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一种用于维持和分化人诱导性多能干细胞的自动化培养系统

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DOI：

10.3791/65672

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2024年1月26日

 ,  , 
1Innovative Regenerative Medicine, Kansai Medical University Graduate School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种自动化细胞培养系统的操作方案。该自动化培养系统可减少人工操作，便于用户使用，尤其有助于不熟悉诱导性多能干细胞（iPS细胞）操作的研究人员，实现从iPS细胞的维持培养到向多种细胞类型分化的全过程。

摘要

具有无限自我增殖能力的人诱导多能干细胞（hiPSCs）有望广泛应用于多个领域，包括阐明罕见疾病的病理机制、新药开发以及旨在修复受损器官的再生医学。然而，hiPSCs 的社会性应用目前仍受到限制，部分原因在于即使具备先进的知识和精湛的技术，由于 iPSCs 对微小环境变化高度敏感，体外培养中的分化过程仍难以重复。采用自动化培养系统可解决这一问题。通过在不同研究机构间共享标准化操作流程，有望实现不依赖研究人员技术水平的高重复性实验。尽管此前已开发出若干能够维持 iPSC 培养并诱导其分化的自动化系统，但这些系统因采用仿人多关节机械臂而普遍存在体积大、重量重且成本高的缺点。为改进上述问题，我们开发了一种新型系统，采用简化的 x-y-z 轴滑轨结构，使系统更加紧凑、轻便且成本更低。此外，用户可轻松修改该新系统的参数，以开发新的操作任务。一旦任务建立，用户仅需准备 iPSC，预先提供所需试剂和耗材，选择任务编号并设定时间即可。我们已证实，该系统可在无饲养层细胞的条件下，通过多次传代维持 iPSC 的未分化状态，并可将其分化为多种细胞类型，包括心肌细胞、肝细胞、神经前体细胞和角质形成细胞。该系统将有助于在不同机构间实现高度可重复的实验，无需依赖技术熟练的研究人员，同时通过降低准入门槛，推动 hiPSCs 在更广泛科研领域的实际应用。

引言

本文旨在提供我们与公司合作研制的人诱导多能干细胞（iPSC）自动化培养系统的实际、详细操作流程，并展示代表性实验结果。

自2007年该文章发表以来，诱导多能干细胞（iPSC）已在全球范围内受到广泛关注1。由于其最显著的特性是能够分化为任何类型的体细胞，因此有望应用于再生医学、阐明难治性疾病病因以及新药开发等多个领域2,3。此外，使用人源iPSC分化而来的体细胞有望减少受到严格伦理限制的动物实验。尽管iPSC相关研究不断需要大量均一的iPSC，但其培养管理极为耗时费力。此外，由于iPSC对培养条件和环境变化极为敏感，操作难度较大。

为了解决这一问题，人们期望自动化培养系统能够替代人工完成相关操作。一些研究团队已开发出若干用于人多能干细胞培养与分化过程的自动化系统，并发表了其研究成果4,5,6。这些系统配备了多关节机械臂。机械臂不仅具有高度模拟人类手臂动作的优点，也存在明显不足，例如机械臂本身成本较高、系统整体包装更大更重，且工程师需要耗费大量时间进行调试和训练，才能实现预期的运动控制7,8。为了在经济性、空间占用和人力资源消耗等方面更便于将该设备推广至更多研究机构，我们开发了一种新型的自动化培养系统，可用于诱导多能干细胞（iPSC）的维持及其向多种细胞类型的分化9。

我们设计新系统的基本思路是采用X-Y-Z轴导轨系统，而非多关节机械臂9。为了替代机械臂复杂的类手部功能，我们在此系统中引入了一种新理念，即能够自动更换三种特定功能的机械臂末端。此外，本文还说明了用户如何通过软件中的简单指令轻松制定任务计划，整个过程无需工程师参与。

其中一种机器人培养系统已证明可利用96孔板形成类胚体，作为三维细胞聚集体用于分化4。本文报道的系统无法处理96孔板。已有研究利用细胞系实现了现行药品生产质量管理规范（cGMP）级别，但所用细胞并非人类多能干细胞5。本文详述的自动培养系统目前的开发目标是辅助实验室实验（图1）。然而，该系统具备足够的防护能力，可维持相当于四级安全柜的洁净水平。

方案

关西医科大学伦理委员会批准了名为KMUR001的健康志愿者来源诱导多能干细胞的建立与使用（批准号：2020197）。供者通过公开招募获得，已签署正式知情同意书，并同意细胞用于科学研究。

