使用高分辨率呼吸测量法分析 果蝇黑腹 果蝇 PINK1B9-Null 突变体的线粒体功能

摘要

在这里，我们提出了一种高分辨率呼吸测量方案，用于分析 PINK1^B9-null 突变果蝇的生物能量学。该方法使用底物-解偶联剂-抑制剂滴定 （SUIT） 方案。

摘要

神经退行性疾病，包括帕金森病 （PD），和细胞紊乱，如癌症，是一些破坏能量代谢并损害线粒体功能的疾病。线粒体是控制能量代谢和细胞存活和死亡的细胞过程的细胞器。出于这个原因，评估线粒体功能的方法可以为病理和生理过程中的细胞状况提供重要的见解。在这方面，高分辨率呼吸测量 （HRR） 方案允许评估整个线粒体呼吸链功能或特定线粒体复合物的活性。此外，研究线粒体生理学和生物能量学需要遗传和实验上可处理的模型，例如 果蝇黑腹果蝇。

该模型具有多种优点，例如与人体生理学的相似性、生命周期快、易于维护、成本效益高、高通量能力以及将伦理问题降至最低。这些属性共同确立了它作为解剖复杂细胞过程的宝贵工具。本工作解释了如何使用 果蝇黑腹 果蝇 PINK1^B9-null 突变体分析线粒体功能。 pink1 基因负责编码 PTEN 诱导的推定激酶 1，通过一个被认为是线粒体自噬的过程，这对于从线粒体网络中去除功能失调的线粒体至关重要。该基因的突变与常染色体隐性遗传性早发性家族性 PD 有关。该模型可用于研究与帕金森病病理生理学有关的线粒体功能障碍。

引言

线粒体是控制重要功能的细胞器，包括细胞凋亡调节、钙稳态和参与生物合成途径。通过拥有自主的遗传物质，它们能够为细胞维持和修复过程做出贡献。它们的结构包含电子传递链和氧化磷酸化，这两者都对细胞能量至关重要 ^1,2,3。特别是，能量控制是通过氧化磷酸化 （OXPHOS） 产生三磷酸腺苷 （ATP） ^来实现的2。能量代谢紊乱伴线粒体功能受损发生在细胞存活和死亡中 ^4,5，通常与多种人类病理学（如癌症）和神经退行性疾病（如帕金森病 （PD）^3,6）有关。

帕金森病是一种慢性、进行性和神经系统疾病。这种疾病的主要原因是脑细胞的死亡，特别是在黑质中，黑质负责产生控制运动的神经递质多巴胺 ^6,7,8。最早将帕金森综合征与线粒体功能障碍联系起来的观察是在 1988 年，在使用抑制呼吸链复合物 I⁹ 的毒素的实验模型中。

目前，有几种方法可以评估线粒体功能障碍 10,11,12,1 3;然而，与传统方法相比，高分辨率呼吸测量法 （HRR） 具有卓越的灵敏度和优势^13,14。例如，HRR方案允许评估整个线粒体呼吸链功能或特定线粒体复合物的活性^14,15。线粒体功能障碍可以在完整细胞、分离的线粒体甚至体外^{10、11、13、14} 中进行评估。

线粒体功能障碍与许多病理和生理过程密切相关。因此，使用遗传和实验上可处理的模型系统研究线粒体生理学和生物能量学非常重要。在这方面，对果蝇果蝇（Drosophila melanogaster）的研究有几个优点。该模型与人类共享基本的细胞特征和过程，包括使用 DNA 作为遗传物质、共同细胞器以及参与发育、免疫和细胞信号传导的保守分子通路。此外，果蝇具有生命周期快、易于维护、成本低、通量高、伦理问题少等特点，是解剖复杂细胞过程的宝贵工具16,17,18,19,20。

此外，PTEN诱导的推定激酶1（pink1）基因的同源物在黑腹果蝇中表达。它通过线粒体自噬过程在去除受损线粒体方面起着至关重要的作用⁸.在人类中，该基因的突变使个体易患与线粒体功能障碍相关的常染色体隐性遗传家族性 PD 8,21,22,23。因此，果蝇是一种强大的动物模型，用于研究帕金森病的病理生理学和筛选以线粒体功能障碍和生物能量学为重点的候选药物。因此，本工作解释了如何使用 HRR 技术在 OROBOROS 中使用底物-解偶联剂-抑制剂-滴定 （SUIT） 方案分析黑腹果蝇 PD 模型中的线粒体功能。

