本文介绍了一种在体外培养中生长特定下丘脑细胞亚型的实验方案。这些细胞可根据适当且独特的膜表面标志物进行筛选，并可用于多种实验应用，包括免疫荧光、电生理学以及生物化学检测。
本文内容
摘要
摘要
下丘脑通过调控食物摄入、体温和激素释放等多种功能，调节基本的代谢过程。由于下丘脑的功能由特定的神经元亚群所控制，因此能够分离这些神经元亚群为研究代谢机制提供了重要工具。在这方面，下丘脑神经元的复杂性带来了特殊的挑战。
由于这些原因，人们已开始探索一些新技术，例如磁性激活细胞分选（MACS）。本文介绍了一种利用微珠技术通过磁性激活细胞分选（MACS）从胎鼠脑组织中分离特定神经元群体的新应用。该技术操作简便，能够获得高纯度、高活性且可重复性良好的原代下丘脑神经元培养物。实验过程中，首先轻柔地解离下丘脑组织，选择性地将神经元与胶质细胞分离，最后利用针对细胞表面标志物的特异性抗体，富集目标细胞群体。
分离后，可利用靶向神经元研究其形态学、电生理和内分泌特性，以及其在正常或病理条件下的反应。此外，鉴于下丘脑在调节摄食、代谢、应激、睡眠和动机等方面具有多种功能，深入观察特定区域和靶向神经元可能有助于揭示其在这一复杂环境中的作用。
引言
下丘脑是大脑中具有多重功能的区域，介导内分泌、自主神经、内脏以及行为功能，包括摄食、代谢、睡眠、体温、社会行为和性欲1,2,3,4,5。这种功能异质性通过生化与电学机制的协同作用实现：下丘脑神经元产生动作电位，并分泌和释放激素及神经肽，以调节大脑其他区域和身体器官。最终，下丘脑神经元解读来自身体的稳态信号，并通过长期和短期的反馈与前馈调节作出响应6。
下丘脑复杂的神经元环境包括大细胞内分泌神经元，可释放催产素和血管加压素；小细胞神经元，主要参与全身性激素调节，例如向垂体释放促甲状腺激素释放激素（TRH）和促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）；大型肽能投射神经元，释放食欲素（orexin）和促黑素细胞浓缩激素（MCH）；以及弓状核（ARC）中的小细胞肽能神经元，分别释放POMC（前阿黑皮素原）和AgRP（刺鼠相关蛋白），被称为ARCPOMC和ARCAgRP。除了分泌细胞外，其他兴奋性和抑制性神经元，包括多巴胺能、谷氨酸能和GABA能神经元7，也参与形成下丘脑内和下丘脑外的神经环路，从而构建出具有显著细胞异质性的大规模协调网络8。
下丘脑的多样性是过去50年来研究人员一直试图克服的挑战。为了研究发育中、成熟及衰老下丘脑中的这种异质性，研究者一方面采用单细胞RNA测序技术来探索神经元的组织结构以及分子和转录组特征。这些研究深入揭示了下丘脑神经元的多样化功能，并阐明了细胞身份与其在生理系统中可能作用之间的关联8,9,10。另一方面，研究人员通过光遗传学操控和光纤光度行为学方法来探究神经元功能，从而能够深入观察神经环路的结构。在过去的二十年中，Cre重组酶技术使研究人员能够在观察行为和机体反应变化的同时，对特定神经元群体进行谱系特异性的激活或抑制6,11,12。
然而，这些方法仅从整体角度研究下丘脑功能，尚未深入探讨其在复杂的下丘脑环境中特定的细胞机制或生物学基础。为解决这一问题，极少数研究聚焦于利用异质性的原代下丘脑细胞培养体系，来探究分子、生化及电生理特性。这些研究旨在复杂环境中解析特定的神经元过程，并建立生理机制的整合模型13,14,15。然而，非特异性的细胞培养体系带来了显著挑战。例如，将正常情况下不会相互作用的不同下丘脑区域的神经元共同接种，会破坏神经元的生理连接性和解剖分布，从而产生混杂效应。此外，各个区域具有不同的功能和多样化的神经元群体，使得简单生物学过程的研究变得困难。