注意：当前界面（在 Windows XP 操作系统下运行的名为 "ccssHMI" 的专用软件）是基本操作界面。在上述界面中，排列有一系列选项卡，允许用户启动各种操作。

1. 加载操作

  1. 点击软件顶部屏幕上的Loading按钮，然后点击Loading Preparation Start按钮。
  2. 将要放入仪器中的培养皿或板放置于仪器内的指定位置。
    注意：应在每个皿盖上标注必要的识别信息。
  3. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械安全确认按钮。
  4. 在软件中选择培养皿或板的类型和数量。
  5. 点击Loading Preparation Completed按钮，然后点击Loading Start按钮。
  6. 当一个培养皿被上传至系统后，在软件中选择该培养皿的相关信息，例如with iPS cells或without iPS cells，并在软件中登记每个培养皿的备注信息。
  7. 最后点击Registration按钮，完成装载操作。

2. 卸载操作

  1. 点击软件主界面上的 卸载 按钮。在软件中选择要移除的培养皿。
  2. 选择培养皿后，点击 开始卸载准备 按钮，然后点击 开始卸载 按钮。
  3. 当培养皿从培养箱转移至系统的工作台后，按下 取出培养皿 按钮。
  4. 手动打开前方滑动窗口，取出培养皿，然后手动关闭滑动窗口，并按下机械安全确认按钮。

3. 耗材补充：移液器、管子和培养基

  1. 如需补充移液器、试管和培养基等耗材，请点击软件顶部屏幕上的 耗材 按钮，然后选择需要补充的物品。
    1. 移液器
      1. 点击 移液器 按钮，选择 补充 按钮。
      2. 在软件中选择用户希望补充的架子，点击 开始补充 按钮。
      3. 确认工作台上的移液器存储区域盖子已打开后，手动打开前方滑动窗口，并根据需要补充移液器。
      4. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械式安全确认按钮，点击 补充完成 按钮。
      5. 点击 补充设置 按钮，输入补充信息，然后点击 注册 按钮。
      6. 点击 补充完成 按钮。
    2. 试管
      1. 点击 试管 按钮，选择 补充 按钮。
      2. 在软件中选择用户希望补充的架子，点击 开始补充 按钮。
      3. 确认架子已升至顶部后，点击 补充试管 按钮。
      4. 手动打开前方滑动窗口，并根据需要补充试管。
      5. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械式安全确认按钮。
      6. 点击 补充完成 按钮。
      7. 点击 补充设置 按钮，输入补充信息，然后点击 注册 按钮，再点击 关闭 按钮。
    3. 培养基
      1. 点击 培养基 按钮，在软件中选择 补充 按钮。
      2. 从三个架子中选择用户希望补充的一个，点击 开始补充 按钮。
      3. 确认培养基存储区域的盖子已打开后，手动打开前方滑动窗口，并补充培养基。
      4. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械式安全确认按钮。
      5. 点击 补充完成 按钮。
      6. 点击 补充 按钮，输入培养基的相关信息，包括培养基名称和数量，必要时可添加备注。
      7. 点击 注册 按钮。
      8. 点击 关闭 按钮。

4. 任务选择

  1. 单击软件顶部屏幕上的 任务 按钮。
  2. 选择 任务设置 按钮。从任务列表中选择所需任务，然后单击 下一步 按钮。
  3. 指定执行任务的日期和时间，然后单击 注册 按钮。选择要执行任务的培养皿或板，然后再次单击 注册 按钮。
  4. 重新确认所选任务后，单击 注册 按钮。在下一个屏幕上确认任务已成功注册。
  5. 如有必要，以相同方式设置下一个任务。
  6. 最后单击 开始 按钮。随后，任务将在指定的日期和时间自动启动。
    注意：每次任务完成后，罩子两侧的紫外灯会自动开启，并根据辅助设置持续照射 5–30 分钟后关闭，以维持罩内无菌状态。如需中止此过程，用户可单击 开始 按钮。
  7. 如果用户希望提前取消已安排的任务，请单击 停止 按钮。
  8. 选择要中止的任务后，单击 编辑任务 按钮。
  9. 单击 任务取消 按钮。在下一个屏幕上确认任务已被删除。

5. 检查细胞图片

  1. 每项任务均包括任务操作前后的显微观察（拍照）。通过在每项任务之前或之后加入显微摄影步骤，以摄影方式记录细胞培养的进展。
  2. 选择预设的任务程序，包括预先选定培养皿或孔板中的多个特定位置，进行定点观察，以随时间推移监测同一位置。

