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方法文章

通过逆转录-环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2病毒

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DOI：

10.3791/65662

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2023年9月8日

 ,  ,  , 
1Facultad de Ingeniería, Diseño y Ciencias Aplicadas, Universidad Icesi, 2Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC), Department of Biological Sciences, Universidad de los Andes, 3BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S, Universidad Icesi

本文内容

摘要

本文提供了一套完整的实验方案，用于标准化和实施通过逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术检测人源样本中SARS-CoV-2病毒的方法。该方法可在60分钟内完成，成本低廉，仅需使用价格较低的设备，可适用于任何实验室或基层检测场所。

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）对人类健康造成了巨大影响。由于许多感染者因此死亡，该病毒至今仍是现代社会的重大威胁。目前主要通过血清学和分子检测方法（如作为金标准的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR））来诊断该疾病。然而，该方法存在若干缺点，例如需要专门的基础设施、昂贵的设备以及经过培训的专业人员。本文介绍了一种利用逆转录-环介导等温扩增技术（RT-LAMP）在人源样本中检测SARS-CoV-2病毒的实验方案。该方案包括引物的in silico设计、试剂配制、扩增反应及结果可视化等步骤。该方法一旦标准化，可在60分钟内以低成本和廉价设备在各类实验室或即时检测场所轻松实施和调整。此外，该方法可适用于多种病原体的检测，因此有望在野外现场和医疗中心用于开展及时的流行病学监测。

引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）可引起2019冠状病毒病（COVID-19）。世界卫生组织于2020年1月30日宣布新冠肺炎构成国际关注的突发公共卫生事件，并于2020年3月11日宣布其为大流行。截至本文撰写时，此次大流行已导致全球超过7.6亿例病例和687万例死亡1。

该病毒的影响凸显了对更优质、更准确、更快速且更广泛可用的监测工具的需求，以改进传染病的检测与控制2,3。在大流行期间，SARS-CoV-2 的诊断检测主要基于核酸、抗体和蛋白质的检测，其中核酸的 RT-PCR 检测是金标准4。然而，RT-PCR 存在一些局限性：它需要专业的设备、基础设施以及经过分子生物学培训的专业人员，因而仅限于在专业实验室中应用。此外，该方法耗时较长（4–6 小时），尚不包括将样本运送至实验室所需的时间，而运输过程可能持续数天5。这些限制阻碍了样本的高效处理，也难以及时获得应急规划和流行病学管理所需的信息。

逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）相较于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）具有多项优势，使其成为未来即时检测（POCT）设计中颇具吸引力的策略，尤其适用于资源有限的环境6。首先，该方法特异性极高，因其使用4至6种引物，可识别靶序列（无论是DNA还是RNA）中的6到8个区域7,8。其次，由于反应在恒定温度下进行，无需依赖实时荧光定量PCR仪等复杂设备进行扩增，也无需由高度专业化的人员操作。第三，反应时间短（约60分钟），且所用试剂无需高度特化，因而具有较高的成本效益6。鉴于上述优点以及由COVID-19大流行引发的公共卫生紧急状况，该技术可被视为一种快速、经济且易于在任何科研实验室实施的替代性诊断方法9。

本文描述了使用热循环仪和水浴锅通过比色法标准化和实施RT-LAMP检测SARS-CoV-2的实验方案（图1）。同时讨论了该方法的关键环节、局限性以及改进的替代方案。

新型冠状病毒RT-qPCR工作流程：预混液配制、热循环、电泳结果分析。
图1：采用RT-LAMP技术扩增严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的实验方案示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

所用样本由瓦莱德尔利利基金会大学医院临床实验室提供，对应于采用RT-qPCR技术检测结果为COVID-19阳性的患者所提取的纯化RNA。所有患者均签署了知情同意书，同意用于科研，且本研究已获得瓦莱德尔利利基金会大学医院人体研究生物伦理委员会批准。

1. RT-LAMP 引物设计与准备

注意：LAMP 引物可用于多种平台，包括 New England BioLabs (NEB) LAMP、Primer Explorer 和 LAMP assay versatile analysis (LAVA)。然而，在本方案中使用的是 NEB LAMP 工具。引物设计可利用从 NextStrain 数据库获取的 SARS-CoV-2 基因组进行10。表 1 显示了本方案中使用的引物组合。