方案

我们使用了来自布卢明顿果蝇种群中心（ID号:34749）的菌株w¹¹¹⁸（白色）和w[*] Pink1[B9]/FM7i，P{w[+mC]=ActGFP}JMR3（称为Pink1^B9）（FlyBase ID:FBgn0029891）。在这项研究中，将雄性黑腹果蝇PINK1^B9-null突变体与来自w¹¹¹⁸菌株的雄性黑腹果蝇进行比较，后者用作对照组（遗传背景）。其他参数必须与呼吸测量实验同时进行分析，以确保果蝇具有正确的基因型（Pink1^B9/Y），例如胸部畸形和运动问题，这些在pink1^B9突变果蝇^24,25,26中得到了很好的描述。

1. 动物和住房

1. 将苍蝇保存在含有10mL标准饮食（酵母1.73%，大豆粉0.9%，玉米粉7.3%，琼脂0.5%，玉米糖浆7.6%和丙酸0.48%）的玻璃瓶中，温度和湿度恒定（分别为25°C和60%），光/暗循环为12小时:12小时。
2. 对于每个实验，使用两只苍蝇在闭合后1-3天。
   注: 将 PINK1^B9-null 突变的处女雌性苍蝇与 w¹¹¹⁸ 雄性杂交，以获得基因型为 Pink1^B9/Y 的 F1 雄性。

2. 样品制备

1. 如 表1所述准备MiR05缓冲液。
2. 麻醉冰上的苍蝇并将它们转移到微量离心管（每管两只苍蝇）。
3. 在每个试管中，加入 200 μL 冷冻的 MiR05 缓冲液并使果蝇匀浆。手动匀浆，施加温和的压力（大约4-6次杵的冲程）以防止线粒体的崩解。

3. 极谱法氧传感器的高分辨率呼吸测量校准

注:OROBOROS 腔室的总体积约为 2 mL。需要校准以确保氧通量接近 0 pmol 才能开始测定。

1. 开始校准，向腔室中加入 2 mL MiR05。用塞子盖住腔室，不要留下气泡;然后，小心地拉动塞子以形成一个气泡。
2. 打开 OROBOROS Dat.Lab 软件。在模块温度字段中输入25°C的温度，然后单击连接到Oxygraph-2k（图1A）。
3. 单击并选择要保存校准的文件夹，然后单击 "保存"。
4. 当打开一个新窗口时，命名实验和样品（如果校准，只需输入名称 校准），然后单击 保存。
5. 转到 "布局" 菜单，然后选择第一个选项: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp ，如 图 1B 所示。
6. 等待程序重定向到校准布局，等到红线显示标准直线，点在 0 pmol 左右。然后，当红线正好为零时，选择两个 点:一个用于 腔室A ，另一个用于 腔室B （图1C）。
   注意:所选点的氧通量（红线）必须在 0 左右。
   1. 要标记两个腔室的点，请选择屏幕右侧的 O₂ 浓度 ，选择标记点，然后复制相对于该点的 温度 和 气压 值。将这些值粘贴到下面的框中，然后单击屏幕右下角的 Calibrate and Copy to Clipboard ，如 图 2 所示。
   2. 对两个 腔室 （A 和 B）执行此过程，然后转到 "文件 "菜单并选择 "保存并断开连接"。
      注意: 校准过程完成后，程序会将用户重定向到主屏幕，以便软件准备好开始 HRR 测试。对于此测试，我们将使用 SUIT 协议。