为应对这些挑战，在过去十年中，已实施多种新方法来分离目标神经元，例如免疫贴壁法（immunopanning）、荧光激活细胞分选（Fluorescent-Activated-Cell-Sorting, FACS）和磁珠激活细胞分选（Magnetic-Activated-Cell-Sorting, MACS）。免疫贴壁法是一种利用抗体包被的培养皿，通过一系列非神经元细胞（阴性）和神经元细胞（阳性）筛选步骤来纯化目标细胞的策略。尽管该技术理论上可获得高产量的纯化细胞培养物，但在实际应用中主要用于星形胶质细胞和少突胶质细胞，因为这些细胞能够耐受长时间的操作16,17。FACS 技术是一种基于荧光标记和细胞特征，利用流式细胞术进行细胞分选的强大工具18,19,20。然而，极少有研究将该方法用于细胞培养的细胞分离。该技术成本高昂，且需要熟练的技术人员进行操作和维护；此外，在分选过程结束后，维持细胞的活性和无菌状态也具有挑战性21。总体而言，MACS 似乎是一种简单且低成本的技术，可用于获得高纯度且具有活性的下丘脑原代神经元培养物。该方法利用与抗体连接的磁珠结合细胞，从而通过柱状结构中的磁场实现细胞分离。
本文介绍了一种基于MACS技术的方法，该技术通常用于皮层神经元。本方案原则上可分离出具有活性且高纯度的下丘脑神经元。在本研究中，我们制备了表达瘦素受体（Leptin Receptor, LepR）的原代神经元培养物，例如仅存在于弓状核中的ARCPOMC和ARCAgRP神经元。这些神经元在生化和电生理层面可对由脂肪组织分泌的厌食性激素瘦素产生反应。因此，在体外培养中分离这群神经元，有助于研究其激素、代谢和电生理特性in vitro。
方案
注意：实验流程的总体概述以图示形式展示于 图1A本研究中所有涉及小鼠的实验均经本机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。我们使用3月龄的C57BL6/J小鼠，饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的动物实验设施中，并由兽医负责日常护理。小鼠饲养于大型笼具中，维持12小时光照-12小时黑暗循环，常规喂食 随意摄取.
1. 受孕与妊娠确认
- 将任何背景和所需基因型的小鼠用于繁殖。在受孕前记录雌鼠的日期和体重。
- 6 小时后，使用探针检查雌鼠是否有栓塞。如果发现栓塞，则将雌鼠与雄鼠分笼；如果未发现栓塞，则将雌鼠继续留在笼中直至次日，然后将小鼠分笼。
- 在受孕后的第 7、10 和 14 天称量雌鼠体重，以确认是否怀孕。
2. 培养基、24孔板及材料准备
- 细胞分离当天，按如下步骤将预涂有聚-D-赖氨酸的玻璃盖玻片（见材料表）放入24孔板中：
- 在生物安全柜内，用70%乙醇对含有15个盖玻片的独立包装进行消毒，并晾干。打开包装，将盖玻片转移至60 mm培养皿中。水平轻摇培养皿以分离盖玻片，然后倒置培养皿，逐个取出盖玻片并放入24孔板的各孔中。
- 用1.0 mL无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤盖玻片一次，持续5分钟。
- 同时，按如下方法配制20.0 mL铺板培养基：在18.31 mL BME培养基（Eagle基础培养基，含Earle's盐）中加入1.0 mL热灭活胎牛血清（FBS），再加入200 µL丙酮酸钠（100倍储存液）、200 µL谷氨酰胺（200 nM储存液）和100 µL青霉素/链霉素（200倍储存液）。
- 将孔中的HBSS更换为1.0 mL铺板培养基，并将培养板置于37 °C培养箱中孵育。
- 使用本生灯，将三根巴斯德吸管依次烧制成逐渐减小的口径。一手持吸管，将管尖插入火焰中后迅速移出，重复此操作直至管尖变得光滑且口径缩小至所需大小（通过肉眼判断）。
3. 神经组织解离试剂的准备，按照神经组织解离试剂盒的说明进行
- 将消化缓冲液1在室温下预热后，通过将50 µL酶1与1.91 mL缓冲液1混合制备酶混合液1，并通过将15 µL酶2与30 µL消化缓冲液2混合制备酶混合液2。这些混合液足以用于所有胚胎的脑组织。
- 在HBSS中配制0.5%牛血清白蛋白（BSA），例如，将0.25 g BSA溶于50.0 mL HBSS中。
4. 胚胎提取
- 将两把直头精细镊子、一把弯头精细镊子和一把精细手术剪进行高压灭菌，并在使用前用70%乙醇消毒。然后，用HBSS填充培养皿。
- 将一只E14-E16天的妊娠母鼠置于CO2箱中实施安乐死，并进行颈椎脱位。
