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方法文章

使用高分辨率呼吸测定法分析 Drosophila melanogaster PINK1B9 缺失突变体中的线粒体功能

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DOI：

10.3791/65664

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2023年11月10日

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种高分辨率呼吸测定方案，用于分析PINK1B9基因缺失突变果蝇中的生物能量学。该方法采用底物-解偶联剂-抑制剂-滴定（SUIT）方案。

摘要

神经退行性疾病（如帕金森病，PD）以及癌症等细胞紊乱均会破坏能量代谢，并导致线粒体功能受损。线粒体是调控能量代谢以及细胞存活与死亡相关细胞过程的细胞器。因此，评估线粒体功能的方法可为病理和生理过程中细胞状态提供重要见解。在此方面，高分辨率呼吸测定法（HRR）方案可用于评估整个线粒体呼吸链功能或特定线粒体复合物的活性。此外，研究线粒体生理学和生物能量学需要具有遗传和实验可操作性的模型，如果蝇（Drosophila melanogaster）。

该模型具有多项优势，例如与人类生理的高度相似性、生命周期短、易于维护、成本效益高、通量高，以及伦理问题较少。这些特性共同使其成为解析复杂细胞过程的宝贵工具。本研究介绍了如何利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）PINK1B9基因缺失突变体来分析线粒体功能。pink1基因负责编码PTEN诱导的假定激酶1，该过程被称为线粒体自噬，对清除线粒体网络中功能异常的线粒体至关重要。该基因的突变已被证实与一种常染色体隐性遗传的早发性家族型帕金森病（PD）相关。该模型可用于研究帕金森病发病机制中涉及的线粒体功能障碍。

引言

线粒体是细胞器，调控多种重要功能，包括凋亡调控、钙稳态以及生物合成通路的参与。由于具有自主遗传物质，线粒体能够参与细胞的维持和修复过程。其结构中含有电子传递链和氧化磷酸化系统，二者对细胞能量生成至关重要1,2,3。特别是通过氧化磷酸化（OXPHOS）生成三磷酸腺苷（ATP），实现细胞能量调控2。能量代谢紊乱及线粒体功能受损在细胞存活与死亡过程中均会发生4,5，常与多种人类疾病相关，如癌症以及帕金森病（PD）等神经退行性疾病3,6。

帕金森病（PD）是一种慢性、进行性神经系统疾病。该病的主要病因是脑细胞死亡，尤其是黑质中负责产生神经递质多巴胺的细胞，而多巴胺对运动控制至关重要6,7,8。1988年，在使用抑制呼吸链复合物I毒素的实验模型中，首次观察到帕金森综合征与线粒体功能障碍之间的关联9。

目前，已有多种方法可用于评估线粒体功能障碍10,11,12,13；然而，与传统方法相比，高分辨率呼吸测定法（HRR）具有更高的灵敏度和诸多优势13,14。例如，HRR 实验方案可用来评估整个线粒体呼吸链的功能或特定线粒体复合物的活性14,15。线粒体功能障碍可在完整细胞、分离的线粒体中，甚至在离体（ex vivo）条件下进行评估10,11,13,14。

线粒体功能障碍与多种病理和生理过程密切相关。因此，利用在遗传学和实验上易于操作的模式系统来研究线粒体生理学和生物能量学具有重要意义。在这一领域，对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的研究具有多项优势。该模式生物与人类具有基本的细胞特征和过程，包括以DNA作为遗传物质、共有相似的细胞器，以及在发育、免疫和细胞信号传导中保守的分子通路。此外，果蝇具有生命周期短、易于培养、成本低、通量高且伦理问题较少等优点，因而成为解析复杂细胞过程的宝贵工具16,17,18,19,20。

此外，pink1（PTEN诱导的假定激酶1）基因的同源基因在D. melanogaster中表达，其在通过线粒体自噬（mitophagy）清除受损线粒体的过程中发挥关键作用8。在人类中，该基因的突变可导致一种与线粒体功能障碍相关的常染色体隐性遗传性帕金森病（PD）8,21,22,23。因此，果蝇是研究帕金森病发病机制以及筛选针对线粒体功能障碍和生物能量学的候选药物的有力动物模型。本研究旨在介绍如何利用OROBOROS系统中的高分辨率呼吸测定法（HRR），结合底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案，分析D. melanogaster帕金森病模型中的线粒体功能。