6. 传代与分化

  1. 按照第1至第5节中的步骤操作，并设置自动细胞培养系统以进行传代和分化。传代、心肌细胞分化、肝细胞分化、神经前体细胞分化和角质形成细胞分化的仪器设置分别见表1、表2、表3、表4和表5。

结果

人诱导性多能干细胞的维持
我们使用了三种人多能干细胞系（RIKEN-2F、253G1 和 KMUR001）。我们通过每日人工操作实验优化了细胞维持方案，并进一步通过系统完成的七次预实验对具体程序进行了优化。例如，人工操作与系统操作中不同移液器喷出液体流速所产生的剪切力存在显著差异；因此，我们针对系统操作优化了酶消化的时间长度以及细胞分散所需的移液次数。

将人诱导性多能干细胞维持在经浓度为 0.5 µg/cm2 的细胞培养基质包被的 10 cm 培养皿中，使用 hiPSC 培养基（例如 Neutristem 或 StemFit AK02N）。传代时，系统程序设定为先用不含钙离子的磷酸盐缓冲液（PBS[-]）洗涤 hiPSC 三次，每次 5 mL；随后加入 3 mL 含 10 µM Rho 激酶抑制剂（Y-27632）的 TrypLE express 酶溶液，在 37 °C 下处理 15 分钟。之后，系统向培养皿中加入 9 mL 含 0.15% 牛血清白蛋白 V 型组分（BSA）的 PBS(-) 溶液，并执行两组操作动作：吸取 10 mL 含细胞液体，将移液管尖端在倾斜 20° 靠近培养皿表面的一侧以之字形轨迹释放液体，重复上述操作序列时将培养皿反向倾斜 20°。随后，系统将含细胞的培养基收集至 15 mL 离心管中并盖上管盖，以 115 × g 离心 5 分钟以沉淀细胞。接着，系统吸除上清液，并用含 10 µM Y-27632 的 10 mL 培养基通过吹打 10 次将细胞沉淀重悬为单细胞悬液。系统将 1 mL 台盼蓝溶液转移至新的 15 mL 离心管中，再加入 1 mL 细胞悬液，并通过吹打 5 次混匀。之后，吸取 100 µL 经台盼蓝染色的细胞溶液，注入一次性血细胞计数板（置于计数板架中）的加样口。系统将血细胞计数板架移至显微观察区域，拍摄图像并立即由软件分析，所得细胞浓度用于后续步骤。在 iPSC 维持培养中，系统将细胞以 15,000 个细胞/cm2 的密度接种于新的直径 10 cm 的塑料培养皿中，该培养皿预先包被了 0.5 µg/cm2 的细胞培养基质。在分化实验中，系统将细胞以所需密度接种于已用细胞培养基质按 1:100 稀释后包被的 6 孔板中，并使用针对各类体细胞类型配制的培养基。最后，系统在将培养板转移至培养箱前执行五次交叉锁定操作。将三个含 iPSC 的新 10 cm 培养皿和三个预先包被细胞培养基质的培养皿装入系统，并根据上述相应步骤准备其他必要耗材。一个维持培养周期包括第 1 天进行一次传代操作，随后连续 3 天每天更换一次培养基。在整个实验过程中，共设置五个这样的培养周期。此外，耗材按顺序依次补充。

根据预定的时间表，系统已按计划成功完成了五次传代培养。通过系统在每次操作期间自动拍摄的细胞照片，确认细胞随时间推移持续稳定增殖。细胞扩增结果（n = 3）已计算并展示于图2中。为确认诱导多能干细胞（iPSCs）在自动化培养系统中经历多次传代培养后仍能维持未分化状态，利用每次传代后剩余的样本进行了免疫细胞化学分析（Oct3/4 和 SSEA4）（图3A）。此外，在完成五次传代后，将三皿细胞从系统中取出，并进一步进行了免疫组织化学分析（Oct3/4、SSEA4 和 Tra1-81）（图3B）。两种基于荧光免疫染色的分析结果均表明，iPS细胞的未分化状态得以保持。同时，在自动化培养系统进行传代培养前后，也对iPSCs进行了核型分析。尽管在开始传代培养前已发现17号染色体的一个等位基因存在异常，但在经历五次传代培养后，系统未观察到除该异常以外的其他明显变化（图3C）。iPSCs传代培养所使用的参数设置总结于表1中。

