本方案研究富含细胞外囊泡（EV）的血浆作为评估EV凝血能力的指标。通过差速离心法及随后的再钙化过程获得富含EV的血浆。
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摘要
摘要
细胞外囊泡（EV）在多种疾病中的作用正受到越来越多的关注，尤其是因其具有强大的促凝血活性。然而，临床环境中迫切需要一种可用于床旁检测EV促凝血活性的检测方法。本研究提出以富含EV血浆的凝血酶激活时间作为评估EV促凝血活性的指标。采用标准化操作获取枸橼酸钠抗凝的全血，随后通过差速离心法获得富含EV的血浆。将富含EV的血浆与氯化钙加入检测杯中，利用分析仪实时监测黏弹性变化。由此测定富含EV血浆的自然凝固时间，称为EV-ACT。结果显示，当从健康志愿者血浆中去除EV后，EV-ACT显著延长；而EV富集后则显著缩短。此外，在子痫前期、髋部骨折和肺癌患者的样本中，EV-ACT明显缩短，提示这些患者血浆EV水平升高，并促进血液高凝状态。由于操作简便、快速，EV-ACT有望成为评估高EV血浆水平患者凝血功能的床旁检测工具。
引言
血栓形成由高凝状态引起，在多种疾病中发挥重要作用，包括脑外伤1、子痫前期2、肿瘤3以及骨折患者4。高凝状态的机制复杂，近年来研究重点集中在细胞外囊泡（EV）在凝血功能障碍中的作用。EV 是具有双层结构的囊泡样结构，从细胞膜脱落，直径范围为 10 nm 至 1000 nm，与多种疾病过程相关，尤其是凝血障碍5。多项研究已将 EV 鉴定为血栓风险的潜在预测指标6,7。EV 的促凝活性取决于凝血因子的表达，主要是组织因子（TF）和磷脂酰丝氨酸（PS）。具有强促凝活性的 EV 显著增强凝血酶原酶复合物和凝血酶原复合物的催化效率，从而促进凝血酶介导的纤维蛋白原转化及局部血栓形成8。在多种疾病中已观察到 EV 水平升高及其与高凝状态之间的因果关系9。因此，标准化 EV 的检测并报告其促凝活性是当前重要的研究方向10。
迄今为止，可用于检测细胞外囊泡（EVs）促凝活性的商用试剂盒仅有少数几种。由某....
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方案
人源样本的采集已获天津医科大学总医院医学伦理委员会批准。人源静脉血的采集严格遵循中国国家卫生健康委员会发布的WS/T 661-2020《静脉血液标本采集指南》。简要而言，在取得知情同意后，从健康个体的前臂静脉采血，并以1:9的比例使用3.2%枸橼酸钠抗凝剂混匀样本。当仅采集枸橼酸钠抗凝标本时，弃去第一管血液。样本采集后0.5小时内即开始处理流程。在取得知情同意后，招募成年健康受试者进行样本采集。患者的排除标准为：（1）近期发生血管内血栓，（2）肝肾功能障碍，（3）高血压、高脂血症、糖尿病及其他慢性疾病，（4）正在接受阿司匹林或抗凝治疗，（5）处于月经期或妊娠期。
1. 富含细胞外囊泡血浆的分离
- 在室温下以 120 × g 离心 20 分钟，去除血细胞。上清液为富血小板血浆。然后用移液器将上清液的上半部分转移至新的离心管中。
- 在室温下以 1500 × g 离心 20 分钟，去除血小板。上清液为乏血小板血浆。然后将上清液的上半部分转移至新的离心管中。
- 在室温下以 13000 × g 离心 2 分钟，去除细胞碎片。上清液为富含细胞外囊泡（EV）的血浆。然后将上清液的上半部分转移至新的离心管中，用于后续检测。
2. 利用分析仪检测样本中的EV-ACT
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结果
采用血浆凝固时间测定用的粘弹性方法分析仪，测定富含细胞外囊泡（EV）血浆的凝血酶激活时间。该仪器由四个主要部件组成：电子信号转换器、探针、检测槽和加热元件（图1A，B）。探针利用高频低幅振荡来检测血浆黏度的变化。日常质量控制主要包括空气质控，用于评估检测平台的稳定性并识别探针对任何物理干扰的影响。性能质控则通过标准黏度油进行测试，以确保探针检测到的阻力值处于设定范围内。
获得富含细胞外囊泡（EV）的血浆后，采用流式细胞术对样本进行细胞外囊泡检测以实施质量控制。不合格样本在EV“门控”附近呈现出一个粒径略大的独立群集（图2A）；相比之下，合格的富含EV样本则显示大部分信号作为单一群体位于EV“门控”范围内（图2B）。
为了评估健康志愿者富含细胞外囊泡（EV）的血浆样本中EV的浓度，进行了超速离心（1,00,000 × .......
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讨论
本研究描述了富含细胞外囊泡（EV）的血浆的制备方法，并通过流式细胞术验证了该方法的合理性。随后，采用基于黏弹性原理的凝血分析仪对再钙化的血浆样本进行活化凝血时间（ACT）检测24。如图3A所示，通过超速离心获得的EV浓度可缩短EV-ACT时间，而超速离心后的上清液（EV含量降低）则表现出延长的EV-ACT时间。这些结果表明EV-ACT结果与EV水平之间存在密切关系。在图3B中，将子痫前期、髋部骨折和肺癌患者的血浆样本与健康志愿者进行比较，发现疾病组的EV-ACT时间显著缩短。既往研究报道，这些疾病的血浆中促凝血EV水平升高27,28,29。然而需要注意的是，血浆中其他因素也可能影响EV-ACT的结果，尚需进一步探讨这些影响因素。本检测方法旨在强调EV在某些疾病高凝状态中的关键作用，并弥补.......
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披露
所有作者均声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（项目编号：81930031、81901525）的资助。此外，我们感谢天津世纪医康科技发展有限公司为我们提供设备和技术指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AccuCount Ultra Rainbow 荧光微粒 | 3.8 微米；Spherotech，美国伊利诺伊州莱克福里斯特 | 用于微囊泡（MP）的定量检测 | |
| 氯化钙 | Werfen（中国） | 0020006800 | 20 mM |
| Century 血凝分析仪 | 天津世纪益康医药科技发展有限公司 | 原理是通过粘弹性法测定血浆黏度 | |
| 一次性探针和检测杯 | 天津世纪益康医药科技发展有限公司 | ||
| LSR Fortessa 流式细胞仪 | BD，美国 | 用于检测微囊泡（MP） | |
| Megamix 聚苯乙烯微球 | Biocytex，法国马赛 | 7801 | Megamix 包含选定直径的微珠混合物：0.5 µm、0.9 µm 和 3 µm。 |
参考文献
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Op....
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重印与许可
