利用细胞外囊泡激活凝血时间（EV-ACT）测定细胞外囊泡（EV）的促凝活性

摘要

本方案研究富含细胞外囊泡（EV）的血浆作为评估EV凝血能力的指标。通过差速离心法及随后的再钙化过程获得富含EV的血浆。

摘要

细胞外囊泡（EV）在多种疾病中的作用正受到越来越多的关注，尤其是因其具有强大的促凝血活性。然而，临床环境中迫切需要一种可用于床旁检测EV促凝血活性的检测方法。本研究提出以富含EV血浆的凝血酶激活时间作为评估EV促凝血活性的指标。采用标准化操作获取枸橼酸钠抗凝的全血，随后通过差速离心法获得富含EV的血浆。将富含EV的血浆与氯化钙加入检测杯中，利用分析仪实时监测黏弹性变化。由此测定富含EV血浆的自然凝固时间，称为EV-ACT。结果显示，当从健康志愿者血浆中去除EV后，EV-ACT显著延长；而EV富集后则显著缩短。此外，在子痫前期、髋部骨折和肺癌患者的样本中，EV-ACT明显缩短，提示这些患者血浆EV水平升高，并促进血液高凝状态。由于操作简便、快速，EV-ACT有望成为评估高EV血浆水平患者凝血功能的床旁检测工具。

引言

血栓形成由高凝状态引起，在多种疾病中发挥重要作用，包括脑外伤¹、子痫前期²、肿瘤³以及骨折患者⁴。高凝状态的机制复杂，近年来研究重点集中在细胞外囊泡（EV）在凝血功能障碍中的作用。EV 是具有双层结构的囊泡样结构，从细胞膜脱落，直径范围为 10 nm 至 1000 nm，与多种疾病过程相关，尤其是凝血障碍⁵。多项研究已将 EV 鉴定为血栓风险的潜在预测指标^6,7。EV 的促凝活性取决于凝血因子的表达，主要是组织因子（TF）和磷脂酰丝氨酸（PS）。具有强促凝活性的 EV 显著增强凝血酶原酶复合物和凝血酶原复合物的催化效率，从而促进凝血酶介导的纤维蛋白原转化及局部血栓形成⁸。在多种疾病中已观察到 EV 水平升高及其与高凝状态之间的因果关系⁹。因此，标准化 EV 的检测并报告其促凝活性是当前重要的研究方向¹⁰。

迄今为止，可用于检测细胞外囊泡（EVs）促凝活性的商用试剂盒仅有少数几种。由某商业公司生产的MP-活性检测法（MP-Activity assay）和MP-TF检测法（MP-TF assay）是用于测定血浆中EV促凝活性的功能性检测方法¹¹。这些检测方法采用类似于酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理，用于检测EV表面的磷脂酰丝氨酸（PS）和组织因子（TF）。然而，这些试剂盒价格昂贵，仅限于少数高水平研究机构使用。其操作流程复杂且耗时，难以在临床环境中推广应用。此外，一种 commercially developed 促凝磷脂（PPL）检测法将不含PS的血浆与待测血浆混合，通过测定凝血时间来定量检测PS阳性EV的水平¹²。然而，这些检测方法主要关注EV上的PS和TF，忽略了循环EV可能参与的其他凝血通路¹²。

凝血系统十分复杂，包含 "不可见的" 和 "可见的" 成分，包括凝血因子、抗凝因子、纤溶系统以及悬浮在血浆中的细胞外囊泡（EVs）。生理状态下，这些成分维持着动态平衡。在病理条件下，循环中显著增加的细胞外囊泡可导致高凝状态，尤其见于脑外伤、子痫前期、骨折及多种癌症患者。¹³目前，临床实验室对凝血状态的评估主要涉及凝血系统、抗凝系统和纤溶系统的检测^14,15,16,17凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间及国际标准化比值常用于评估凝血系统中凝血因子的水平¹⁸然而，近期研究表明，这些检测方法并不能充分反映某些疾病的高凝状态¹⁹其他检测方法，如血栓弹力图（TEG）、旋转式血栓弹力图和Sonoclot分析，可测量全血的黏弹性变化^20,21由于全血样本中含有大量血细胞和血小板，这些检测更有可能反映样本整体的凝血状态。一些研究人员已报道了血细胞和血小板在促凝活性中的作用^22,23最近一项研究还发现，既往的凝血功能检测在识别微颗粒促凝活性变化方面存在困难²⁴因此，有研究提出了一种假设，即通过黏弹性测量富含细胞外囊泡（EV）血浆的活化凝血时间（ACT），可评估EV的促凝血功能。

方案

人源样本的采集已获天津医科大学总医院医学伦理委员会批准。人源静脉血的采集严格遵循中国国家卫生健康委员会发布的WS/T 661-2020《静脉血液标本采集指南》。简要而言，在取得知情同意后，从健康个体的前臂静脉采血，并以1:9的比例使用3.2%枸橼酸钠抗凝剂混匀样本。当仅采集枸橼酸钠抗凝标本时，弃去第一管血液。样本采集后0.5小时内即开始处理流程。在取得知情同意后，招募成年健康受试者进行样本采集。患者的排除标准为：（1）近期发生血管内血栓，（2）肝肾功能障碍，（3）高血压、高脂血症、糖尿病及其他慢性疾病，（4）正在接受阿司匹林或抗凝治疗，（5）处于月经期或妊娠期。