注意：以下步骤必须在超净台内无菌条件下操作： - 用70%乙醇对腹部进行消毒。用手术剪和镊子从耻骨联合处沿腹中线向上剪开至肋骨剑突部位，打开腹腔。
- 取出子宫角并将其放入盛有冰冻HBSS的100 mm培养皿中，充分清洗。
- 用精细镊子将所有胚胎从子宫中取出并分离。使用精细手术剪和/或镊子迅速将胚胎头部切除，并将头部分别放入盛有HBSS的60 mm培养皿中。
5. 下丘脑提取、收集与组织解离
- 用一把精细镊子插入眼腔以固定脑组织。用另一把精细镊子剥离皮肤和颅骨，直至脑组织暴露。根据脑组织的白色外观将其与其他组织区分开来。皮肤和颅骨呈粉红色，富含血管。
- 使用弯头尖镊子将脑组织从颅骨中取出，并从嗅球处将脑组织挖出，翻转使其倒置。
- 此时皮层位于腹侧，下丘脑在背侧的上表面可见（图1B）。用弯头镊子去除脑表面的脑膜层和血管，直至脑组织呈现白色且清晰透明。
- 用弯头镊子将下丘脑区域与脑的其余部分分离。
- 将下丘脑切成3–4小块，用移液器将组织块转移至15 mL离心管中。
- 在离心管置于冰上时，对其他胚胎重复上述步骤。
- 向离心管中加入6.0 mL HBSS，静置使组织沉淀，吸除上清液，然后加入酶混合液1。轻轻混匀并轻轻振荡离心管，防止组织结块。
- 将离心管置于37 °C水浴中孵育15分钟，每隔5分钟振荡一次，使组织重新悬浮。
- 15分钟后，加入30 μL酶混合液2。使用最大直径的巴斯德移液器（<1 mm）吹打组织10次以解离脑组织，注意避免产生气泡。
- 将离心管在37 °C水浴中继续孵育10分钟，每隔5分钟轻轻振荡一次，使组织重新悬浮。
- 10分钟后，加入剩余的15 µL酶混合液2。依次使用另外两根直径递减的火焰抛光移液器，各吹打10次以进一步解离组织，吹打过程避免产生气泡。
- 向含有解离组织的离心管中立即加入10.0 mL HBSS-0.5% BSA，室温下以300 × g离心10分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1.0 mL HBS-0.5% BSA中。
6. 细胞计数
- 用 HBSS-0.5% BSA 将细胞悬液按 1:5 比例稀释。
- 将10 µL稀释后的细胞悬液加入血细胞计数板。
- 在明场显微镜下，仅计数四个腔室中的细胞 角上的方格。计算平均值后乘以 5 × 104.
注意：确保有 >106 细胞以进行细胞分离；最佳细胞数量为107.
7. 阴性筛选
注意：通过分离神经元和非神经元细胞，负向筛选可使用户获得纯化的原代神经元培养物。请使用预冷的溶液。
- 将细胞悬液在 300 × g 条件下离心 3 分钟（离心时间可延长至 10 分钟）。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 80 µL HBSS-0.5% BSA 中，使细胞浓度为 107 个细胞。
- 加入 20 µL 非神经元细胞生物素标记抗体混合液，在 4 °C 下孵育 5 分钟。
- 用 2.0 mL HBSS-0.5% BSA 洗涤细胞以去除游离抗体，并在 300 × g 条件下离心 3 分钟。
- 小心 吸除上清液，将沉淀重悬于 80 µL HBSS-0.5% BSA 中。加入 20 µL 抗生物素微珠，充分混匀后在 4 °C 下孵育 10 分钟。
- 每 107 个细胞加入 0.5 mL HBSS-0.5% BSA，等待磁性柱准备就绪。
8. 磁性分离，阴性筛选
注意：磁分离是一个关键步骤，可将非神经元细胞与神经元细胞分离开。含有神经元和非神经元细胞的样品通过磁场时，与生物素-抗体-磁珠复合物结合的非神经元细胞会被滞留在柱中（图1C），而游离的神经元细胞则流过柱子，收集于15 mL离心管中。
- 按照图1C所示，使用试剂盒中提供的支架、分离器和MS柱进行组装。
- 仅在细胞准备分离时，再打开色谱柱并安装支架。
- 用0.5 mL HBSS-0.5% BSA冲洗色谱柱，等待溶液完全滴尽。