分化
心肌细胞
此处采用先前发表文献中的分化方案10。将未分化的hiPSCs（KMUR001）以30,000个细胞/cm2的密度接种于包被细胞培养基质的6孔板中，使用添加了10 µM Y-27632的hiPSC培养基进行培养。3天后（分化第1天），更换为含6 µM GSK-3ß抑制剂CHIR-99021、20 ng/mL Activin A和10 ng/mL BMP4的人多能干细胞培养基。分化第3天，更换为CDM3培养基：RPMI 1640、500 µg/mL重组人血清白蛋白和213 µg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸，并添加2 µM Wnt-C59。分化第5天更换为新鲜CDM3培养基；此后每隔一天更换一次新鲜CDM3培养基。iPSCs向心肌细胞分化的实验条件总结于表2中。

肝细胞
此处遵循了先前发表文献中的分化方案11。将未分化的hiPSCs（RIKEN2F）以25,000个细胞/cm2的密度接种于包被细胞培养基质的6孔板中，使用添加了10 µM Y-27632的hiPSC培养基进行培养。2天后（分化第1天），更换为含100 ng/mL Activin A、6 µM CHIR-99021和1%谷氨酰胺补充剂（如GlutaMAX）的RPMI-1640培养基加2% B27无胰岛素（RPMI-B27），培养24小时。在分化第2天，更换为含50 ng/mL Activin A的RPMI-B27培养基。在分化第5天，更换为含1%谷氨酰胺补充剂和10 ng/mL BMP-4的RPMI-B27培养基。在分化第9天，更换为肝细胞成熟培养基：Leibovitz's L-15培养基，含有8.3%胰蛋白胨磷酸盐肉汤、10 µM氢化可的松-21-半琥珀酸酯、50 µg/mL L-抗坏血酸钠、100 nM地塞米松、0.58%胰岛素-转铁蛋白-硒、2 mM谷氨酰胺补充剂、8.3%胎牛血清和100 nM rac-1,2-二十六烷基甘油。此后，每隔一天更换一次新鲜培养基。iPSCs肝细胞分化的实验条件总结于表3中。

神经前体细胞
此处遵循先前发表文献中的分化方案12。将未分化的hiPSCs（RIKEN2F）以25,000个细胞/cm2的密度接种于基底膜基质包被的6孔板中，培养基为DMEM/F12与神经基础培养基（1:1）的混合液，添加10% Knockout血清替代物、0.1 mM非必需氨基酸、1 mM谷氨酰胺补充剂、10 µM TGF-β受体抑制剂（SB431542）、10 µM BMP信号抑制剂（dorsomorphin）以及10 µM Y-27632（分化第1天）。在分化第5天，更换培养基为DMEM/F12与Neurobasal培养基（1:1）混合液，添加0.1 mM非必需氨基酸、1 mM谷氨酰胺补充剂、1% N-2补充剂、1% B-27补充剂、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸、10 µM SB431542和10 µM dorsomorphin。在分化第9天，更换培养基为DMEM/F12与神经基础培养基（1:1）混合液，添加0.1 mM非必需氨基酸、1 mM谷氨酰胺补充剂、1% N-2补充剂、1% B-27补充剂、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸以及1 µM全反式维甲酸。在分化第13至16天，每天更换培养基，使用DMEM/F12与神经基础培养基（1:1）混合液，添加0.1 mM非必需氨基酸、1 mM谷氨酰胺补充剂、1% N-2补充剂、1% B-27补充剂、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸以及10 ng/mL bFGF和10 ng/mL EGF。iPSCs向神经前体细胞分化的实验条件总结于表4中。

角质形成细胞
此处采用先前发表文献中的分化方案13。将未分化的hiPSCs（253G1）以15,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养基质包被的6孔板中，使用含10 µM Y-27632的hiPSC培养基进行培养。接种2天后（分化第1天），更换为DMEM/F12与Neurobasal培养基（1:1）混合液，其中添加0.1 mM非必需氨基酸、1 mM谷氨酰胺、55 µM 2-巯基乙醇、1% N-2补充剂、2% B-27补充剂、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸、0.05%牛血清白蛋白和100 ng/mL碱性FGF。从分化第3天开始，此后每2天更换一次培养基，使用人角质形成细胞培养基（第3天不加补充剂，第5天及之后添加补充剂），并额外加入0.5 µg/mL氢化可的松、1 µM全反式维甲酸、25 ng/mL hBMP-4、2.4 µg/mL腺嘌呤、1.37 ng/mL三碘甲腺原氨酸、0.3 mM抗坏血酸-2-磷酸和2 µM佛司可林。iPSCs向角质形成细胞分化的实验条件总结于表5中。