1. 富含细胞外囊泡血浆的分离

1. 在室温下以 120 × g 离心 20 分钟，去除血细胞。上清液为富血小板血浆。然后用移液器将上清液的上半部分转移至新的离心管中。
2. 在室温下以 1500 × g 离心 20 分钟，去除血小板。上清液为乏血小板血浆。然后将上清液的上半部分转移至新的离心管中。
3. 在室温下以 13000 × g 离心 2 分钟，去除细胞碎片。上清液为富含细胞外囊泡（EV）的血浆。然后将上清液的上半部分转移至新的离心管中，用于后续检测。

2. 利用分析仪检测样本中的EV-ACT

1. 开启凝血分析仪（参见材料表），并将仪器预热至 37 °C。安装一次性探针和检测杯，然后启动仪器的质量控制程序。
   注意：当屏幕上显示的黏滞阻力信号值呈一条直线时，表明检测未受干扰，分析仪状态的质量控制合格。自检合格后，可开始检测程序。
2. 将样本信息输入系统。随后，将 200 µL 富含细胞外囊泡（EV）的血浆转移至检测杯中，再加入 20 mM 的氯化钙溶液 170 µL。点击启动按钮。检测杯内的磁力搅拌棒将充分混匀样本与氯化钙。关闭盖子，探针将开始检测样本阻力的变化。
   ​注意：检测完成后，分析仪将自动提示"检测完成"。EV-ACT 时间由系统显示并记录，结果以时间单位"秒"表示。丢弃探针和检测杯。

3. 基于流式细胞术的EV富集血浆样本质量控制

1. EVs 最初是根据其大小（0.1–1 µm）被识别的。预先调整流式细胞仪的参数并设定 "门控" 使用市售聚苯乙烯微球（0.5、0.9 和 3.0 µm）进行细胞外囊泡（EV）的分离（参见 材料表).
   注意：微珠混合物包含不同直径的荧光微球，用于覆盖微囊泡（0.5 和 0.9 µm）和血小板（0.9 µm 和 3 µm）的粒径范围。
2. 调节前向散射和侧向散射的电压，确保0.9 µm微球位于适当区域。可根据微球直径划定EV区域。
3. 将50 µL富含EV的血浆转移至流式管中，随后加入450 µL过滤后的磷酸盐缓冲液。充分混匀流式管中的液体。最后，使用流式细胞术检测样品。²⁵.
4. 使用超彩虹荧光微粒（参见 材料表) 以定量EV的数量。简言之，在流式检测前向样品中加入10 µL颗粒，样品检测完成后，按以下公式计算EV浓度：10,120 × EV（#）/（微珠数 × 体积）× 稀释因子²⁶.

结果

采用血浆凝固时间测定用的粘弹性方法分析仪，测定富含细胞外囊泡（EV）血浆的凝血酶激活时间。该仪器由四个主要部件组成：电子信号转换器、探针、检测槽和加热元件（图1A，B）。探针利用高频低幅振荡来检测血浆黏度的变化。日常质量控制主要包括空气质控，用于评估检测平台的稳定性并识别探针对任何物理干扰的影响。性能质控则通过标准黏度油进行测试，以确保探针检测到的阻力值处于设定范围内。

获得富含细胞外囊泡（EV）的血浆后，采用流式细胞术对样本进行细胞外囊泡检测以实施质量控制。不合格样本在EV“门控”附近呈现出一个粒径略大的独立群集（图2A）；相比之下，合格的富含EV样本则显示大部分信号作为单一群体位于EV“门控”范围内（图2B）。

为了评估健康志愿者富含细胞外囊泡（EV）的血浆样本中EV的浓度，进行了超速离心（1,00,000 × ...

讨论

本研究描述了富含细胞外囊泡（EV）的血浆的制备方法，并通过流式细胞术验证了该方法的合理性。随后，采用基于黏弹性原理的凝血分析仪对再钙化的血浆样本进行活化凝血时间（ACT）检测²⁴。如图3A所示，通过超速离心获得的EV浓度可缩短EV-ACT时间，而超速离心后的上清液（EV含量降低）则表现出延长的EV-ACT时间。这些结果表明EV-ACT结果与EV水平之间存在密切关系。在图3B中，将子痫前期、髋部骨折和肺癌患者的血浆样本与健康志愿者进行比较，发现疾病组的EV-ACT时间显著缩短。既往研究报道，这些疾病的血浆中促凝血EV水平升高^27,28,29。然而需要注意的是，血浆中其他因素也可能影响EV-ACT的结果，尚需进一步探讨这些影响因素。本检测方法旨在强调EV在某些疾病高凝状态中的关键作用，并弥补...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AccuCount Ultra Rainbow 荧光微粒	3.8 微米；Spherotech，美国伊利诺伊州莱克福里斯特		用于微囊泡（MP）的定量检测
氯化钙	Werfen（中国）	0020006800	20 mM
Century 血凝分析仪	天津世纪益康医药科技发展有限公司		原理是通过粘弹性法测定血浆黏度
一次性探针和检测杯	天津世纪益康医药科技发展有限公司
LSR Fortessa 流式细胞仪	BD，美国		用于检测微囊泡（MP）
Megamix 聚苯乙烯微球	Biocytex，法国马赛	7801	Megamix 包含选定直径的微珠混合物：0.5 µm、0.9 µm 和 3 µm。