偏振敏感双光子显微镜用于无标记淀粉样蛋白结构表征

摘要

本文介绍了如何应用偏振敏感双光子显微镜来表征无标记淀粉样超结构——球晶内部的局部有序性。同时描述了样品的制备与测量方法、所需装置的组装过程，以及数据分析流程，以获取关于淀粉样纤维局部排列结构的信息。

摘要

与单光子激发相比，双光子激发在生物成像实验中具有优势，因其光毒性更低、组织穿透更深、在密集系统中操作更高效，并且能减少荧光分子的角向光选择效应。因此，在双光子荧光显微镜（2PFM）中引入偏振分析，相较于基于线性光学过程的标准成像方法，能够更精确地确定样品中分子的排列结构。本文重点研究偏振敏感型双光子荧光显微镜（ps-2PFM）及其在复杂生物结构——淀粉样蛋白球晶——内部分子有序性测定中的应用。阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病通常通过检测淀粉样蛋白进行诊断，这类蛋白是由于蛋白质错误折叠过程受阻而形成的聚集体。对其结构的深入研究有助于更好地理解其形成途径，进而推动更灵敏诊断方法的开发。本文展示了适用于牛胰岛素球晶及球形淀粉样蛋白聚集体内部原纤维有序性分析的ps-2PFM技术，并证明该方法能够解析球晶内部原纤维的三维空间组织结构。

引言

在过去的几十年中，尽管已开发出多种用于蛋白质及其聚集体生物成像的荧光显微技术¹只有少数被用于确定它们在样品中的局部排列顺序^2,3荧光寿命成像显微镜⁴ 用于研究淀粉样超结构——球晶的内在结构异质性。此外，利用偏振敏感方法可实现对球晶等复杂且高度密集的生物结构内部局部有序性的定量测定。³然而，由于采用紫外-可见光波长激发荧光团，传统的荧光技术受限于较浅的组织穿透深度 体内 导致组织对光的散射显著增强⁵此外，此类成像通常需要设计并结合针对特定生物分子的荧光探针，从而增加了成像所需的成本和工作量。

最近，为了解决这些问题，我们的团队已将偏振敏感双光子激发荧光显微技术（ps-2PFM）应用于生物结构的无标记成像^6,7。ps-2PFM 能够测量双光子荧光强度对激发光束线性偏振方向的依赖性，并分析发射荧光的偏振特性⁸。该技术的实现需要在标准多光子显微镜激发光路（图1）中增加一个半波片，以调控入射光的偏振面。随后，通过两个雪崩光电二极管采集信号，获得荧光偏振的两个相互垂直分量，并据此生成偏振图，用以描绘双光子激发荧光强度随激发激光偏振方向的变化关系。

最后一步是数据分析过程，需考虑光学元件（如二向色镜或高数值孔径物镜）对偏振的影响。由于双光子过程的特性，该方法不仅降低了角度光选择效应，还提高了轴向分辨率，因为焦点平面以外的荧光分子发生双光子激发的概率受到限制。此外，已有研究证明，类似方法可成功应用于 体内 近红外探针（NIR）的深组织成像⁹. Ps-2PFM 之前已用于成像细胞膜中的荧光团¹⁰ 和 DNA^11,12，以及生物系统的非标准荧光标记物，如金纳米颗粒¹³然而，在所有这些例子中，关于生物大分子组织结构的信息都是间接获得的，并且需要预先设定荧光团与生物大分子之间的相对取向。

