用于维持和分化人诱导的多能干细胞的自动化培养系统
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Summary
在这里，我们提出了一种自动化细胞培养系统的方案。这种自动化培养系统减少了劳动力，使用户受益，包括不熟悉处理诱导多能干细胞（iPS）细胞的研究人员，从iPS细胞的维持到分化为各种类型的细胞。
Abstract
具有无限自我增殖能力的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）有望在众多领域得到应用，包括阐明罕见病病理学、开发新药以及旨在恢复受损器官的再生医学。尽管如此，hiPSCs的社会实施仍然有限。这在一定程度上是因为iPSCs对微小环境变化的高度敏感性，即使拥有先进的知识和复杂的技术技能，也难以在培养物中复制分化。自动化培养系统的应用可以解决这个问题。根据不同研究所的共享程序，可以预期具有独立于研究人员技能的高可重复性的实验。尽管之前已经开发了几种可以维持 iPSC 培养物和诱导分化的自动化培养系统，但这些系统笨重、大且成本高昂，因为它们使用了人源化、多关节的机械臂。为了改善上述问题，我们开发了一种使用简单的 x-y-z 轴滑轨系统的新系统，使其更紧凑、更轻、更便宜。此外，用户可以轻松修改新系统中的参数以开发新的处理任务。一旦建立了任务，用户需要做的就是准备iPSC，提前提供所需任务所需的试剂和耗材，选择任务编号，并指定时间。我们证实，该系统可以在没有饲养细胞的情况下通过多次传代将 iPSC 维持在未分化状态，并分化为各种细胞类型，包括心肌细胞、肝细胞、神经祖细胞和角质形成细胞。该系统将实现跨机构高度可重复的实验，而无需熟练的研究人员，并将通过减少新条目的障碍，促进hiPSCs在更广泛的研究领域的社会实施。
Introduction
本文旨在为我们与一家公司合作生产的人诱导多能干细胞（iPSC）的自动化培养系统提供实际和详细的处理程序，并展示具有代表性的结果。
自2007年文章发表以来，iPSC一直受到全世界的关注1。由于其最大的特点是能够分化成任何类型的体细胞，因此有望应用于再生医学、阐明疑难杂症的病因和开发新的治疗药物等各个领域2,3。此外，使用人类iPSC衍生的体细胞可以减少动物实验，这些实验受到重大的伦理限制。尽管不断需要大量同质的 iPSC 来研究 iPSC 的新方法，但管理它们太费力了。此外，由于iPSC的敏感性很高，因此处理iPSC很困难，即使对细微的文化和环境变化也是如此。
为了解决这个问题，自动化培养系统应该代替人类执行任务。一些研究小组已经开发了一些用于细胞维持和分化的自动化人类多能干细胞培养系统，并发表了他们的成就4,5,6。这些系统配备了多关节机械臂。机械臂不仅具有高度模仿人类手臂运动的优点，而且缺点在于它们需要更高的手臂成本、更大更重的系统包装以及工程师为获得目标运动而耗时的教育工作 7,8。为了在经济、空间和人力资源消耗方面更容易将该设备引入更多的研究机构，我们开发了一种新型自动化培养系统，用于维持 iPSC 并将其分化为各种细胞类型9。
我们采用新系统的理由是采用 X-Y-Z 轴导轨系统，而不是多关节机械臂9。为了取代机械臂复杂的手部功能，我们在这个系统中应用了一个新思路，它可以自动改变三种类型的特定功能臂尖。在这里，我们还指出了用户如何通过软件上的简单订单轻松制定任务计划，因为在整个过程中对工程师的贡献缺乏要求。
其中一个机器人培养系统已经证明了使用 96 孔板作为 3D 细胞聚集体进行分化4 来制造胚状体。此处报告的系统无法处理 96 孔板。其中一种使用细胞系达到了当前的良好生产规范（cGMP）等级，尽管它不是人类多能干细胞5。这里详细介绍的自动化培养系统现在已经开发出来，其具体目的是帮助实验室实验（图1）。但是，它有足够的系统来保持相当于 IV 级安全柜的清洁水平。
Protocol
关西医科大学伦理委员会批准了名为KMUR001的健康志愿者来源的iPSCs的产生和使用（批准号2020197）。公开招募的捐赠者提供了正式的知情同意书，并同意细胞的科学使用。 注意:当前界面（在Windows XP操作系统下运行的名为”ccssHMI”的特殊软件）是基本操作屏幕。在上述界面下，排列了一系列选项卡，允许用户启动各种操作。 1. 装载操作 点击 加载 软件顶部屏幕上的 按钮 。单击 “加载准备开始” 按钮。 将要输入设备的盘子或盘子放在设备中的位置。注意: 每个盖子上都应写有识别盘子的必要信息。 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。 在软件中选择盘子或盘子的类型和数量。 单击 “加载准备完成 “按钮。单击 “加载开始 “按钮。 将培养皿上传到系统后，在软件上选择皿上的信息，例如 有 iPS 细胞 或 不使用 iPS 细胞的信息。在软件中注册有关每道菜的注释。 点击最后的 注册 按钮，完成加载操作。 2.卸料操作 单击软件顶部屏幕上的 “卸载 “按钮。在软件中选择要删除的盘子。 选择菜肴后，单击卸 载准备开始 按钮。