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方案

我们使用了来自布卢明顿果蝇品系保藏中心（Bloomington Drosophila stock center，编号：34749）的品系w1118（白眼）和 w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3（简称为 Pink1B9，FlyBase 编号：FBgn0029891）。本研究中，将雄性D. melanogaster PINK1B9基因缺失突变体与作为对照组（遗传背景）的w1118 品系雄性D. melanogaster进行比较。为了确认果蝇具有正确的基因型（Pink1B9/Y），还需在呼吸测定实验的同时分析其他参数，例如胸节畸形和运动障碍，这些表型在pink1B9突变体果蝇中已有充分描述24,25,26。

1. 动物与饲养

  1. 将果蝇饲养在含有10 mL标准培养基（酵母1.73%、豆粉0.9%、玉米粉7.3%、琼脂0.5%、玉米糖浆7.6%、丙酸0.48%）的玻璃瓶中，置于恒定温湿度条件（25 °C和60%）下，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。
  2. 每次实验使用2只羽化后1-3天的果蝇。
    ​注意： PINK1B9-null 突变纯合子处女雌蝇与 w1118 雄性以获得基因型为 Pink1 的 F1 代雄性B9/Y.

2. 样品制备

  1. 按照表1所述配制MiR05缓冲液。
  2. 将果蝇在冰上麻醉后转移至微量离心管中（每管两只果蝇）。
  3. 在每个离心管中加入200 µL预冷的MiR05缓冲液并进行匀浆。手动匀浆时应施加轻柔压力（约4–6次研磨），以防止线粒体破裂。

3. 极谱氧传感器的高分辨率呼吸测量校准

注意：OROBOROS 反应室的总体积约为 2 mL。校准是必要的，以确保实验开始时氧通量接近 0 pmol。

  1. 开始校准，向检测腔中加入 2 mL MiR05。用密封塞盖住检测腔，确保无气泡；然后，小心地拔出密封塞，形成一个单一的气泡。
  2. 打开 OROBOROS Dat.Lab 软件。在Block temperature字段中输入温度25 °C，然后点击Connect to Oxygraph-2k（图 1A）。
  3. 点击并选择用于保存校准数据的文件夹，然后点击Save。
  4. 当新窗口打开时，为实验和样品命名（若为校准，可直接输入名称calibration），然后点击Save。
  5. 进入Layout 菜单，选择第一个选项：01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp ，如图 1B所示。
  6. 等待程序跳转至校准界面，直至红线显示为一条标准的直线，数值点接近 0 pmol。然后，在红线精确处于零值时，选择两个点：一个用于chamber A，另一个用于chamber B（图 1C）。
    注意：所选的点必须满足氧气通量（红线）接近 0。
    1. 为标记两个腔室的点，请在屏幕右侧选择O2 concentration ，选中标记点，并复制与该点相关的temperature 和barometric pressure 数值。将这些数值粘贴到下方的输入框中，然后点击屏幕右下角的Calibrate and Copy to Clipboard，如图 2所示。
    2. 对两个chambers （A 和 B）均执行此操作，然后进入File 菜单，选择Save and Disconnect。
      ​注意：校准过程结束后，程序将返回主界面，软件即可准备开始进行 HRR 测试。本测试将采用 SUIT 协议。

