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方法文章

一种用于维持和分化人诱导性多能干细胞的自动化培养系统

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DOI：

10.3791/65672

⸱

2024年1月26日

 ,  , 
1Innovative Regenerative Medicine, Kansai Medical University Graduate School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种自动化细胞培养系统的操作方案。该自动化培养系统可减少人工操作，便于用户使用，尤其有助于不熟悉诱导性多能干细胞（iPS细胞）操作的研究人员，实现从iPS细胞的维持培养到向多种细胞类型分化的全过程。

摘要

具有无限自我增殖能力的人诱导多能干细胞（hiPSCs）有望广泛应用于多个领域，包括阐明罕见疾病的病理机制、新药开发以及旨在修复受损器官的再生医学。然而，hiPSCs 的社会性应用目前仍受到限制，部分原因在于即使具备先进的知识和精湛的技术，由于 iPSCs 对微小环境变化高度敏感，体外培养中的分化过程仍难以重复。采用自动化培养系统可解决这一问题。通过在不同研究机构间共享标准化操作流程，有望实现不依赖研究人员技术水平的高重复性实验。尽管此前已开发出若干能够维持 iPSC 培养并诱导其分化的自动化系统，但这些系统因采用仿人多关节机械臂而普遍存在体积大、重量重且成本高的缺点。为改进上述问题，我们开发了一种新型系统，采用简化的 x-y-z 轴滑轨结构，使系统更加紧凑、轻便且成本更低。此外，用户可轻松修改该新系统的参数，以开发新的操作任务。一旦任务建立，用户仅需准备 iPSC，预先提供所需试剂和耗材，选择任务编号并设定时间即可。我们已证实，该系统可在无饲养层细胞的条件下，通过多次传代维持 iPSC 的未分化状态，并可将其分化为多种细胞类型，包括心肌细胞、肝细胞、神经前体细胞和角质形成细胞。该系统将有助于在不同机构间实现高度可重复的实验，无需依赖技术熟练的研究人员，同时通过降低准入门槛，推动 hiPSCs 在更广泛科研领域的实际应用。

引言

本文旨在提供我们与公司合作研制的人诱导多能干细胞（iPSC）自动化培养系统的实际、详细操作流程，并展示代表性实验结果。

自2007年该文章发表以来，诱导多能干细胞（iPSC）已在全球范围内受到广泛关注1。由于其最显著的特性是能够分化为任何类型的体细胞，因此有望应用于再生医学、阐明难治性疾病病因以及新药开发等多个领域2,3。此外，使用人源iPSC分化而来的体细胞有望减少受到严格伦理限制的动物实验。尽管iPSC相关研究不断需要大量均一的iPSC，但其培养管理极为耗时费力。此外，由于iPSC对培养条件和环境变化极为敏感，操作难度较大。

为了解决这一问题，人们期望自动化培养系统能够替代人工完成相关操作。一些研究团队已开发出若干用于人多能干细胞培养与分化过程的自动化系统，并发表了其研究成果4,5,6。这些系统配备了多关节机械臂。机械臂不仅具有高度模拟人类手臂动作的优点，也存在明显不足，例如机械臂本身成本较高、系统整体包装更大更重，且工程师需要耗费大量时间进行调试和训练，才能实现预期的运动控制7,8。为了在经济性、空间占用和人力资源消耗等方面更便于将该设备推广至更多研究机构，我们开发了一种新型的自动化培养系统，可用于诱导多能干细胞（iPSC）的维持及其向多种细胞类型的分化9。

我们设计新系统的基本思路是采用X-Y-Z轴导轨系统，而非多关节机械臂9。为了替代机械臂复杂的类手部功能，我们在此系统中引入了一种新理念，即能够自动更换三种特定功能的机械臂末端。此外，本文还说明了用户如何通过软件中的简单指令轻松制定任务计划，整个过程无需工程师参与。

其中一种机器人培养系统已证明可利用96孔板形成类胚体，作为三维细胞聚集体用于分化4。本文报道的系统无法处理96孔板。已有研究利用细胞系实现了现行药品生产质量管理规范（cGMP）级别，但所用细胞并非人类多能干细胞5。本文详述的自动培养系统目前的开发目标是辅助实验室实验（图1）。然而，该系统具备足够的防护能力，可维持相当于四级安全柜的洁净水平。

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方案

关西医科大学伦理委员会批准了名为KMUR001的健康志愿者来源诱导多能干细胞的建立与使用（批准号：2020197）。供者通过公开招募获得，已签署正式知情同意书，并同意细胞用于科学研究。

注意：当前界面（在 Windows XP 操作系统下运行的名为 "ccssHMI" 的专用软件）是基本操作界面。在上述界面中，排列有一系列选项卡，允许用户启动各种操作。