如上所述，整个过程从iPS细胞接种到后续一系列分化方案均仅使用自动化培养设备完成。对每种细胞特征性标志物的表达进行了评估（图4）。结果表明，仅通过自动化培养系统即可成功诱导分化。

实验室自动化系统和设备；用于研究分析的细胞培养设置和示意图。
图1：自动化培养系统的概述。（A）系统照片，显示其尺寸和布局示意图1。（B）工作台照片及布局示意图2。（C）手动工具：培养皿、试管和移液器。本图已根据Bando等人的许可进行了修改9。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞培养方案示意图、生长曲线、显微镜图像；随时间变化的细胞扩增分析。
图 2：传代操作与细胞生长。（A）方框展示了各个步骤。（B）基于三次独立实验中每次自动细胞计数结果计算得到的iPSC扩增情况。（C）从一次传代到下一次传代过程中自动捕获的代表性图像。比例尺 = 400 µm 和 100 µm（插图）。本图经Bando等9许可修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

干细胞表征结果的流式细胞术、免疫荧光和核型分析。
图3：iPSC的自动化长期维持。（A）Oct-3/4和SSEA-4三次独立实验的全部免疫细胞化学分析结果。每个蓝色直方图表示无一抗的对照组，每个红色直方图代表相应抗原特异性信号。（B）Oct-3/4、SSEA-4和Tra 1-81免疫组织化学染色细胞的代表性图像。比例尺 = 50 µm。（C）RIKEN2F-iPSC在第五次传代后的核型。本图已获Bando等9许可修改。请点击此处查看此图的放大版本。

各种细胞类型的细胞分化；免疫荧光显微镜显示蛋白质标志物。
图4：免疫组织化学染色。 肝细胞（比例尺 = 100 µm）、心肌细胞（比例尺 = 100 µm）、神经前体细胞（比例尺 = 100 µm）和角质形成细胞（比例尺 = 200 µm）的免疫组织化学图像。本图经Bando等9许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

表1：传代培养物制备及系统设置。 请点击此处下载该表格。

表2：心肌细胞分化制备及系统设置。 请点击此处下载该表格。

表3：肝细胞分化制备及系统设置。 请点击此处下载该表格。

表4：神经前体细胞分化制备及系统设置。 请点击此处下载该表格。

表5：角质形成细胞分化制备及系统设置。 请点击此处下载该表格。

讨论

该方案中的一个关键步骤是，如果用户发现任何错误，可随时点击取消、停止或重置按钮，并从第一步重新开始。该软件能够避免人为错误，包括重复预约、系统任务运行期间打开舱门以及未及时补充耗材等。另一个成功且高效地分化为所需体细胞的关键因素是正确选择多能干细胞系，因为每种多能干细胞在分化特性上均存在不可控的偏向性14,15。

这种用于诱导多能干细胞的自动化培养系统可维持细胞生长并将其分化为多种体细胞类型。该系统的尺寸为200 cm（宽）、110 cm（深）和233 cm（高），总重量为1.2吨。设备内置的培养箱可同时容纳三十六个10 cm培养皿和九块多孔板。

相较于先前的模型，本系统的改进之处主要有两点：第一，作为操作臂，X-Y-Z轴导轨系统由原有的6轴关节臂全新改造而成，通过更换机械臂末端工具，可分别用于培养皿、试管和移液器三种不同部件的操作。该机械臂悬挂于系统顶部，并沿X-Y-Z轴方向移动。第二，引入了细胞计数系统，用于从传代开始连续进行的无饲养层维持培养及分化诱导实验。将单细胞悬液与台盼蓝溶液混合后，转移至一次性血细胞计数板，进行显微观察和成像。软件可自动分析所获得的图像，计算活细胞数量，并确定接种所需细胞数量时对应的悬液体积。该图像分析法所得细胞计数结果的准确性与人工计数一致。

X-Y-Z轴导轨系统被用于处理各项任务，其速度较上一版本（多轴关节臂）更快。通过该自动化培养系统，在16天内完成了五次连续传代，诱导多能干细胞（iPSCs）扩增了625 ± 93倍。尽管在无饲养层细胞条件下维持细胞培养的耐受时间验证短于我们此前使用饲养层细胞的实验结果，但与之前的实验相比，细胞扩增效率更高6。缩短的操作时间似乎有助于防止操作过程中因干燥而导致的细胞损伤。

