方法文章

通过逆转录环介导的等温扩增检测 SARS-CoV-2 病毒

DOI：

10.3791/65662

⸱

2023年9月8日

 ,  ,  , 
1Facultad de Ingeniería, Diseño y Ciencias Aplicadas, Universidad Icesi, 2Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC), Department of Biological Sciences, Universidad de los Andes, 3BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S, Universidad Icesi

本文内容

摘要

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在这里，我们提供了一个完整的协议，用于标准化和实施通过逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP） 检测人类样本中 SARS-CoV-2 病毒的方法。这种方法在 60 分钟内完成，可以以低成本和廉价的设备适用于任何实验室或护理点。

摘要

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严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 病毒对人类健康产生了巨大影响。它仍然是对现代社会的威胁，因为许多人因感染而死亡。该疾病通过血清学和分子检测进行诊断，例如金标准实时聚合酶链反应 （RT-PCR）。后者有几个缺点，因为它需要专门的基础设施、昂贵的设备和训练有素的人员。在这里，我们提出了一种协议，概述了在人类样本中使用逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP） 检测 SARS-CoV-2 病毒所需的步骤。该方案包括 计算机模拟设计引物、制备试剂、扩增和可视化的说明。一旦标准化，这种方法可以在 60 分钟内以低成本和廉价的设备轻松实施并适应任何实验室或护理点。它适用于检测不同的病原体。因此，它有可能在现场和卫生中心使用，以开展及时的流行病学监测。

引言

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严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 导致 2019 冠状病毒病 （COVID-19）。世界卫生组织于 2020 年 1 月 30 日宣布为国际关注的突发公共卫生事件，并于 2020 年 3 月 11 日宣布为大流行。截至本文撰写之日，大流行已导致超过 7.6 亿例病例和 687 万人死亡1.

这种病毒的影响凸显了需要更好、更准确、更快和更广泛可用的监测工具，以改善传染病的检测和控制2,3。在大流行期间，SARS-CoV-2 诊断测试基于检测核酸、抗体和蛋白质，但核酸的 RT-PCR 检测是金标准4。然而，RT-PCR有一些局限性;它需要专门的设备、基础设施和接受过分子生物学培训的人员，将其应用限制在专业实验室。此外，它很耗时（4-6 小时），不包括将标本运送到实验室的时间，这可能需要第5 天。这些制约因素妨碍了有效的样本处理和获取应急计划和流行病学管理所需的信息。

与RT-PCR相比，逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）具有多项优势，使其成为设计未来即时诊断检测（POCT）的有吸引力的策略，特别是在资源

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方案

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使用的样本由 Fundación Valle del Lili 大学医院的临床实验室提供，对应于 使用 RT-qPCR 技术检测出 COVID-19 阳性的患者的纯化 RNA。所有患者都为研究提供了知情同意书，该研究得到了 Fundación Valle del Lili 大学医院的人类研究生物伦理委员会的批准。

1. RT-LAMP底漆设计与制备

注:LAMP 引物可用于多种平台，包括 New England BioLabs （NEB） LAMP、Primer Explorer 和 LAMP assay versatile analysis （LAVA）。但是，对于此协议，使用了NEB LAMP工具。可以使用从 NextStrain 数据库10 获得的 SARS-CoV-2 基因组进行引物设计。 表1 显示了该协议中使用的引物组。

  1. LAMP的底漆设计
    1. 获取病毒基因组序列。
    2. 执行序列比对以获得共识序列。
    3. 导航到 NEB LAMP 引物设计工具平台11，并按照快速指南中的说明进行操作。该工具产生与引物探索器 V5 相同的结果，但它的输出更加人性化。使用引物浏览器用户手册作为引物设计的指....

