多种腺外组织和器官中的促卵泡激素（FSH）与多种疾病的发病机制相关。去卵巢并经FSH处理的小鼠模型（OVF）可用于探索FSH的腺外作用。
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摘要
摘要
在从生殖期向非生殖期（更年期）过渡的过程中，许多女性会出现显著的生理和病理变化，包括骨量减少、血脂升高以及内脏脂肪增多。在更年期过渡期间，促卵泡激素（FSH）水平升高。大量研究表明，FSH在多种性腺外组织和器官中与多种疾病的发生机制相关。因此，建立一种能够帮助研究FSH独立作用的动物模型 体内 这一点尤为重要。在本研究中，对C57BL/6雌性小鼠进行卵巢切除并补充戊酸雌二醇（OVX + E2），以消除下丘脑-垂体-性腺轴的影响。OVX + E2小鼠通过腹腔注射给予溶剂（N.S.）或不同剂量的重组FSH，建立一种表现为相对稳定的雌激素水平和升高的FSH水平的小鼠模型（OVF）。因此，我们成功构建了一种模拟围绝经期早期阶段的实验小鼠模型，其特征为血清FSH水平升高。OVF模型具有稳定、成本低和操作简便的优点，适用于探索FSH的性腺外作用的研究。本文详细描述了小鼠OVF模型的实验方案。
引言
在围绝经期过渡阶段（2011年“生殖衰老分期研讨会（STRAW）+10系统”中定义了该术语），促卵泡激素（FSH）水平升高1。围绝经期过渡期以FSH水平上升和雌激素水平相对稳定为特征1，在此期间，女性会出现月经周期改变以及涉及多种细胞和组织的显著生理变化。这些变化可能严重影响女性的生活质量和健康状况。探索FSH的作用可能有助于改善女性的生活质量和健康。
促卵泡激素（FSH）由垂体前叶的促性腺激素细胞分泌，在调控性腺功能和生殖过程中起关键作用2FSH 的功能通过促卵泡激素受体（FSHR）介导，该受体属于G蛋白偶联受体（GPCR）3FSHR 通常在性腺（即卵巢和睾丸）中表达。已有研究证实，FSHR 在多种性腺外细胞和组织中普遍存在，包括肝脏4，海马体5，破骨细胞6，脂肪细胞7和内皮细胞8新兴研究揭示了促卵泡激素（FSH）的性腺外作用及其在血脂异常中的潜在临床意义4阿尔茨海默病5，骨质疏松症9,10动脉粥样硬化11肥胖9，以及癌症12因此，构建一种动物模型以帮助研究促卵泡激素（FSH）的独立作用 体内 在单独探究促卵泡激素（FSH）作用时尤为重要。
在本实验方案中，我们介绍了建立一种雌激素水平相对稳定而促卵泡激素（FSH）水平升高的小鼠模型的方法13。该小鼠模型通过卵巢切除手术，并随后补充戊酸雌二醇和重组FSH，以模拟围绝经期的生理转变。在卵巢切除小鼠中，通过外源性补充雌激素，使其雌激素水平与假手术小鼠保持相近，由于雌激素对垂体的负反馈作用，内源性FSH水平保持稳定。在此基础上，可通过给予外源性FSH来调控FSH水平，而不会干扰雌激素水平。因此，OVF小鼠模型能够排除雌激素的影响，专门观察FSH在性腺外的生理与病理作用。我们相信，这一详细且可视化的操作流程将有助于研究人员在各自实验室中成功建立OVF小鼠模型，并根据需要应用于围绝经期生理与病理变化的研究。
方案
以下实验方案符合所有关于实验动物使用的机构伦理准则，并已获得中国山东省立医院动物伦理委员会的批准。所有手术操作均在深度麻醉下进行，动物在实验过程中的任何阶段均未经历疼痛。
1. 术前准备
- 器械灭菌
- 手术前将手术器械在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌（121°C，15分钟）。准备充足的可吸收缝线和缝合针。
- 手术平台设置
- 在专用于手术操作的房间内进行手术。预留至少60 cm × 60 cm的台面区域用于操作。用75%酒精清洁台面，并覆盖一次性医用毛巾，然后提前30分钟进行紫外线消毒（图1A）。
- 动物准备
- 将所有动物饲养于温度可控的房间（20–25 °C），光照周期为12小时光照/12小时黑暗。手术前将8周龄雌性C57BL/6小鼠适应饲养环境1周。
- 手术前称量小鼠体重。对所有9周龄雌性小鼠通过腹腔注射三溴乙醇（280 mg/kg）实施全身麻醉，以确保手术各阶段均无痛感。在手术前约1小时皮下注射美洛昔康（2 mg/kg）以缓解疼痛。
- 涂抹眼膏以防止手术期间角膜干燥。
- 使用干净的棉签将脱毛膏涂抹于小鼠背部。让脱毛膏在小鼠皮肤上停留3–5分钟，然后用纱布和棉签去除毛发。重复此步骤，直至小鼠背部所有毛发完全清除。