在我们近期发表的一篇论文中，已证明皮秒级偏振双光子荧光显微术（ps-2PFM）可成功用于测定淀粉样超结构的自发荧光以及硫黄素T（Thioflavin T，一种特异性结合淀粉样纤维的染料）在球晶中结合后的荧光局部偏振特性⁶。此外，在另一项研究中，我们证实ps-2PFM可用于检测亚微米尺度下淀粉样球晶内部淀粉样纤维的取向，该结果通过与透射电子显微镜（TEM）成像的相关性分析得到了验证⁷。实现这一成果的关键在于：i）球晶-淀粉样蛋白在单光子或双光子激发下表现出固有的自发荧光，其发射光谱最大值位于450至500 nm范围内，且双光子吸收截面与标准荧光染料相当¹⁴；ii）此前建立的数学模型可用于描述标记生物膜和DNA结构的染料的ps-2PEF行为，这些模型同样适用于球晶本身及其结合染料所表现出的荧光特性^8,11,15。因此，在开展分析之前，我们强烈建议仔细阅读本课题第一篇论文的正文及支持信息中所阐述的相关理论内容⁶。本文中，我们展示了如何应用ps-2PFM技术对牛胰岛素淀粉样球晶进行无标记的结构表征的实验方案。

方案

1. 准备含有完全生长的球晶的显微镜载玻片

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。所有溶液均使用水纯化系统制备的去离子水（25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm）配制。

1. 根据 Krebs 等人¹⁶. 描述的方案孵育淀粉样蛋白球晶，并进行如下所述的一些修改。
   1. 在 1.5 mL 离心管中称取 10 mg 胰岛素粉末。
   2. 加入 1 mL 去离子 H₂O/HCl 溶液（pH 1.5），溶解粉末。
   3. 用封口膜密封样品，置于恒温混匀仪中，在 70 °C 下孵育 24 小时（0 rpm）。
      注意：为了在淀粉样蛋白的天然（即水合）环境中进行成像，并防止样品因脱水而变形，必须按照以下说明制备显微镜载玻片（示意图见 图2）。
2. 用清水彻底清洗显微镜玻璃载玻片。
3. 将载玻片浸入甲醇中，然后放置在无尘擦拭纸上，在常温条件下自然晾干。
4. 使用自动移液器从离心管中吸取 100 µL 球晶溶液（步骤 1.1.2），加入到显微镜载玻片中央区域的凹槽中。
5. 用盖玻片覆盖溶液，避免产生气泡。
6. 使用自动移液器将封片剂沿盖玻片边缘滴加到载玻片上，以密封球晶的天然溶液。
   注意：必须将封片剂同时滴加在盖玻片和载玻片表面，这一点至关重要。由于挥发性溶剂（二甲苯）具有毒性，操作应在通风橱内进行。参见 图2 中的插图。
7. 将显微镜样品置于常温条件下，使封片剂硬化。
   注意：硬化过程受温度和湿度影响，但通常在 12 小时内完成。
8. 使用交叉偏振器的偏光显微镜（POM）检查胰岛素球晶是否正确形成。在整个样品中扫描，寻找称为马耳他十字的亮区特征图案，如 图3 所示。
   注意：淀粉样蛋白球晶可定义为具有异质形态和核-壳结构的球形超结构。具体而言，它们由无定形核心和呈放射状生长的淀粉样纤维组成¹⁶。由于球晶结构具有各向异性，可与偏振光发生明显相互作用（例如通过折射），并改变其相位，这可在配备交叉偏振器的偏光显微镜下轻松观察到。本研究仅针对具有典型马耳他十字图案的完全发育球晶进行分析，因此排除了聚集体或结构畸变的球晶，不进行后续研究。