4. SUIT 实验方案

  1. 校准完成后，取下塞子并打开检测室。
  2. 依次用100%乙醇、70%乙醇和蒸馏水清洗塞子（握住不接触样品的一端）和检测室。
    注意：每次更换样品时均需重复此步骤。
  3. 将果蝇在200 µL缓冲液中匀浆，使用微量移液器将全部样品转移至检测室内，并将塞子重新放入检测室中，注意避免产生气泡。
    注意：若产生气泡，应轻轻取出塞子，并加入100 µL MIR05缓冲液。
  4. 点击Layout菜单，选择05 Flow by Corrected Volume选项，如图1B所示。
  5. 等待跳转至新窗口，点击Save以选择实验数据保存的文件夹。
  6. 等待另一个新窗口打开。在Experimental Code栏中为实验命名。随后在Sample栏中分别为检测室A和B中的样品命名，并将Unit栏设置为unit。
    注意：也可选择其他单位，例如Millions of cells或mg。
  7. 考虑到本方案使用两只果蝇（2个单位），且检测室体积为2 mL，因此在Concentration栏中设定为1 per mL（图1D）。
    注意：此处以果蝇数量对样品量进行了归一化处理；但也可根据样品的蛋白含量、线粒体DNA定量或柠檬酸合酶活性进行归一化。
  8. 当氧通量信号（红线）稳定在正值时，开始进行高分辨率呼吸测定（HRR）实验，依次加入底物、抑制剂和解偶联剂（图3）。所有后续试剂和设备见Table 1。
    1. 加入Digitonin（5 μg/mL）以透化线粒体膜。
    2. 加入丙酮酸（5 mM）、苹果酸（2 mM）和脯氨酸（10 mM）底物，等待氧通量上升并稳定。每次加入试剂时，按下键盘上的F4键，并在弹出窗口中输入相应试剂的name以标记事件。
    3. 加入ADP（5 mM）以耦合线粒体呼吸链，等待氧通量上升并稳定。
    4. 加入琥珀酸（10 mM），等待氧通量上升并稳定。
    5. 加入Oligomycin（2.5 µM）以抑制ATP合酶，观察氧通量的下降。
    6. 等待红线稳定后，使用羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）逐步滴加（每次0.25 µM）以解偶联线粒体电子传递，直至达到最大耗氧量（表现为红线升高）。待氧通量稳定后，依次逐个加入各复合物的抑制剂。
    7. 加入Rotenone（0.5 µM），即复合物I抑制剂。等待氧通量下降并稳定后，再加入下一个抑制剂。
    8. 加入Malonate（5 mM），即复合物II抑制剂。等待氧通量下降并稳定后，再加入下一个抑制剂。
    9. 最后加入Antimycin（2.5 µM），即复合物III抑制剂。等待氧通量先下降，随后上升并最终稳定。
      注意：氧通量应稳定在一个正值，但低于线粒体蛋白复合物最后一次抑制后的数值。
  9. 分析结束后，使用微量移液器将检测室中的所有内容物移除。必要时可于-20 °C保存，用于后续分析。

5. 数据分析

  1. 使用适当的统计软件包进行数据分析。
  2. 采用 t 检验评估两组之间的差异；对于涉及多种处理的情况，应使用方差分析（ANOVA）作为统计检验方法27。
  3. 从软件生成的图表中提取 O2 流量值。OXPHOS CI 指添加 ADP 后的 O2 流量值。OXPHOS CII 通过 OXPHOS CI&CII 减去 OXPHOS CI 计算得到。OXPHOS CI&CII 是添加琥珀酸后提取的 O2 流量值。ETS CI&CII 是添加 FCCP 后的 O2 流量值。ETS CI = FCCP - 鱼藤酮，ETS CII = 鱼藤酮 - 丙二酸。
  4. 将 ATP 合成计算为 OXPHOS（P）与 LEAK（L）之间的差值（P - L）28。
  5. 通过计算 OXPHOS 与 LEAK 的比值（P/L）来确定呼吸控制比（RCR）11。

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结果

在此，我们发现与对照果蝇相比，PINK1B9 缺失果蝇的氧化磷酸化复合物 I (P = 0.0341) 和氧化磷酸化复合物 I&II (P = 0.0392) 状态下的 O2 通量降低(图 4)。这一结果在我们课题组先前的研究中也有报道29,30。

复合物I和复合物II是电子传递系统(ETS)的关键组分，其中复合物I负责将电子从NADH传递至泛醌，而复合物II则将电子从琥珀酸传递至泛醌31,32,33。PINK1B9缺失果蝇在ETS复合物I(P = 0.0338)、ETS复合物II(P = 0.0457)以...