- 为收集神经元细胞，将一个15 mL离心管置于色谱柱下方，将0.5 mL细胞悬液通过色谱柱，收集流出液直至不再滴液。为回收残留的神经元细胞，用HBSS-0.5% BSA溶液分3次、每次0.5 mL洗涤色谱柱。
- 为收集非神经元细胞，将色谱柱从磁铁上取下，放入一个新的15 mL离心管中。向色谱柱中加入1.0 mL HBSS-0.5% BSA，然后使用推杆收集被磁性标记的非神经元细胞。
- 将神经元和非神经元细胞在300 × g 条件下离心3分钟。轻柔吸除上清液，并将细胞重悬于1.0 mL HBSS-0.5% BSA中。按照第6节所述方法进行细胞计数。
- 如有需要，将非神经元细胞接种至24孔板中；否则将其弃去。
9. 阳性筛选
注意：获得纯化的神经元细胞悬液后，需进行阳性筛选以分离目标细胞。可通过针对表面抗原的特异性生物素标记抗体来分离细胞。该抗体可被抗生物素磁珠识别。通过使细胞悬液流经磁珠分离装置 通过柱子的悬液中，只有目标细胞被截留在磁场中。
- 将纯化的神经元细胞悬液在 300 × g 条件下离心 3 分钟。轻轻吸除上清液，并将沉淀重悬于 80 µL HBSS-0.5% BSA 中。根据制造商说明书加入特异性抗体，在 4 °C 孵育 10 分钟。
注意：若目标为表达 LepR 的细胞，建议使用浓度为 0.50 µg/106 个细胞的生物素标记小鼠瘦素受体抗体（见材料表）。 - 用 2.0 mL HBSS-0.5% BSA 洗去未结合的抗体，并在 300 × g 条件下离心 3 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于 80 µL HBSS-0.5% BSA 中，加入 20 µL 抗生物素微珠，于 4 °C 孵育 10 分钟。
- 每 107 个细胞加入 0.5 mL HBSS-0.5% BSA，等待磁性层析柱准备就绪。
10. 磁珠分离，阳性筛选
- 安装带有分离器和MS柱的支架。用0.5 mL HBSS-0.5% BSA冲洗MS柱，待滴液停止。
- 在柱下放置一个15 mL离心管，将0.5 mL细胞悬液通过柱子，收集流出液，其中含有非特异性神经元细胞。为清除柱中残留的非特异性神经元细胞，用3 × 0.5 mL HBSS-0.5% BSA洗涤柱子。
- 将柱子从磁铁上取下，放入一个新的15 mL离心管中，加入1.0 mL HBSS-0.5% BSA。使用推杆冲洗出目标细胞。
- 将两个离心管在300 × g 下离心3分钟。小心吸去上清液，并将沉淀重悬于0.5 mL铺板培养基中。
- 按照第6节所述方法计数细胞。
- 将目标细胞作为阳性对照、非特异性细胞作为阴性对照，以120,000–200,000个细胞/mm3的密度接种至第2节中预先准备好的24孔板中，在37 °C、5% CO2、9% O2、95%湿度条件下培养12小时。
11. 细胞培养的维持
- 准备20 mL培养基，包含19.2 mL神经元培养基、400 µL B27添加剂（来自50倍储存液）、200 µL谷氨酰胺（来自200 µM储存液）和100 µL青霉素/链霉素（来自200倍储存液）。
- 更换含有神经元或非神经元细胞的24孔板中的铺板培养基。
- 用 2 次 1.0 mL 的 HBSS 洗涤。
- 加入 1.0 mL 培养基。
- 每2至3天更换一次培养基，弃去0.5 mL旧培养基，加入0.5 mL新鲜培养基。
注意：细胞可在培养条件下维持并使用长达21天 体外 （DIV21）
12. 神经元免疫荧光染色
- 染色前12小时，配制体积比为50/50的甲醇与丙酮混合溶液，并于-20 °C预冷过夜。
- 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）以每孔1.0 mL、共2次、每次5分钟洗涤24孔板中的神经元。
- 弃去PBS，加入1.0 mL的50/50混合溶液，冰上孵育20分钟。
- 用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 用含3%牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS在室温下封闭神经元1小时。