- 使用纱布和棉签以75%酒精清洁皮肤。用橡胶带或棉绳将小鼠仰卧固定于手术平台上（图1B），并用碘伏溶液擦拭背部进行消毒。
注意：在卵巢切除术前，需通过夹趾反应确认麻醉深度。
2. 卵巢切除术
注意：三溴乙醇的麻醉效果可维持约30分钟，应尽可能在此时间内完成手术操作。
- 使用一次性手术刀从大腿根部向上纵向做长约1.0 cm的背部切口，确保仅切开皮肤和皮下筋膜，此时避免切开后腹膜。
- 将切口向左侧拉开，可见一白色脂肪垫。使用显微镊子和剪刀沿白色脂肪垫剪开约0.5 cm，以暴露腹腔。
- 切开后腹膜后，用显微镊子缓慢轻柔地将白色脂肪垫从腹腔中移除。立即将白色脂肪组织用浸有0.9%无菌生理盐水的纱布润湿。组织暴露于腹腔外时，应始终保持湿润。
- 在白色脂肪垫的下部附着有粉红色颗粒状结构，即卵巢（图2A）。卵巢连接于一条细长的管道，即子宫。使用5-0可吸收缝线结扎子宫的卵巢端，并切除左侧卵巢（图2B）。
- 切除卵巢时，应尽可能保留周围脂肪组织。避免手术器械直接接触卵巢，并防止卵巢组织种植于腹腔内。
- 仔细将白色脂肪垫复位至腹腔内。使用5-0可吸收缝线对后腹膜行间断缝合（图2C）。缝合完成后，用浸有0.9%无菌生理盐水的纱布清理任何出血点。
- 将皮肤切口向右侧拉开，采用相同方法切除右侧卵巢。
- 使用4-0不可吸收缝线行间断缝合，并用浸有0.9%无菌生理盐水的纱布清理出血点（图2D）。
- 完成两处缝合后，用碘伏溶液清洁伤口，并腹腔内注射广谱抗生素。
3. 术后观察
- 术后将小鼠移至37 °C恒温毯上。在小鼠能够自由活动之前，将其保留在各自的笼具中。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看护。
- 术后24小时后皮下注射美洛昔康（2 mg/kg）以缓解疼痛。
- 每天监测小鼠，确保手术伤口正常愈合，无任何并发症（如伤口裂开）迹象。
4. 雌二醇补充
- 准备添加戊酸雌二醇的饲料。每1 kg饲料中添加2.6 mg戊酸β-雌二醇17-戊酸酯。
- 手术完成后第3天，开始用含戊酸雌二醇的饲料喂养小鼠。
5. 注射促卵泡激素（FSH）
- 制备重组人促卵泡激素（FSH）溶液。将注射用重组人促卵泡激素冻干粉用0.9%无菌生理盐水溶解，配制成100 IU/mL的溶液。
- 根据实验设计将小鼠分组，并通过腹腔注射给予溶剂或不同剂量的重组FSH，持续2周。根据重组FSH的生物活性，采用与女性围绝经期血清FSH水平相当的剂量对小鼠进行注射。
注意：根据不同的处理方式，去卵巢并补充雌激素的小鼠被随机分为三组：溶剂对照组（N.S.组）每日给予100 µL溶剂，低剂量FSH组（L-FSH组）每日给予15 IU/kg体重，高剂量FSH组（H-FSH组）每日给予30 IU/kg体重。
结果
OVF 小鼠模型模拟了围绝经期早期阶段，其特征为雌激素水平相对稳定而促卵泡激素（FSH）水平升高13。首先，对9周龄雌性C57BL/6小鼠实施全身麻醉，进行假手术（Sham）或双侧卵巢切除术（OVX）。通过巴氏染色细胞涂片图像可清晰识别动情周期中的动情前期、动情期、动情后期和动情间期，而OVX小鼠则失去了动情周期（图3A），ELISA方法显示其血清雌二醇（E2）水平显著降低（图3B）。其次，对OVX小鼠补充戊酸雌二醇（OVX + E2），以维持其血清雌激素水平与假手术组相当。第三，对OVX + E2小鼠腹腔注射溶剂（N.S.）或不同剂量的重组FSH，从而建立具有相对稳定的雌激素水平和升高的FSH水平特征的小鼠模型（OVF）（图4）。
图 1。手术环境与小鼠体位。（A）至少 60 cm × 60 cm 的操作台区域。用 75% 酒精清洁台面，铺上一次性医用毛巾，并提前进行 30 分钟紫外线消毒。（B）使用橡胶条或棉绳将小鼠仰卧固定于手术平台上。请点击此处查看该图的放大版本。
图2。手术操作的关键步骤。 （A）卵巢位置，（B）卵巢切除，（C）缝合腹膜，以及（D）缝合皮肤切口。 请点击此处查看该图的高清版本。