此外，无需人工干预，即可在维持培养的基础上自动完成向心肌细胞、肝细胞、神经前体细胞和角质形成细胞的分化操作。经过一系列上述流程后，通过荧光免疫染色证实，仅在自动化培养系统中获得的细胞已成功分化为目标细胞。因此，通过共享任务程序并使用该系统，即使不熟悉iPS细胞操作的研究人员也能为其自身研究获取由iPSC诱导而来的体细胞。此外，该系统可最大限度地消除不同研究人员或实验设施之间在实验可重复性方面的差异，并确保每次都能获得质量均一的细胞。

通过采用新的导轨系统，设备体积得以缩小，重量减轻至1.2吨，比之前减轻约200公斤。此外，零部件和程序设置成本可降低约10,000美元。维护和编程成本预计下降13%。为了鼓励更多研究人员更便捷地进入诱导多能干细胞（iPS细胞）相关研究领域，保持设备成本低廉也至关重要6。我们希望当前及下一代自动培养系统能够为提供质量更加均一的诱导多能干细胞及其分化细胞作出贡献。

该系统的主要局限性在于冰箱用于临时储存培养物的容量有限，以及处理少量液体（<100 µL）的能力较弱。此外，由于缺乏先进的人工智能技术，无法根据细胞的实时状态进行自动优化。次要局限性是需要使用系统制造商提供的特殊移液器吸头4,5。我们正在开发下一代培养系统，该系统将能够处理用于培养基制备的少量液体，并配备基于高性能人工智能（系统学习）的反馈优化系统。我们的合作制造商9具备足够的专业知识，可根据用户的特殊需求定制系统。除此之外，功能更通用、更广泛的下一代系统也将很快上市。我们还在考虑采用基于订阅的租赁模式，以向所有用户提供最新的系统。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本大阪市松下生产工程有限公司新业务促进中心提供的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.15% 牛血清白蛋白 V 组分Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm 塑料培养皿 Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN 生物资源研究中心HPS0002
2-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985023
肌动蛋白结合蛋白α  小鼠Abcamab9465
激活素 A Nacali Tesque18585-81
腺嘌呤Thermo Fisher ScientificA14906.30
白蛋白  兔DakoA0001
全反式维甲酸Fuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
自动化培养系统Panasonic
B-27 添加剂Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
牛血清白蛋白Merck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
定义型角质形成细胞-SFMThermo Fisher Scientific10744019人角质形成细胞培养基
地塞米松Merck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-二十六烷基甘油
一次性血细胞计数板CountessTM 细胞计数室载片, Thermo Fisher ScientificC10228
背侧形态发生素抑制剂（Dorsomorphin）Thermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001人多能干细胞培养基
胎牛血清 Biowest, FL, United StatesS140T
碱性成纤维细胞生长因子 Nacalai Tesque Inc.19155-07
福斯科林Thermo Fisher ScientificJ63292.MF
谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030081谷氨酰胺添加剂
山羊 IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  山羊Santacruz6556
氢化可的松Thermo Fisher ScientificA16292.06
氢化可的松 21-半琥珀酸酯MerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021细胞培养基质
胰岛素-转铁蛋白-硒Thermo Fisher Scientific41400045
角蛋白 1  小鼠Santacruz376224
角蛋白 10  兔BioLegend19054
KMUR001关西医科大学 患者来源的诱导多能干细胞 
Knockout 血清替代物Thermo Fisher Scientific10828010
L-抗坏血酸-2-磷酸 A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 培养基 Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
小鼠 IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 添加剂Thermo Fisher Scientific17502048
Nestin 小鼠Santacruz23927
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103049
神经丝蛋白  兔ChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1A细胞培养基 
Oct 3/4  小鼠BD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
兔 IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
兔 IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
重组人白蛋白 A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho 激酶抑制剂, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN 生物资源研究中心HPS0014未分化人诱导多能干细胞 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
抗坏血酸钠MerckA4034-100G
SSEA-4  小鼠MilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02细胞培养基 
肌钙蛋白 T 兔Abcamab92546
TRA 1-81 小鼠MilliporeMAB4381
三碘甲腺原氨酸Thermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM 表达酶 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
台盼蓝溶液 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
胰蛋白胨磷酸盐肉汤MerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-1 微管蛋白  小鼠PromegaG712A

参考文献

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
  3. Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
  4. Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
  5. Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
  6. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647(2015).
  7. McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
  8. Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41(2017).
  9. Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).
  10. Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  11. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  12. Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
  14. International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  15. Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).

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