  1. LAMP 引物设计
    1. 获取病毒基因组序列。
    2. 进行序列比对以获得共识序列。
    3. 访问 NEB LAMP 引物设计工具平台11 ，并按照快速指南中的说明操作。该工具产生的结果与 Primer Explorer V5 相同，但其输出界面更加用户友好。可参考 Primer Explorer 用户手册进行引物设计。
  2. 引物组的热力学评估
    1. 使用 Primer-Dimer 工具12对获得的引物进行热力学分析。
    2. 将引物序列输入该工具，然后选择 多重分析和二聚体结构报告（Multiplex Analysis and Dimer Structure Report） 选项。
    3. 选择 ΔG 值不低于 -5 的引物组。
  3. 设计引物的特异性评估
    1. 使用 BLAST 中的核苷酸数据库（nt/nt）13对每条引物进行分析。
    2. 进行第一次 BLAST 分析时，选择 Refseq_rna 数据库，并以 Orthocoronavirinae 亚科所属的属进行搜索过滤，包括 Alphacoronavirus（taxid:693996）、Gammacoronavirus（taxid:694013）和 Deltacoronavirus（taxid:1159901）。此外，还需将序列与其他共循环病毒进行比对，如 H1N1 亚型（taxid:114727）、甲型流感病毒（Influenza A virus，taxid:11320）和乙型流感病毒（Influenza B virus，taxid:11520）。
    3. 进行第二次 BLAST 分析时，选择 Betacoronavirus GenBank 数据库，并以 Coronaviridae（taxid:11118）和 SARS（taxid:694009）进行搜索过滤。这些类群包含所有已鉴定的 SARS 冠状病毒基因组序列，包括在蝙蝠中发现的序列，即 Betacoronavirus（taxid:694002）。
    4. 对于本实验方案，需确保引物仅与目标基因组 SARS-CoV-2 匹配，而不与其他基因组发生比对。
  4. 引物准备
    1. 将含有冻干引物的管子在微量离心机中离心（10,000 × g，室温 [RT] 下 1 分钟），以避免打开管盖时样品损失。
    2. 用 0.1% 二乙基焦碳酸酯（DEPC）水或无核酸酶水将冻干 粉末重悬至终浓度为 100 µM（表 2），并通过反复吹打充分溶解。随后，在微量离心机中以最大速度（10,000 × g，室温下 1 分钟）离心，使所有引物溶液沉降至管底。
    3. 在生物安全柜内配制 10× 引物混合液，包含正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、环反向引物（LB）和环正向引物（LF），具体浓度见 表 2。为防止损失，在移液前应轻轻涡旋或吹打混匀引物溶液，然后进行短暂离心（10,000 × g，室温下 1 分钟）。
    4. 将 10× 引物混合液于 −20 °C 长期保存；但建议每次配制量不超过五次实验所需，无论样本数量多少，以避免反复冻融。
      注意：若需要较小体积的引物混合液，可通过计算调整各组分体积（表 2）。此外，RdRp 和 RdRp/Hel 引物组不包含 LF 引物，因为 RT-LAMP 反应无需环引物，因此应以无核酸酶水或 0.1% DEPC 水补足 LF 引物所占体积。