1. 加载操作

  1. 点击软件顶部屏幕上的Loading按钮，然后点击Loading Preparation Start按钮。
  2. 将要放入仪器中的培养皿或板放置于仪器内的指定位置。
    注意：应在每个皿盖上标注必要的识别信息。
  3. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械安全确认按钮。
  4. 在软件中选择培养皿或板的类型和数量。
  5. 点击Loading Preparation Completed按钮，然后点击Loading Start按钮。
  6. 当一个培养皿被上传至系统后，在软件中选择该培养皿的相关信息，例如with iPS cells或without iPS cells，并在软件中登记每个培养皿的备注信息。
  7. 最后点击Registration按钮，完成装载操作。

2. 卸载操作

  1. 点击软件主界面上的 卸载 按钮。在软件中选择要移除的培养皿。
  2. 选择培养皿后，点击 开始卸载准备 按钮，然后点击 开始卸载 按钮。
  3. 当培养皿从培养箱转移至系统的工作台后，按下 取出培养皿 按钮。
  4. 手动打开前方滑动窗口，取出培养皿，然后手动关闭滑动窗口，并按下机械安全确认按钮。

3. 耗材补充：移液器、管子和培养基

  1. 如需补充移液器、试管和培养基等耗材，请点击软件顶部屏幕上的 耗材 按钮，然后选择需要补充的物品。
    1. 移液器
      1. 点击 移液器 按钮，选择 补充 按钮。
      2. 在软件中选择用户希望补充的架子，点击 开始补充 按钮。
      3. 确认工作台上的移液器存储区域盖子已打开后，手动打开前方滑动窗口，并根据需要补充移液器。
      4. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械式安全确认按钮，点击 补充完成 按钮。
      5. 点击 补充设置 按钮，输入补充信息，然后点击 注册 按钮。
      6. 点击 补充完成 按钮。
    2. 试管
      1. 点击 试管 按钮，选择 补充 按钮。
      2. 在软件中选择用户希望补充的架子，点击 开始补充 按钮。
      3. 确认架子已升至顶部后，点击 补充试管 按钮。
      4. 手动打开前方滑动窗口，并根据需要补充试管。
      5. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械式安全确认按钮。
      6. 点击 补充完成 按钮。
      7. 点击 补充设置 按钮，输入补充信息，然后点击 注册 按钮，再点击 关闭 按钮。
    3. 培养基
      1. 点击 培养基 按钮，在软件中选择 补充 按钮。
      2. 从三个架子中选择用户希望补充的一个，点击 开始补充 按钮。
      3. 确认培养基存储区域的盖子已打开后，手动打开前方滑动窗口，并补充培养基。
      4. 手动关闭前方滑动窗口，并按下机械式安全确认按钮。
      5. 点击 补充完成 按钮。
      6. 点击 补充 按钮，输入培养基的相关信息，包括培养基名称和数量，必要时可添加备注。
      7. 点击 注册 按钮。
      8. 点击 关闭 按钮。

4. 任务选择

  1. 单击软件顶部屏幕上的 任务 按钮。
  2. 选择 任务设置 按钮。从任务列表中选择所需任务，然后单击 下一步 按钮。
  3. 指定执行任务的日期和时间，然后单击 注册 按钮。选择要执行任务的培养皿或板，然后再次单击 注册 按钮。
  4. 重新确认所选任务后，单击 注册 按钮。在下一个屏幕上确认任务已成功注册。
  5. 如有必要，以相同方式设置下一个任务。
  6. 最后单击 开始 按钮。随后，任务将在指定的日期和时间自动启动。
    注意：每次任务完成后，罩子两侧的紫外灯会自动开启，并根据辅助设置持续照射 5–30 分钟后关闭，以维持罩内无菌状态。如需中止此过程，用户可单击 开始 按钮。
  7. 如果用户希望提前取消已安排的任务，请单击 停止 按钮。
  8. 选择要中止的任务后，单击 编辑任务 按钮。
  9. 单击 任务取消 按钮。在下一个屏幕上确认任务已被删除。

5. 检查细胞图片

  1. 每项任务均包括任务操作前后的显微观察（拍照）。通过在每项任务之前或之后加入显微摄影步骤，以摄影方式记录细胞培养的进展。
  2. 选择预设的任务程序，包括预先选定培养皿或孔板中的多个特定位置，进行定点观察，以随时间推移监测同一位置。

6. 传代与分化

  1. 按照第1至第5节中的步骤操作，并设置自动细胞培养系统以进行传代和分化。传代、心肌细胞分化、肝细胞分化、神经前体细胞分化和角质形成细胞分化的仪器设置分别见表1、表2、表3、表4和表5。