单击” 卸载开始” 按钮。 将培养皿从培养箱转移到系统中的工作台后，按下 培养皿移除 按钮。 手动打开前滑动窗并取出盘子。手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。 3.耗材的补充:移液器、试管和培养基 要补充移液器、试管和培养基等耗材，请单击软件顶部屏幕上的 “耗材 “按钮，然后选择要补充的项目。移液器单击 移液器 按钮。选择” 补充 “按钮。 选择用户要在软件上补充的机架。单击” 补充开始 “按钮。 确认工作台上移液器存放区域的盖子打开后，手动打开前滑动窗口并根据需要补充移液器。 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。单击” 补充已完成 “按钮。 单击” 补货设置 “按钮并输入补货信息，然后单击 “注册 “按钮。 单击” 补充已完成 “按钮。 管单击 “管 “按钮。选择” 补充 “按钮。 选择用户要在软件上补充的机架。单击” 补充开始 “按钮。 确认机架已移动到顶部后，单击” 补充管 “按钮。 手动打开前滑动窗并根据需要补充管子。 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。 单击” 补充已完成 “按钮。 单击” 补货设置 “按钮并输入补货信息，然后单击 “注册 “按钮。单击 “关闭 “按钮。 中等单击 “中” 按钮。选择软件中的 “补充 “按钮。 从用户要补货的三个机架中选择一个机架。单击” 补充开始 “按钮。 确认介质存储区的盖子已打开后，手动打开前滑动窗口并补充介质。 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。 单击” 补充已完成 “按钮。 单击” 补充 “按钮，然后输入介质的信息，包括介质的名称和数量。如有必要，请输入其他注释。 单击 “注册 “按钮。 单击 “关闭 “按钮。 4. 任务选择 单击软件顶部屏幕上 的”任务 “按钮。 选择 “任务设置 “按钮。从任务列表中选择所需的任务，然后单击” 下一步 “按钮。 指定执行任务的日期和时间，然后单击 “注册 “按钮。选择要执行任务的盘子或盘子，然后单击 “注册 “按钮。 重新确认所选任务后，单击 “注册 “按钮。确认任务已在下一个屏幕上注册。 如有必要，请以相同的方式设置下一个任务。 单击末尾的 “开始” 按钮。然后，任务将在指定的日期和时间自动启动。注意: 完成每项任务后，紫外线灯（位于抽油烟机两侧）立即自动打开，5-30 分钟后，根据辅助设置，它们关闭以保持抽油烟机处于无菌状态。若要停止，用户可以单击 “开始 “按钮。 如果用户想要提前取消计划任务，请单击” 停止 “按钮。 选择要中止的任务后，单击” 编辑任务 “按钮。 单击 “任务取消 “按钮。在下一个屏幕上确认任务已被删除。 5.检查细胞图片 每个任务都包括任务工作前后的显微观察（拍照）。通过在每项任务之前或之后结合显微摄影任务，以摄影方式观察细胞培养的进展。 选择预设的任务程序，包括提前选择培养皿或孔板的多个特定位置进行定点观察，以监测同一位置随时间的变化。 6. 传代和分化 按照第 1-5 节中的步骤操作，设置自动细胞培养系统以执行传代和分化。传代、心肌细胞分化、肝细胞分化、神经前体细胞分化和角质形成细胞分化的仪器设置分别如 表1、表2、表3、表4和 表5所示。
Representative Results
维持人诱导的多能干细胞我们使用了三种hPSC细胞系（RIKEN-2F、253G1和KMUR001）。我们通过每天的手动实验优化了维护方案，并通过系统进行的七次初步实验进一步优化了详细程序。例如，由人类和系统处理的不同移液器的唾液流速引起的剪切应力是完全不同的;因此，我们优化了酶消化的时间长度和系统细胞分散的移液次数。 将人诱导的多能干细胞维持在涂有 0.5…
Discussion
协议中的一个关键步骤是，如果用户发现任何故障，请随时单击取消、停止或重置按钮，然后从第一步重新开始。该软件可以避免人为错误，包括重复预订、在系统任务处于活动状态时开门以及缺乏补货。成功和有效分化为所需体细胞的另一个关键点是正确选择多能干细胞系，因为每个多能干细胞在其分化特性中都具有不可控的偏差14,15。
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了日本大阪松下生产工程有限公司新业务促进中心的资助。
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
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Cite This Article
Bando, K., Yamashita, H., Hattori, F. An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (203), e65672, doi:10.3791/65672 (2024).