2. RT-LAMP 反应

  1. 根据制造商的说明打开层流柜，并等待至少3分钟，使气流稳定。
  2. 待气流稳定后，采用无菌技术清洁并消毒操作柜内部表面。具体操作时，按以下顺序使用下列消毒剂：1000 ppm 季铵盐（苯扎氯铵）、2% 次氯酸盐、3% 过氧化氢和 70% 乙醇。
    注意：在此情况下，无菌操作技术包括从舱内向外使用消毒剂，并用纸巾擦拭，且不可重复擦拭已清洁的表面。
  3. 使用步骤2.2中的消毒剂，按照相同顺序对将要进入舱内的物品进行清洁。
    注意：必须将微量移液器、滤芯吸头盒、装有1.5 mL和0.6 mL离心管的烧瓶、0.2 mL PCR管、试管架和400 mL烧杯带入超净工作台。
  4. 将一些纸巾和腈手套带入舱内。随后，关闭柜子并用紫外线（UV）照射15分钟。
    注意：为避免长时间辐射暴露导致组织和DNA损伤，在步骤2.4设定的时间结束前，应避免接触紫外光。
    注意：执行如图所示的组装步骤 图2 在开始实验方案之前准备好水浴，并在完成步骤2.4后启动水浴。必须用饮用水将金属容器几乎加满，并将金属实验室加热板的温度设定为90 °C，这样系统内的温度将达到约66.3 °C，并使用汞温度计进行监测。
  5. 辐照期结束后，重新启动柜子，并按照步骤1.1中的建议操作。
  6. 将试剂（表3，表4，以及 表5将装有样本的容器置于装有冰块的冷藏箱或小型聚苯乙烯冰箱中。用70%乙醇清洁容器表面后，放入生物安全柜内。
  7. 在0.6 mL微量离心管中，配制待扩增基因（RdRp、N-A和RdRp/Hel）的LAMP反应混合液，仅加入以下组分：10x Buffer、MgSO₄4，dNTPs、1x 引物混合物和无核酸酶水或0.1% DEPC水；用移液器吹打混匀。
    警告：由于在生物安全柜内操作不当或行为不规范，试剂污染风险较高。为降低此问题，必须遵守以下规则：（i）使用无菌带滤芯吸头；（ii）每种试剂使用单独的吸头；（iii）动作应缓慢轻柔，避免干扰层流气流；（iv）保持操作区域整洁，尽量减少所用物品数量；（v）配制反应体系和添加遗传物质时应更换不同的手套。
    注意：所有试剂，尤其是酶，均需置于冰上，因为温度变化可能导致其变性并改变聚合酶活性。
  8. 将装有样品的0.6 mL离心管（管盖闭合）放入加热块中，于95 °C孵育5分钟。
    注意：在开始配制LAMP反应混合物之前，至少提前30分钟打开生物安全柜外用于1.5–2.0 mL离心管的加热模块，并使用水银或酒精温度计监测其温度（95 °C）。
  9. 孵育完成后，将试管放入装有冰块的聚苯乙烯保温箱中，冰浴5分钟。
  10. 将试管放回超净工作台，并通过加入DNA聚合酶完成LAMP反应体系的配制（Bst 3.0）、逆转录酶和高保真DNA聚合酶（表3，表4，以及 表5若采用比色检测，加入染料羟基萘酚蓝（HNB）。
  11. 加入这些试剂后，通过移液充分混匀LAMP试剂，以溶解酶和染料。
  12. 向每支 PCR 管中加入 22.0 µL 混合液，注意避免产生气泡。然后，向阴性对照或无模板对照（NTC）管中加入 3.0 µL 0.1% DEPC 水或无核酸酶水，并将剩余的管子留出，用于添加待测遗传物质。
    注意：在加入样本前，将 PCR 管置于装有冰块的冷藏容器中，以避免激活反应 Bst 3.0 酶并提前启动反应。
  13. 将柜内所有物品取出，并使用70%乙醇清洁表面，然后按照制造商的说明关闭设备。
  14. 在另一个区域，向每根 PCR 管中加入 3 µL 样品，并充分混匀。使用 20 µL 微量移液器和滤芯吸头完成此操作。
    注意：用于添加遗传物质的微量移液器必须专用于此目的，不得用于配制混合液，以避免试剂污染。此外，RNA样品应始终置于冰上，以降低RNA降解的可能性。样品添加过程中需佩戴以下个人防护装备（PPE）：一次性实验服、头帽、N95口罩、护腿、护目镜和丁腈手套。
  15. 在进行比色反应之前，使用高分辨率相机拍摄PCR管的照片。HNB的初始颜色为紫色。
  16. 在以下系统或设备中进行反应：(i) 梯度PCR仪 和 (ii) 水浴锅。
    1. 热循环仪：将试管放入反应模块中，并设置热循环程序（参见 表6) 在设备上。
    2. 水浴：将试管放入圆形容器中，并妥善固定以防止脱落。随后，将容器置于水浴中（图2A，B所列温度下 表6.
  17. 对于水浴，当试管放入系统后，启动计时器，计时60 min表6).
  18. 反应结束后，将离心管从热循环仪或水浴中取出，4 °C保存以备电泳使用，或 −20 °C长期保存至后续使用。
  19. 如果进行了比色反应，应使用高质量相机拍摄PCR管的照片。HNB的最终颜色为天蓝色。

3. 琼脂糖凝胶中扩增产物的分析

注意：这些步骤建议作为比色反应的额外检查，或在标准化步骤中用于控制性能。这是因为该技术可能给进行这些检测的实验室带来极大的污染风险。

  1. 将制胶板放入电泳槽中，使边缘的橡胶条紧贴槽壁，形成一个用于添加琼脂糖的密闭空间（内槽）（图3A，B）。
  2. 完成步骤3.1后，在500 mL烧杯中称取所需量的琼脂糖以制备2%的凝胶。随后加入适量0.5×Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，并用微波炉加热1-2分钟。
    注意：当琼脂糖溶液呈透明且无结块时，表明已完全融化。若未达到此状态，可能会残留凝胶不良区域，从而影响电泳过程及扩增产物的观察。
  3. 将烧杯从微波炉中取出，将熔化的琼脂糖倒入步骤3.1中形成的内槽中（图3C）。随后检查是否存在气泡，如有气泡，使用移液器吸头将其去除。
  4. 插入梳子以形成加样孔，并在室温（RT）下静置约30分钟，使琼脂糖完全凝固。
  5. 此步骤完成后，向槽中加入5 mL 0.5×TAE缓冲液，以便取出梳子及含有凝胶的制胶板。然后将凝胶放置于电泳槽中，确保加样孔位于阳极一侧（图3D）。
  6. 向电泳槽中加入0.5×TAE缓冲液至制造商规定的容量，确保电极与缓冲液充分接触。
  7. 在凝胶的第一个加样孔中加入3 µL的分子量标记物，随后在接下来的各孔中分别加入9 µL的NTC和每个样品。样品需由7 µL扩增产物与3 µL上样缓冲液混合而成；取9 µL该混合液加入凝胶的加样孔中。
  8. 盖上电泳槽盖，将导线按颜色对应连接至电源接口。设置电源参数为：100 V恒压，电泳120分钟。
  9. 电泳结束后，将凝胶转移至含有染色液（溴化乙锭）的容器中，孵育30分钟。
  10. 染色完成后，将凝胶从染色液中取出，并放入密封袋中。此举可防止后续用于扩增产物观察的设备受到污染。
  11. 使用凝胶成像系统（如Amersham Imager 600）或透射式紫外成像仪观察凝胶结果。