4. SUIT协议

1. 校准完成后，取下塞子并打开腔室。
2. 按此顺序用 100% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水清洗塞子（握住不接触样品的尖端）和腔室。
   注意:对每个样品更换重复该过程。
3. 在200μL缓冲液中匀浆苍蝇，使用微量移液器将所有样品内容物置于腔室中，并将塞子重新定位在腔室中，注意不要产生气泡。
   注意:如果形成气泡，轻轻取下塞子并加入 100 μL MIR05 缓冲液。
4. 单击 "布局" 菜单，然后选择" 05 Flow by Corrected Volume "选项，如 图 1B 所示。
5. 等待重定向到新窗口。单击 "保存 "以选择要保存实验的文件夹。
6. 等待另一个新窗口打开。将空间中的实验命名为 Experimental Code。然后，在"样品"字段中将每个样品命名为各自腔室中的 A 和 B，并将字段"单位"设置为"单位"。
   注意:也可以选择其他单位，例如， 百万个细胞 或 毫克。
7. 考虑到该协议使用两只苍蝇（2个单位）并且腔室容积为2mL，在 浓度 字段中，定义 每mL1 个（图1D）。
   注意:在这里，样本量按苍蝇数量归一化;然而，这种归一化可以通过样品的蛋白质含量、线粒体 DNA 定量或柠檬酸合酶的活性来执行。
8. 当氧通量信号（红线）稳定在正值上时，通过底物、抑制剂和解偶联剂的滴定开始 HRR 方案（图 3）。所有后续试剂和设备均见 表1。
   1. 加入洋地黄皂苷 （5 μg/mL） 以透化线粒体膜。
   2. 加入丙酮酸（5mM），苹果酸（2mM）和脯氨酸（10mM）底物，等待氧通量增加并稳定。要标记每次添加试剂的事件，请按键盘上的 F4 键并输入每个试剂 的名称 。
   3. 加入ADP（5mM）耦合线粒体呼吸链，等待氧通量的增加和稳定。
   4. 加入琥珀酸盐（10mM）并等待氧通量的增加和稳定。
   5. 加入寡霉素（2.5μM）以抑制ATP合酶并寻找氧通量的降低。
   6. 等到红线稳定下来，并使用滴度为0.25μM的羰基-4-（三氟甲氧基）苯腙氰化物（FCCP）解耦线粒体电子转移，直到达到最大耗氧量，红线的上升证明了这一点。稳定氧通量后，开始添加每种复合物的抑制剂，一次一个。
   7. 加入鱼藤酮（0.5μM），一种复合物I抑制剂。等待氧通量的降低和稳定后再添加下一个抑制剂。
   8. 加入丙二酸酯（5mM），一种复合物II抑制剂。等待氧通量的降低和稳定后再添加下一个抑制剂。
   9. 最后，加入抗霉素（2.5μM），一种复合物III抑制剂。等待氧通量下降，然后增加和稳定氧通量。
      注意:氧通量应稳定在正值，但低于线粒体蛋白复合物最后一次抑制的值。
9. 在分析结束时，使用微量移液器除去腔室的所有内容物。必要时储存在-20°C以备将来分析。

5. 数据分析

1. 使用适当的统计软件包进行数据分析。
2. 执行 t 检验以评估两组之间的差异。对于涉及多种处理的情况，使用方差分析 （ANOVA） 作为统计检验 ²⁷。
3. 从软件生成的图形中提取 O₂ 通量值。OXPHOS CI 是指添加 ADP 后 O₂ 通量的值。OXPHOS CII 是通过减去 OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI 获得的。OXPHOS CI&CII是加入琥珀酸盐后提取的O₂ 助焊剂的值。ETS CI&CII是添加FCCP后的O₂ 通量值。ETS CI = FCCP - 鱼藤酮和 ETS CII = 鱼藤酮 - 丙二酸。
4. 将 ATP 合成计算为 OXPHOS （P） 和 LEAK （L） （P - L） 之间的差值²⁸。
5. 通过计算比率 OXPHOS/LEAK 来确定呼吸控制比 （RCR），其中 RCR = P/^L.11

结果

在这里，我们发现，与对照果蝇相比，PINK1 B9 无效果蝇在 PINK1^B9 无效果蝇中，OXPHOS CI （P = 0.0341） 和 OXPHOS CI&II （P = 0.0392） 状态下的 O₂ 通量降低（图 4）。这一结果在我们小组^29,30 的先前研究结果中也观察到。

CI 和 CII 是电子传输系统 （ETS） 的关键组成部分，其中 CI 负责将电子从 NADH 转移到泛醌，而 CII 将电子从琥珀酸转移到泛醌 31,32,33。PINK1^B9 无效果蝇在 ETS CI （P =...