2. 构建与系统对准

注意：偏振敏感双光子显微镜的示意图见图1。

1. 安装一台输出波长可在 690–1,080 nm 范围内调谐的飞秒激光器，例如，采用锁模钛宝石（Ti:Sapphire）激光器，输出约 100 fs 脉冲，重复频率为 80 MHz。
2. 在系统的激发光路中加入一个安装在旋转台上的半波片，用于控制入射光在显微镜样品 XY 平面上的偏振方向。
3. 安装二向色镜，以将激发光束从检测光路中分离出去。
   注意：二向色镜的光学特性应能够在近红外（NIR）波长范围内反射激发光束（至样品），同时对样品发射光对应的波长范围具有透射性。
4. 安装压电扫描台，用于在选定的 Z 位置对 XY 平面进行光栅扫描。
5. 安装高数值孔径（NA）浸没物镜，例如，100×/1.4 NA 的复消色差油浸物镜。
   注意：由于整个系统工作在倒置荧光模式下，入射光和发射信号均通过同一物镜传输。
6. 在发射光路中加入一个偏振分束器，将双光子激发发射光分为两个正交偏振分量（I_X 和 I_Y）。
7. 安装两个光子计数型雪崩光电二极管（APD），分别用于收集经分束器透射和反射的光信号（图 1）。
8. 在系统的激发和发射光路中安装相应波长的截止滤光片，例如，在激发光路中直接安装 800 nm 长通滤光片，在发射光路中安装 700 nm 短通滤光片。
   注意：应分析球晶的发射光谱，以便通过合适的发射滤光片排除可能来自二次谐波产生（SHG）或激光杂散光的信号贡献。还需注意，该系统也可用于偏振敏感的 SHG 测量，从而解析样品内生物分子的取向排列。然而，SHG 信号的数据分析方法与荧光不同，更详细的描述可参见 Aït-Belkacem 等人¹⁷ 的研究。
9. 调整整个系统（使用激光器内置的对准模式），直至两个光电二极管收集到的信号强度相近。
10. 检查高 NA 物镜聚焦后的激发光束在相机上成像是否呈同心圆形，如 图 4A 所示。
11. 调节扫描时间和相应的激光功率，以最小化入射激光对样品造成的损伤。典型的点状烧蚀现象如 图 4B 所示。使用连接至显微镜入口处光电功率传感器的数字手持式功率计测量标称功率。
    注意：生物样品容易因激光照射而受损。本实验中，物镜焦点处 100–900 µW 的功率范围在样品稳定性与强发射信号之间取得了良好平衡。
12. 在进行样品测量前，使用各向同性参考样品（例如，嵌入非晶聚合物中的荧光素）测试光学系统的对准质量。执行校准检查时，请参照第 3 节所述步骤，但以各向同性参考样品替代淀粉样样品。
    注意：假设显微系统已针对各向同性样品理想对准，则两个 APD 检测到的双光子发射分量（I_X 和 I_Y）应具有相同的强度（图 4C）。

牛胰岛素球晶的测量

注意：为了完成所有描述的 ps-2PF 测量，使用了自行编写的软件，该软件可控制压电载物台和半波片的位置，并采集两个光电二极管的信号，从而能够绘制显微镜载玻片选定区域的 XY 扫描图（光栅扫描）以及特定样品坐标的极坐标图。本方案中还增加了额外说明，使用户无需该软件也能完成测量，因为用于移动压电载物台和旋转半波片的旋转台均可通过其自带控制器或配套软件进行控制。尽管如此，仍强烈建议编写一个将半波片旋转角度与两个光电二极管采集的 2PEF 强度关联起来的算法，因为这种相关性（极坐标图）对于获得结构信息的正确数据分析至关重要。

