敲低FAM83A以验证其在宫颈癌细胞生长及顺铂敏感性中的作用

摘要

本文展示了敲低FAM83A的实验步骤，以及检测其对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的检测方法，并探讨了这些细胞对顺铂敏感性的变化。本研究为宫颈癌提供了一个有前景的靶基因，也为后续药物研究提供了参考依据。

摘要

探索肿瘤靶基因对于宫颈癌的预防和治疗具有极其重要的意义。在本研究中，我们概述了在宫颈癌中鉴定肿瘤靶基因FAM83A的各个步骤。首先，利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）数据集验证FAM83A在女性中的表达水平及其预后意义。使用小干扰RNA（siRNA）在HeLa和C33a细胞中对FAM83A基因进行敲低。随后，通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色检测肿瘤细胞增殖能力的变化。通过划痕愈合实验和多孔膜插入实验评估肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

采用蛋白质印迹法（Western blotting）定量检测凋亡相关蛋白的表达水平。利用JC-1染色法评估线粒体功能的变化。此外，通过顺铂（二氨二氯铂，DDP）干预以评估目的基因的治疗潜力。通过流式细胞术和克隆形成实验进一步验证该基因的抗肿瘤特性。结果表明，FAM83A 基因敲低可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并增强这些细胞对顺铂的敏感性。上述综合方法共同证实 FAM83A 是一个与肿瘤相关的靶基因，在宫颈癌的预防与治疗中具有作为潜在治疗靶点的前景。

引言

宫颈癌是一个全球性健康问题，作为全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，是导致女性癌症相关死亡的主要原因¹。在早期阶段，根治性手术和放化疗具有较高的治愈率。然而，对于进展期宫颈癌并发生转移性疾病的患者，治疗效果极不理想²。因此，深入理解宫颈癌细胞迁移和侵袭的生物学机制，并确定可用于预防和治疗该疾病的潜在治疗靶点，具有重要意义。

鉴定参与癌症进展的靶基因并寻找抑制其表达或功能的方法，为癌症治疗提供了有前景的策略。在本研究中，我们鉴定了 FAM83 作为致癌基因，并进一步研究了其抑制作用 C33a 和 HeLa 细胞。FAM83家族癌基因（FAM83A-H在人类癌症中广泛报道^3,4. 近年来， FAM83A 在肺中被报道呈上调⁵，乳腺⁶，卵巢⁷，以及胰腺⁸ 癌症，表明 FAM83A 通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、类干细胞特性及药物抵抗，在癌症进展中发挥重要作用。尤为重要的是， ....

方案

本研究完全符合癌症基因组图谱（TCGA）提供的出版指南（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见 材料表。

1. 数据来源与生物信息学分析

1. 从癌症基因组图谱（Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://cancergenome.nih.gov）获取RNA测序数据 用于聚类分析。使用 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/），一个基于网络的工具，对来自 TCGA 项目的样本原始 RNA-Seq 数据进行重新计算，通过标准处理流程筛选候选癌症药物靶点。
   注意：GEPIA 网站对所有用户免费开放。
2. 访问GEPIA网站主页并点击 癌症类型分析，选择 差异基因分析 选项，并设置以下参数： 癌症名称 = CESE （定义为 宫颈鳞状细胞癌和宫颈管腺癌 在此网页上） |Log2FC| 阈值 = 1，q值阈值 = 0.01，差异分析方法 = ANOVA 和 染色体分布 = 两者均有

结果

TCGA数据库分析与PCR验证

根据TCGA数据库分析，我们对306例子宫颈癌细胞样本和13例正常细胞样本中的mRNA表达水平进行了比较分析，以研究FAM83A的差异表达情况。FAM83A在子宫颈癌中表达上调，而在正常子宫颈组织中其表达可忽略不计（图1A）。为了进一步了解FAM83A表达的预后意义，我们进行了Kaplan-Meier生存曲线分析。结果显示，FAM83A表达水平较高的患者总体生存率显著较差（图1B）。为明确FAM83A在子宫颈癌中的作用，我们检测了两种子宫颈癌细胞系HeLa和C33a以及一种永生化子宫颈细胞系End1/E6E7中FAM83A的表达水平。通过qRT-.......

讨论

研究肿瘤靶基因对于宫颈癌的预防和治疗具有极其重要的意义。明确在宫颈癌发生和发展过程中起关键作用的特定基因，有助于深入理解该疾病的分子机制。此外，鉴定这些靶基因可为开发新型治疗策略和靶向疗法提供依据。在本研究中，我们通过分析TCGA数据库，鉴定出FAM83A为一个靶基因 ，并探讨其在宫颈癌中的作用机制。我们发现，FAM83A在宫颈癌细胞中呈现显著高表达，且与宫颈癌患者的不良预后相关。一系列基于细胞的实验表明，FAM83A在宫颈癌细胞中的高表达在调控细胞增殖、迁移和侵袭过程中发挥关键作用。抑制FAM83A的表达可抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移，并促进细胞凋亡。

构建FAM83A基因敲低的宫颈癌细胞系是本研究最关键的步骤。根据靶基因序列设计并验证siRNA，以确保其有效性。随后，将siRNA转染至宫颈癌细胞系中。质粒转染的成功率对后续实验至关重要，需严格控制细胞密度和质粒浓度。此外，通过荧光显微镜观察转染效率，以确保后续实验的顺利进行。Western blotting和qRT-PCR结果证实，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞与培养基配方
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
改良培养基			10% 胎牛血清，加抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素）
抗体信息
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85亚基	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
二抗	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
材料
6孔板	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA蛋白检测试剂盒	Beyotime, 中国		P0011
ChemiDoc XRS成像系统	BioRad
增强型化学发光检测试剂盒	Servicebio, Inc., 中国		货号 G2014
荧光显微镜	Olympus Corporation, 东京, 日本
Hifair II 第一链cDNA合成超混液	11123ES60, 翌圣生物科技有限公司, 中国
倒置显微镜	Olympus, 东京, 日本;
Millicell transwell小室	Millipore, Bedford, MA, 美国
线粒体膜电位检测试剂盒	Beyotime, 中国
PMSF	ST506, 碧云天生物技术, 江苏, 中国		#ST506
实时定量PCR仪	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. 中国.
RIPA裂解液	碧云天生物技术, 江苏, 中国
TRIzol试剂	Invitrogen		15596026
TRIzol试剂	Takara Bio Inc., 大津, 日本
软件
Image-Pro	plus 6.0