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讨论

HRR 是一种用于研究黑腹果蝇（D. melanogaster）及其他生物线粒体呼吸和能量代谢的强有力技术。该技术可对线粒体功能进行详细且定量的评估，使研究人员能够深入了解细胞的生物能量学特性。本文所述方案介绍了利用 SUIT 协议在黑腹果蝇（D. melanogaster）中评估线粒体呼吸链功能及特定线粒体复合物活性的方法。SUIT 协议通过系统性地调控各种底物、解偶联剂和抑制剂，以检测线粒体呼吸的不同方面。

该技术可用于评估氧化磷酸化（OXPHOS）或电子传递链（ETS）功能受损、脱氢酶活性（复合物I和复合物II）以及膜完整性（OXPHOS偶联状态）所导致的呼吸抑制。本研究中，我们采用PINK1B9基因缺失果蝇进行实验，以研究线粒体功能障碍，因其与帕金森病（PD）相关34,35。然而，该方案也可广泛应用于其他疾病模型、药物处理及毒理学研究。

此外，样...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢巴西机构高等教育人员进修协调机构（CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020）的支持。P.M.（#88887.512821/2020-00）和 T.D.（#88887.512883/2020-00）为研究奖学金获得者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ADPSigma-AldrichA5285腺苷5′-二磷酸钠盐（CAS号 72696-48-1）； ≥95%；分子量 = 501.31 g/mol
Ágar生长K25-1800用于细菌学用途
抗霉素ASigma-AldrichA8674来自链霉菌（Streptomyces sp.）的抗霉素A（CAS号 1397-94-0）；分子量  540 g/mol;
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7030牛血清白蛋白（CAS 编号 9048-46-8）；pH 7.0 ≥ 98%
Datlab 软件Oroboros Instruments，奥地利因斯布鲁克20700数据采集与分析软件
DigitoninSigma-AldrichD 5628CAS号 11024-24-1
蒸馏水
黑腹果蝇 品系 w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3来自布卢明顿果蝇品系中心
黑腹果蝇 品系 w1118获得  来自圣玛丽亚联邦大学
EGTASigma-AldrichE8145乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（CAS号 13638-13-3）； ≥97%；分子量 = 468.28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙  （CAS号 370-86-5）； ≥98%（薄层色谱），粉末 
GraphPad Prism 版本 8.0.1数据采集与分析软件
HEPESSigma-AldrichH40344-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（CAS号 7365-45-9）； ≥99.5%（滴定），经细胞培养测试；分子量 = 238.30 g/mol
高分辨率氧极谱仪 Oxygraph O2KOroboros Instruments，奥地利因斯布鲁克10022-02O2K呼吸仪启动套装
KH2PO4Sigma-AldrichP5379磷酸二氢钾（CAS编号 7778-77-0）；Reagente Plus，分子量 = 136.09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473氢氧化钾（CAS号 1310-58-3）；ACS 纯 ≥85%，沉淀
苹果酸Sigma-AldrichM1296丙二酸（CAS号 141-82-2）；纯度99%，分子量 = 104.06 g/mol。溶液pH值调节至约7.0。
苹果酸Sigma-AldrichM1000(S)-(−)-2-羟基丁二酸（CAS号 97-67-6）； ≥95%；分子量 = 134.09 g/mol
MESSigma-AldrichM36712-(N-吗啉代)乙磺酸（CAS号 4432-31-9）； ≥99%（滴定）；分子量 = 195.24 g/mol
MgCl2Sigma-AldrichM8266氯化镁（CAS 号 7786-30-3）；无水， ≥98%，分子量 = 95.21 g/mol
微量离心管Eppendorf
O2K-滴定套装Oroboros Instruments，奥地利因斯布鲁克20820-03不同体积的汉密尔顿注射器
寡霉素Sigma-AldrichO 4876Oligomycin 来自 Streptomyces diastatochromogenes（CAS号  1404-19-9); ≥90% 总寡霉素（HPLC 法）
花丝至匀浆
脯氨酸Sigma-AldrichP0380L-脯氨酸（CAS编号 147-85-3）；粉末；99%；分子量 = 115.13 g/mol
丙酮酸Sigma-AldrichP2256丙酮酸钠（CAS编号 113-24-6）， ≥99%；分子量 = 110.04 g/mol
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875Rotetone（CAS 编号 83-79-4）； ≥95%，分子量 394.42 g/mol
琥珀酸Sigma-AldrichS 2378六水合二碱式琥珀酸钠（CAS 编号 6106-21-4）； ≥99%
蔗糖默克107,651,000用于微生物学的蔗糖（CAS 编号 57-50-1）
牛磺酸Sigma-AldrichT0625CAS号 107-35-7

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