1. 将带有球晶的样品固定在压电载物台上（用胶带固定玻璃载玻片）。确保以薄玻璃侧（盖玻片）朝向物镜的方式安装，因为高数值孔径的物镜通常具有较短的工作距离。
   注意：由于使用油镜，应在安装和聚焦样品前，在物镜上滴加一滴矿物油。
2. 通过显微镜旋钮调节 XY 和 Z 位置，将物镜聚焦于溶液中观察到的某一球晶上，但需注意球晶直径通常在数十 µm 范围内，因此应聚焦于整个结构的中心区域。观察特定球晶周围是否存在黑色和白色光环，分别作为欠焦和过焦的标志。调节“Z”轴位置，使其处于这两种极端状态之间。
   注意：应寻找无结构缺陷的孤立样品。过小的球晶可能因物镜引入的材料应力而漂移，而过大的结构可能已发生聚集或严重形变。
3. 将球晶置于显微观察平面视野中央，并通过观察压电载物台在 X 和 Y 方向需要多少步（显示在压电载物台控制器或其软件中）来覆盖整个结构的面积，从而确定 XY 扫描范围。
   注意：建议将系统设置为使 XY 扫描起始点位于球晶某一角落附近，并与载物台的零位（X 和 Y = 0）重合。
4. 调节以下扫描参数：
   1. 调节激发光束的偏振方向，旋转半波片以获得与显微镜样品平面“X”和“Y”轴相对应的偏振方向。
      注意：可通过测量各向同性荧光介质（如荧光素）的偏振图完成此操作。对于此类材料，荧光强度最大值与激发光束偏振方向平行；因此，旋转半波片可调节观测平面上 X 和 Y 轴方向的偏振，如图4C中偏振图所示的 X 和 Y 轴。通过在半波片旋转180°（即激发光偏振方向旋转360°）过程中，收集两个光电二极管测得的双光子激发荧光（2PEF）强度，并将强度与激发光偏振角相关联，可获得完整的偏振图。该过程可手动完成，即分别测量每个半波片角度下的发射强度，再在数据分析软件中整合为偏振图；也可通过专用或自编软件自动完成。
   2. 调节压电载物台参数：扫描速度、步长和范围，以覆盖整个球晶区域。
      注意：扫描范围必须大于球晶直径，以确保在光栅扫描中完整框定整个超结构。较低的扫描速度和步长可获得高质量图像，但可能导致样品灼伤。因此，需根据球晶尺寸权衡取舍。这些参数无法通用。图5A中使用的示例参数为：扫描范围 45 × 45 µm，扫描步长 1 µm，扫描速度 2 µm/s。
5. 打开快门，开启光电二极管，针对激发光束分别沿 X 轴和 Y 轴偏振的情况，采集选定扫描区域内每一步的和双光子发射组分。胰岛素球晶的典型双光子激发自体荧光（2PAF）光栅扫描图如图5A所示。
   注意：测量光栅扫描需将压电载物台坐标与采集的和发射组分相关联，可通过手动方式完成，即测量选定区域每个点的强度，再将其整合为二维矩阵；也可通过自编软件自动完成。光栅扫描可表示为和发射组分强度的总和，或针对特定发射组分单独呈现。由于这些图像高度依赖于结构，球晶内部的结构畸变易于识别。然而，由于显微镜载物台的移动，部分样品可能偏离视野。因此，需对图像进行伪影筛查。扫描前后必须检查球晶的位置。
6. 为对样品上特定位置进行完整的偏振分析，关闭激发光束。
7. 随后，选择压电载物台上对应于球晶上所需获取分子取向信息位置的特定坐标，分辨率需达到亚 µm 级。
8. 调节压电载物台，使指定（X, Y）位置位于视野中心。
9. 开启激发光束，并通过启动半波片旋转（180° 旋转）对和发射进行完整的（360°）偏振分析。以极坐标图形式呈现 2PF 的 Ix 和 Iy 组分（如图5B所示）。
   ​注意：此步骤可在样品不同位置重复进行，以收集足够多的数据。

4. 牛胰岛素球晶内部局部原纤维有序性的测定

注意：所有与数据分析相关的数值计算均使用 Python 编程语言完成，并基于 NumPy 和 SciPy 库中提供的函数进行。数据绘图需要使用 Matplotlib 库。所有计算均依据 Obstarczyk 等人发表的一篇论文的补充信息中提供的公式进行⁶。