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结果

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该协议的实施首先要按照上述协议为每个靶基因设计一组引物。2020 年 6 月，从 NextStrain 数据库获得了 5,000 个 SARS-CoV-2 基因组，哥伦比亚基因组的代表性为 10%。对这些序列进行比对，以获得引物设计过程中使用的共识序列。 表 1 显示了为引物 RdRp/Hel 和 RdRp 选择的引物组。基因 N 扩增的引物组来自先前发表的报告14。

协议标准化的第一步是避免NTC放大。在这方面，必须验证的最重要参数之一是确定引物组的最佳熔解温度 （Tm） 和 Bst 3.0 浓度。温度梯度用于确定扩增的最佳Tm （图4A）。对于该协议中使用的一组引物，最佳Tm 为66.3°C（图4A）。此外，还评估了不同浓度的 Bst 3.0酶，其中3.2 lU/μL是该反应的最.......

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讨论

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尽管RT-LAMP被认为是执行分子诊断的补充方法，但它也有一些局限性和关键步骤，在标准化和实施协议时必须考虑这些限制和关键步骤。

用于检测 SARS-CoV-2 的 LAMP 标准化评估了预混液中的以下参数和成分:（a） 引物的浓度和比对温度;（b） 酶的浓度;（c） 镁浓度;（d） 反应时间;（e） 含有BSA、DMSO、氯化胍等添加剂;（f） 引物的设计;（g） 添加着色剂;（h） 使用内部生产的反应缓冲液和重组酶。

该标准化过程始于六套引物，其中两套由Zhang等人报告14 ，四套由BioDx公司设计。后者是使用可用的在线工具从头开始设计的，并因其对 SARS-CoV-2 的高特异性而被选中，由 BLAST 确定。此外，他们的热力学评估显示，形成引物二聚体或发夹结构的倾向较低，有利于自扩增。

由于引物对技术标准化的影响以及先前在NTC中发现扩增的实验结果，因此针对N、S、RdRp和RdRp/Hel基因进行了新的引物设.......

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披露

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纳塔利娅·坎皮略-佩德罗萨（Natalia Campillo-Pedroza）是BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S.公司的首席执行官。其余作者声明没有利益冲突。

致谢

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这项工作由哥伦比亚的Sistema General de Regalías资助，资助号为BPIN 2020000100092，Universidad Icesi - Convocatoria Interna，资助号为CA0413119。MFVT还得到了安第斯大学的助理教授基金的资助。资助实体没有参与手稿的设计、活动执行、数据收集、数据分析和准备。我们感谢 Valle del Lili 大学医院提供来自 SARS -CoV-2 样本的病毒 RNA，并感谢 Alvaro Barrera-Ocampo 博士对手稿的评论。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 kb DNA 分子量标准SOLIS BIODYNE07-12-00050储存在 -20 度;C
50x TAE 电泳缓冲液ThermoScientificB49在室温下储存
Accuris 高保真聚合酶ACCURIS 生命科学试剂PR1000-HF-200无法购买 Q5 高保真 DNA 聚合酶的情况下可以使用。对于酶，制作适当体积的等分试样并储存在 -20 °C 直到使用。
琼脂糖PanReacAppliChemA8963,0100N/A
Bst 3.0 DNA 聚合酶 8000 IU/mLNew England BioLabsM0374S/M0374L对于酶，制作适当体积的等分试样并储存在 -20 °C;C 直到使用。
脱氧核苷酸 （dNTP） 溶液套装New England BioLabsN0446S商店在 -20 °C
焦碳酸二乙酯Sigma-Aldrich159220-25G 在提取柜下小心处理
GeneRuler 100 bp Plus DNA 分子量标准，即用ThermoScientificSM0322储存温度为 -20 °C;C
羟基萘酚蓝二钠盐Santa Cruz Biotechnologysc-215156BN/A
Q5 高保真 DNA 聚合酶 2000 IU/mL New England BioLabsM0491S/M0491L对于酶，制作适当体积的等分试样并储存在 -20 °C;C 直到使用。
WarmStart RTx 逆转录酶 15000 IU/mLNew England BioLabsM0380S/M0380L对于酶，制作适当体积的等分试样并储存在 -20 °C;C 直到使用。
在型

参考文献

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  1. World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
  2. Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13

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标签

SARS CoV 2 RT LAMP

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