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结果

实施该方案首先需要针对每个目标基因设计引物组，具体步骤遵循上述方案。2020年6月，从NextStrain数据库中获取了5,000条SARS-CoV-2基因组序列，其中包含10%代表性的哥伦比亚基因组序列。这些序列经过比对，以获得用于引物设计的共识序列。表1列出了为RdRp/Hel和RdRp引物选择的引物组。用于基因N扩增的引物组则来自先前发表的研究报告14。

标准化该实验方案的第一步是避免无模板对照（NTC）扩增。在此方面必须验证的最重要参数之一是确定引物组合的最佳熔解温度（Tm）和Bst 3.0 酶的浓度。采用温度梯度实验确定最佳扩增Tm（图4A）。对于本方案所用的引物组合，最佳Tm为66.3 °C（图4A）。此外，评估了不同浓度的Bst 3.0 酶，结果表明3.2 lU/µL为...

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讨论

尽管RT-LAMP被视为执行分子诊断的一种补充方法，但在标准化和实施该方案时，仍需考虑其某些局限性和关键步骤。

针对SARS-CoV-2检测的LAMP标准化评估了主混合液中的以下参数和组分：（a）引物的浓度及退火温度；（b）酶的浓度；（c）镁离子浓度；（d）反应时间；（e）添加物的使用，如BSA、DMSO、氯化胍；（f）引物的设计；（g）显色剂的添加；（h）使用实验室自制的反应缓冲液和重组酶。

该标准化过程始于六组引物，其中两组由 Zhang 等人报道14，另外四组由 BioDx 公司设计。后者利用现有的在线工具从头设计，并因其对 SARS-CoV-2 具有高特异性（经 BLAST 确定）而被选用。此外，其热力学评估显示，这些引物形成引物二聚体或发夹结构的倾向较低，有利于避免自我扩增。

由于引物对技术标准化以及前期实验中在阴性对照（NTC）中出现扩增结果的影响，本研究针对N、S、RdRp和RdRp/Hel基因重新设计了新的引...

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披露

Natalia Campillo-Pedroza 是公司 BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. 的首席执行官。其余作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由哥伦比亚通用特许权系统资助，项目编号 BPIN 2020000100092，以及由伊塞西大学内部资助项目（编号 CA0413119）资助。MFVT 还获得了安第斯大学助理教授基金的资助。资助机构未参与研究设计、活动实施、数据收集、数据分析及论文撰写。我们感谢瓦莱·德·利利基金会大学医院提供 SARS-CoV-2 样本的病毒 RNA，感谢 Alvaro Barrera-Ocampo 博士对论文提出的修改意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 kb DNA LadderSOLIS BIODYNE07-12-00050储存于 -20 °C
50x TAE 电泳缓冲液ThermoScientificB49室温储存
Accuris 高保真聚合酶ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTSPR1000-HF-200当无法购买 Q5 高保真 DNA 聚合酶时可使用此酶。取适当体积分装后，储存于 -20 °C，直至使用。
琼脂糖PanReacAppliChemA8963,0100不适用
Bst 3.0 DNA 聚合酶 8000 IU/mLNew England BioLabsM0374S/M0374L取适当体积分装后，储存于 -20 °C，直至使用。
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液套装New England BioLabsN0446S储存于 -20 °C
焦碳酸二乙酯Sigma-Aldrich159220-25G 应在通风橱内小心操作
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder（即用型）ThermoScientificSM0322储存于 -20 °C
羟基萘酚蓝二钠盐Santa Cruz Biotechnologysc-215156B不适用
Q5 高保真 DNA 聚合酶 2000 IU/mL New England BioLabsM0491S/M0491L取适当体积分装后，储存于 -20 °C，直至使用。
WarmStart RTx 逆转录酶 15000 IU/mLNew England BioLabsM0380S/M0380L取适当体积分装后，储存于 -20 °C，直至使用。

参考文献

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