图3．阴道细胞学。 阴道细胞学反映了卵巢切除小鼠（OVX）和假手术小鼠（Sham）的动情周期阶段及内源性雌激素水平（Sham组n = 12；每个OVX组n = 10）。(A) 根据白细胞、角化上皮细胞和有核上皮细胞的相对存在情况，阴道细胞学表示动情周期的不同阶段。动情周期包括：动情前期（proestrus），以有核上皮细胞为主；动情期（estrus），以无核角化细胞为主；动情后期（metestrus），出现白细胞以及角化和有核上皮细胞；动情间期（diestrus），以白细胞为主。比例尺 = 100 µm。(B) 卵巢切除小鼠（OVX）与假手术小鼠（Sham）的内源性雌激素水平。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计分析采用Student's t检验。***p< 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．OVF 模型及血清激素水平。（A）OVF 模型流程图。（B）血清雌二醇（E2）和促卵泡激素（FSH）浓度的 ELISA 分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学分析。*p< 0.05，**p< 0.01。该图改编自4。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
从生殖期向非生殖期（绝经期）过渡期间，许多女性会经历显著的生理和病理变化。在绝经期过渡阶段，促卵泡激素（FSH）水平升高。1新兴研究表明，卵泡刺激素（FSH）在多种性腺外组织和器官中对包括血脂异常在内的多种疾病的发病机制具有重要作用4阿尔茨海默病5骨质疏松症9,10动脉粥样硬化11，肥胖9，以及癌症12因此，构建一种动物模型以帮助研究促卵泡激素（FSH）的独立作用 体内 这一点尤为重要。OVF小鼠模型模拟了围绝经期早期相对稳定的雌激素水平和升高的FSH水平，特别适用于探索FSH的卵巢外作用的研究。
本方法采用单个背部 dorsal 切口进行卵巢切除术，切口位置位于大腿基部上方约 1 cm 处（图 1B）。使用锐利的解剖剪几乎同时剪开皮肤和背肌，从而进入腹膜腔。术后肌肉切口无需缝合，皮肤切口则用一根肠线进行双侧缝合闭合（图 2）。与其他常用方法相比，该手术操作更简便、耗时更短，对雌性小鼠的伤害也更小。
手术过程中应注意的一些细节：首先，所有手术操作应保持清洁并尽可能无菌，以降低术后感染的风险。其次，由于卵巢组织非常脆弱，在切除卵巢时手术器械不得直接接触卵巢，以避免发生腹腔内种植。第三，手术后应将小鼠移至37 °C恒温毯上恢复，以防止术后低体温导致死亡。
先前的研究已证实，内源性雌激素在绝经前女性的卵巢鞘细胞或绝经后女性乳腺的脂肪基质细胞中合成，少量也在外周组织中合成14。卵巢切除小鼠的血清雌激素水平急剧下降，但无法完全消除（图3B）。然而，肾上腺外组织合成的内源性雌激素并不影响OVF模型中雌激素水平的稳定性（图4B）。
OVF 模型存在一些局限性。一旦手术操作不慎导致卵巢腹腔内种植，可能引起模型失败。在此情况下，血清雌激素水平不会急剧下降，并在动情周期的不同阶段出现波动。外源性给予雌激素和 FSH 后，机体需要约 1 周时间才能达到稳态。因此，OVF 模型在 1 周内出现的病理变化不能反映 FSH 的作用效果。
综上所述，OVF 模型具有稳定、成本低和易于操作的优点。通过腹腔注射促卵泡激素（FSH）后，可观察到高水平 FSH 的全身性作用；也就是说，OVF 模型适用于探索 FSH 促性腺腺外作用的研究。然而，该模型对手术操作和腹腔注射技术的要求较高。如果经费充足，特异性基因敲除模型是最佳选择。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢山东省医院动物实验室提供的技术支持。本工作得到国家自然科学基金（NSFC 82101645）、中国山东省自然科学基金（ZR2020QH088）以及山东省高校青年科技创新科技支持计划（2021KJ051）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β-雌二醇-17-戊酸酯 | Macklin | E829824 | |
| 雌二醇敏感型ELISA试剂盒 | Demeditec | DE4399 | |
| 苏木精染色液 | Beyotime | C0107 | |
| 美洛昔康 | Aladdin | M129228 | |
| 重组人促卵泡激素 | Merck Serono | N19Z8803G | |
| 三溴乙醇 | Sigma | T48402 | 脂肪族名称：2,2,2-三溴乙醇 |
参考文献
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
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