1. 模拟具有指定分子分布和特定入射光偏振方向（用符号表示）的双光子荧光激发强度 α)
   注意：所给出的公式基于荧光团的吸收偶极矩与发射偶极矩相互平行的假设。关于其他情况（例如吸收与发射偶极矩方向不同、荧光团之间的能量转移）的讨论，请参见 Le Floc'h 等人的论文。⁸.
   1. 通过分析实验装置中二向色镜引起的偏振混合和去偏振效应，确定导致电场变化的参数：
      1. γ 表示反射率之间的振幅因子 和 来自二向色镜的偏振光
      2. δ 表示相位偏移（椭圆率）之间的差异 和 偏振光
         注意：由于这两个参数对所测极坐标图的形状有显著影响，正确定义它们对于成功的结构表征至关重要^11,18在本系统中，这两个参数是在对系统中使用的二向色镜进行椭圆偏振测量时确定的。
   2. 使用公式（计算在ps-TPFM测量过程中沿X轴和Y轴传播的每个测量角度的入射电场矢量1-5).
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      注意：若以1°为步长测量整个360°范围内的强度，需计算所有360°对应的电场矢量。所有角度均应以弧度表示。 ρ 参数与光频率相关联 ω 模拟电场的ρ=ω·t并在计算每个角度下沿X轴和Y轴传播的入射电场矢量时，从0到2π进行积分 α 在皮秒时间分辨双光子荧光显微测量期间测得。
   3. 根据方程定义笛卡尔坐标系三个轴方向上的跃迁偶极矩函数6-8):
      (6)
      (7)
      (8)
      注意：φ 是淀粉样纤维长轴在 XY 样品坐标系中的取向角。θ 和 ϕ 角度为用于定义荧光团跃迁偶极矩取向的极角和方位角。 
   4. 使用第 4.1.3 步中定义的函数来定义函数 J_x (Φ,θ,φ）和 J_Y (Φ,θ,ϕ），该部分通过公式（9, 10）描述了高数值孔径物镜在X和Y方向荧光偏振检测中对光聚焦紧密性的贡献。 
      (9)
      (10)
      注意： K₁, K₂, K₃ 因素与ps-TPFM测量过程中所用的显微镜物镜相关。在这些实验中，使用了100倍/1.4数值孔径的复消色差油浸物镜 K₁, K₂, K₃ 分别为 2.945、0.069 和 1.016。
   5. 定义一个函数用于 f（Ω），表示分子角分布，取决于荧光分子圆锥的半孔径角Ψ，以及可变的厚度ΔΨ；使用公式（11）。关于淀粉样纤维的这三个角度的图示表示如图所示 图6.
        (11)
      注意：书写指数时需谨慎——2 的幂作用于函数的自变量，而非整个函数！
   6. 定义全部 f_WWIJKL 如公式所示的因素（12-21).
      (12)
      (13)
      (14)
      (15)
      (16)
      (17)
      (18)
      (19)
      (20)
      (21)
   7. 计算双光子激发荧光强度 和 对于每个测量角度（类似于4.1.2节中的方法），使用公式（22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. 使用以下变量值检查模拟是否正常工作（置于图例中） 图7）并将获得的结果进行比较 图7A- C.
      注意：所有角度均应以弧度表示。
2. 将模拟强度拟合到飞秒-双光子显微测量期间采集的牛胰岛素球晶双光子激发自体荧光强度。
   注意：基于皮秒级双光子荧光显微（ps-2PFM）测量结果解析球晶结构，需利用本方案中列出的公式模拟双光子激发荧光的理论强度，并拟合所有与分子荧光团取向相关的参数。该过程需对Φ（描述纤维在显微镜样品XY平面内旋转角度）和Δ等多个参数进行多次迭代计算。Ψ，发射偶极子锥形分布的异常 Ψ 由于固定后细丝中的分子旋转所致 Ψ 直至达到最高可能的 R 值² 测量期间采集的归一化双光子激发荧光信号强度与根据方案步骤4.1模拟的归一化强度之间的相关系数。
   1. 确定 Ψ 半角
      注意：对于牛胰岛素球晶，其值应相等 Ψ = 29°⁶.
   2. 拟合工作流程：
      1. 从 0° 到 180° 之间选择 Φ 的值（以 图8A 和8B Φ = 16° 和 127°，分别）。
      2. 选择 Δ 的值Ψ 从 0° 到 90°（如图 8A、B 所示，ΔΨ 分别为 24° 和 1°。
      3. 计算 （公式 22）和 （公式 23）适用于整个测量范围 θ 使用选定的 Φ 和 Δ 值计算角度Ψ.
      4. 将模拟过程中计算得到的强度进行比较（均归一化至最大值）
      5. 计算 ）与标准化强度的
      6. 计算 和 （两者均归一化至最大值） 在皮秒级二次压电响应力显微术（ps-2PFM）测量过程中测得。
         注意：在本实验中，使用 Python 的 NumPy 库中的“corrcoef”函数计算皮尔逊积矩相关系数。
   3. 最后，选择 Φ 和 Δ 的值Ψ 得到最高的相关系数，以及模拟强度与实测信号之间的最佳收敛性，类似于图中所示结果 图8.