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结果

人诱导性多能干细胞的维持
我们使用了三种人多能干细胞系（RIKEN-2F、253G1 和 KMUR001）。我们通过每日人工操作实验优化了细胞维持方案，并进一步通过系统完成的七次预实验优化了具体操作程序。例如，人工操作与系统操作中不同移液器喷出液体流速所产生的剪切力存在显著差异；因此，我们针对系统操作优化了酶消化时间以及细胞分散时的吹打次数。

将人诱导性多能干细胞维持在经 0.5 µg/cm2 细胞培养基质包被的 10 cm 培养皿中，并使用 hiPSC 培养基（例如 Neutristem 或 StemFit AK02N）。传代时，系统程序设定为先用 5 mL 不含钙的磷酸盐缓冲液（PBS[-]）洗涤 hiPSC 三次，随后加入 3 mL TrypLE 消化酶并补充 10 µM Rho 激酶抑制剂（Y-27632），在 37 °C 下处理 15 分钟。之后，系统向培养皿中加入 9 mL 含 0.15% 牛血清白蛋白 V 型组分（BSA）的 PBS(-)，并执行两组运动操作：吸取 10 mL 含细胞液体，然后将移液管尖端...

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讨论

该方案中的一个关键步骤是，如果用户发现任何错误，可随时点击取消、停止或重置按钮，并从第一步重新开始。该软件能够避免人为错误，包括重复预约、系统任务运行期间打开舱门以及未及时补充耗材等。另一个成功且高效地分化为所需体细胞的关键因素是正确选择多能干细胞系，因为每种多能干细胞在分化特性上均存在不可控的偏向性14,15。

这种用于诱导多能干细胞的自动化培养系统可维持细胞生长并将其分化为多种体细胞类型。该系统的尺寸为200 cm（宽）、110 cm（深）和233 cm（高），总重量为1.2吨。设备内置的培养箱可同时容纳三十六个10 cm培养皿和九块多孔板。

相较于先前的模型，本系统的改进之处主要有两点：第一，作为操作臂，X-Y-Z轴导轨系统由原有的6轴关节臂全新改造而成，通过更换机械臂末端工具，可分别用于培养皿、试管和移液器三种不同部件的操作。该机械臂悬挂于系统顶部，并沿X-Y-Z轴方向移动。第二，引入了细胞计数系统，用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本大阪市松下生产工程有限公司新业务促进中心提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.15% 牛血清白蛋白 V 组分Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm 塑料培养皿 Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN 生物资源研究中心HPS0002
2-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985023
肌动蛋白结合蛋白α  小鼠Abcamab9465
激活素 A Nacali Tesque18585-81
腺嘌呤Thermo Fisher ScientificA14906.30
白蛋白  兔DakoA0001
全反式维甲酸Fuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
自动化培养系统Panasonic
B-27 添加剂Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
牛血清白蛋白Merck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
定义型角质形成细胞-SFMThermo Fisher Scientific10744019人角质形成细胞培养基
地塞米松Merck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-二十六烷基甘油
一次性血细胞计数板CountessTM 细胞计数室载片, Thermo Fisher ScientificC10228
背侧形态发生素抑制剂（Dorsomorphin）Thermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001人多能干细胞培养基
胎牛血清 Biowest, FL, United StatesS140T
碱性成纤维细胞生长因子 Nacalai Tesque Inc.19155-07
福斯科林Thermo Fisher ScientificJ63292.MF
谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030081谷氨酰胺添加剂
山羊 IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  山羊Santacruz6556
氢化可的松Thermo Fisher ScientificA16292.06
氢化可的松 21-半琥珀酸酯MerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021细胞培养基质
胰岛素-转铁蛋白-硒Thermo Fisher Scientific41400045
角蛋白 1  小鼠Santacruz376224
角蛋白 10  兔BioLegend19054
KMUR001关西医科大学 患者来源的诱导多能干细胞 
Knockout 血清替代物Thermo Fisher Scientific10828010
L-抗坏血酸-2-磷酸 A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 培养基 Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
小鼠 IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 添加剂Thermo Fisher Scientific17502048
Nestin 小鼠Santacruz23927
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103049
神经丝蛋白  兔ChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1A细胞培养基 
Oct 3/4  小鼠BD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
兔 IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
兔 IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
重组人白蛋白 A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho 激酶抑制剂, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN 生物资源研究中心HPS0014未分化人诱导多能干细胞 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
抗坏血酸钠MerckA4034-100G
SSEA-4  小鼠MilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02细胞培养基 
肌钙蛋白 T 兔Abcamab92546
TRA 1-81 小鼠MilliporeMAB4381
三碘甲腺原氨酸Thermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM 表达酶 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
台盼蓝溶液 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
胰蛋白胨磷酸盐肉汤MerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-1 微管蛋白  小鼠PromegaG712A

参考文献

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
  3. Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
  4. Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
  5. Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
  6. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647(2015).
  7. McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
  8. Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41(2017).
  9. Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).
  10. Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  11. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  12. Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
  14. International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  15. Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).

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