讨论

HRR 是一种强大的技术，用于研究 黑腹果蝇 和其他生物体的线粒体呼吸和能量代谢。它提供了对线粒体功能的详细和定量评估，使研究人员能够深入了解细胞的生物能量学。此处介绍的方案描述了使用SUIT协议在 黑腹果蝇中评估线粒体呼吸链功能和特定线粒体复合物的活性。SUIT方案涉及系统地操纵各种底物、解偶联剂和抑制剂，以检查线粒体呼吸的不同方面。

所描述的技术允许评估由于对 OXPHOS 或 ETS 的影响、脱氢酶活性（CI 和 CII）和膜完整性（OXPHOS 的偶联）而产生的呼吸抑制。在这里，我们使用 PINK1^B9-null 果蝇进行实验来研究线粒体功能障碍，因为它与 PD^34,35 有关。然而，该方案可用于不同的疾病模型、药物治疗和毒理学研究。

此外，样品制备可以适应实验要求³⁶。呼吸测量方案的一个关键步骤是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	腺苷 5′-二磷酸钠 sal （CAS number 72696-48-1）; ≥95%;分子量 = 501.31 g/mol。
Ágar	Kasv	K25-1800	用于细菌学用途
抗霉素-A	Sigma-Aldrich	A8674	来自链霉菌属的抗霉素A（CAS号1397-94-0;分子量  540 g/mol;
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A7030	牛血清白蛋白（CAS 号 9048-46-8）;pH 7,0 ≥ 98%
Datlab 软件	Oroboros Instruments， Innsbruck， Austria	20700	用于数据采集和分析的软件
洋地黄皂苷	Sigma-Aldrich	D 5628	CAS 号 11024-24-1
蒸馏水
黑腹果蝇 菌株 w[*] Pink1[B9]/FM7i， P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			从布卢明顿果蝇库存中心
黑腹果蝇菌株中获得 w1118			从圣玛丽亚联邦大学获得
，EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（CAS号13638-13-3）（GE;97%;分子量 =468.28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920	羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）苯腙 （CAS 号 370-86-5）;≥98% （TLC）， 粉末
GraphPad Prism 版本 8.0.1。			用于数据采集和分析的软件
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸（CAS号7365-45-9）;≥99.5%（滴定），经过细胞培养测试;分子量 = 238.30 g/mol
高分辨率呼吸计 氧迹仪 O2K	Oroboros Instruments， Innsbruck， Austria	10022-02	启动 O2K 呼吸计套件
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	磷酸二钾（CAS号 7778-77-0）;Reagente Plus，分子重量 = 136.09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	氢氧化钾（CAS号 1310-58-3）;ACS 试剂，≥85%，苹果
酸	Sigma-Aldrich	M1296	丙二酸沉淀（CAS 号 141-82-2）;99%，分子量 = 104.06 g/mol）。将溶液的 pH 值调节至约 7.0。
苹果酸	Sigma-Aldrich	M1000	（S）-（−）-2-羟基琥珀酸（CAS号97-67-6）;≥95% ;分子量 = 134.09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	2-（N-吗啉代）乙磺酸（CAS号4432-31-9）;≥99%（滴定）;分子量 = 195.24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	氯化镁（CAS号 7786-30-3）;无水，≥98%，分子量 = 95.21 g/mol
微量离心管	Eppendorf
O2K-滴定套件	Oroboros Instruments，因斯布鲁克，奥地利	20820-03	不同体积的 Hamilton 注射器
寡霉素	Sigma-Aldrich	O 4876	寡霉素来自 Streptomyces diastatochromogenes （CAS号  1404-19-9）;≥90% 总寡霉素基础 （HPLC）
雌蕊到均质化
脯氨酸	Sigma-Aldrich	P0380	L-脯氨酸（CAS 号 147-85-3）;粉末;99%;分子量 = 115.13 g/mol
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256	丙酮酸钠（CAS 号 113-24-6），≥99%;分子量 = 110.04 g/mol
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	鱼藤酮（CAS号 83-79-4）;≥95%，分子量 394.42 g/mol
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S 2378	琥珀酸钠 二氢钠 六水合物（CAS号 6106-21-4）;≥99%
蔗糖	Merck	107,651,000	用于微生物学的蔗糖（CAS 号 57-50-1）
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625	CAS 号 107-35-7