结果

本方案详细介绍了用于ps-2PFM测试的淀粉样超结构制备步骤、显微系统的搭建以及合适样品的测量方法。然而，在进行最终测量之前，必须使用各向同性参考样品对APD进行正确校准，以确保两个探测器上收集到的信号在形状和强度上均对称（图4C）。即使X轴和Y轴探测器测得的信号强度存在微小差异，也应在后续测量尤其是数据分析过程中作为校正因子予以考虑。样品安装后，若其中含有单个球晶，在偏光显微镜（POM）下呈现如图2B所示的典型马耳他十字图案，再进行2PFM光栅扫描后，所得图像应与图5A所示结果相似，这与已报道的球晶2PFM光栅扫描图像^6,7以及其它有序生物分子的扫描结果一致^11,12。可以观察到最亮轴的位置可能发生一定变化，这是由于荧光信号强...

讨论

偏振敏感双光子显微镜是研究淀粉样超结构内部纤维局部有序性的有力工具，仅需对标准多光子系统进行少量改造即可实现。由于该技术基于非线性光学现象，与单光子激发荧光显微技术相比，可实现更弱的角度光选择效应和更高的轴向分辨率。此外，与单光子激发荧光显微技术相比，该方法还具有光散射更少、光毒性更低以及样品穿透深度更大的优势^19,20。正如我们此前已证实的，该技术非常适合对蛋白质致密聚集物（如球晶）进行测量，且可实现无标记检测²¹。

然而，为了有效使用此处所述的方法，需注意几个关键问题。首先从样品制备及其质量开始，即孵育过程，必须确保淀粉样超结构已正确生长。对于球晶，我们使用配备交叉偏振器的偏光光学显微镜来定位成熟的球晶，这些球晶呈现出特征性的马耳他十字图案，半径约为 ~5 µm¹⁶。然而，球晶具有异质性，样品内部可观察到不同的结构。因此，选择分离且未变形的个体至关重要。至于测量系统本...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
样品制备
盖玻片，24 × 24 mm	Chemland	04-298.202.04
组织学用DPX封片剂	Sigma-Aldrich	6522	载玻片封片剂
Eppendorf Safe-Lock离心管，1.5 mL，聚丙烯材质	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		用于球晶孵育
HLP 5UV 水纯化系统	Hydrolab		样品制备中所用去离子水的来源
盐酸（≥37%，APHA ≤10）	Sigma-Aldrich	30721-M
牛胰腺来源胰岛素粉末（≥25 单位/mg（HPLC））	Sigma-Aldrich	I5500
甲醇（HPLC级）	Sigma-Aldrich	270474
凹面载玻片，76 × 26 × 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		图2中使用的偏光光学显微镜
PTFE螺纹密封带，12 mm × 12 mm × 0.1 mm，60 g/m2	Chemland	VIT131097
显微镜ps-2PFM系统配置
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm 长通滤光片	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm 短通滤光片	Thorlabs
IDQ100 光子计数雪崩光电二极管	ID Quantique
多光子短通发射滤光片 720 nm	Semrock
安装式消色差半波片，690–1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo 油浸物镜 100×/1.4 NA	Nikon
压电三维载物台	Piezosystem Jena
偏振分束器	Thorlabs
S130C - 超薄光电二极管功率传感器，Si，400–1100 nm，500 mW	Thorlabs
软件
LabView 2018	National Instruments		版本 18.0.1f2
Matplotlib 库			版本 3.3.2
NumPy 库			版本 1.19.2
SciPy 库			版本 1.5.2
Spyder Python 3 集成开发环境			版本 4.1.5