力量
PVDF膜默克密理博公司 IPVH00010 蛋白质印迹法
冷藏离心机Hettich Precision Technology (Zhuhai) Co., LTDMIKRO 220R离心
三合一热成像仪研究FOTIRC226S（384 × 288）温度测量
RIPA 裂解液北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）R0010裂解组织
SHA-CA 数显水浴恒温振荡器常州奥华仪器有限公司SHA-CA幼年大鼠被用于缺氧实验
六鼠疲劳转棒仪上海多易实业有限公司DO01104RT703CP运动功能被检测到
脱脂奶粉广州赛国生物科技有限公司（BIOFROXX）1172GR500限制液体
SPF 级繁殖饲料SPF（北京）生物技术有限公司A1EC30005A1S4285266哺乳期雌性大鼠被喂食
SPF 维持饲料SPF（北京）生物技术有限公司A1EC30005A1S4285267断奶后给幼崽喂食
外科手术板上海宇彦科学仪器有限公司51002在幼年大鼠中建立了模型手术台
TS-200 轨道摇床海门麒麟贝尔制造有限公司TS-8S凝胶固定
Tween 80MedChemExpressHY-Y1819配置 TBST 
ZS-MV 便携式麻醉机中实科技 &技术ZS-MV-I在实验动物中诱导并维持麻醉

参考文献

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