- 按照生产商推荐的抗体浓度，在含3% BSA的1×PBS中配制一抗溶液。所用抗体及其浓度详见材料表。
- 弃去封闭液，加入一抗溶液，4 °C孵育过夜。
- 用1×PBS洗涤细胞3次，每次10分钟。
- 在含3% BSA的1×PBS中配制二抗溶液，抗体浓度依据生产商 说明书进行。所用二抗详见材料表。
- 加入二抗溶液，在室温下孵育细胞1小时。
- 用1×PBS洗涤细胞3次，每次10分钟。
- 在封片过程中保持神经元处于1×PBS中。在显微镜载玻片上滴加少量封片剂（可含或不含用于细胞核识别的4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。用镊子取出一张带有神经元的玻璃盖玻片，轻触滤纸边缘以吸除多余的PBS。将盖玻片倒置在封片剂上，确保神经元面向载玻片；轻轻按压，并用滤纸吸除多余封片剂。
- 显微镜载玻片现已准备好，可用于明场或共聚焦显微镜分析。
结果
本文描述了一种分离下丘脑靶向神经元的实验方案（图1）。该方法的目的是在受控且分离的环境中研究特定神经元的特性。因此，在E14-E16阶段从小鼠孕鼠中取出胚胎。去除脑膜后，将下丘脑从脑的其余部分分离出来。使用参照的解离试剂盒 freshly 配制的两种酶混合液轻柔地对组织进行解离。首先，将非神经元细胞与神经元细胞分离——胶质细胞、小胶质细胞和神经元被收集在同一单细胞悬液中。为此，使用识别非神经元表面表位的抗体混合物对非神经元细胞进行标记。孵育后，抗体-细胞复合物与磁性微珠结合，随后通过磁性柱以捕获非神经元细胞。
此步骤得到两种细胞悬液，一种含有非神经元细胞，另一种含有神经元细胞。两种悬液均可立即接种。或者，可采用相同策略进一步处理神经元细胞悬液，以从中分离出特定的神经元亚群（靶向悬液）。根据具体实验需求，神经元细胞的接种密度可在125,000至200,000个细胞/mm3之间选择。较低密度的培养可用于单细胞分辨率下的神经元分析，包括轴突发育、突触形成与传递以及电生理学研究；较高密度的培养则适用于生化分析，包括DNA和RNA提取、蛋白质印迹（western blot）、DNA印迹（Southern blot）、RNA印迹（Northern blot）、实时PCR以及RNA测序。
本研究中，靶向 LepR 以分离参与黑皮质素系统的神经元，例如 ARCPOMC 和 ARCAgRP 神经元。细胞接种密度根据细胞类型而定：LepR+ 神经元为 120,000 个细胞/mm3，普通神经元群体为 200,000 个细胞/mm3。48 小时后，LepR+ 神经元开始形成神经突起（图 2）。在体外培养第 4 天（DIV4），轴突进一步延伸，同时树突结构开始出现。至体外培养第 6 天（DIV6），神经元已充分发育，可进行分析。对 LepR+ 神经元进行的免疫荧光实验显示，99% 的细胞表达 LepR（绿色，图 3A）。未观察到胶质细胞或其他非神经元细胞，证实了原代神经元培养物的高纯度。通过微管相关蛋白 2（MAP2）染色确认了细胞的神经元特性，可清晰识别出轴突及树突突起（图 3B）。在体外培养第 10 天（DIV10），30% 的 LepR+ 细胞表达 POMC（红色）。此结果符合预期，因为大多数 LepR+ 细胞表达 POMC 或 AgRP。图 3C、D 展示了 POMC 与 LepR 信号的共定位情况。需要注意的是，共定位信号主要出现在细胞核周围区域，符合预期分布特征。
使用包含异质性下丘脑神经元群体的一般培养物作为对照。免疫荧光结果显示了突触连接性和功能，通过突触素-1（绿色）和PSD 95（红色）的共染色进行评估（图4A、B）。一般培养物中LepR+神经元的比例约为5%，该百分比表明在磁性分选过程中大多数表达LepR的神经元已被富集（代表性LepR+细胞见图4C、D）。本研究生成或分析的所有数据均可在 https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c 获取。
图1实验流程图与实验装置 (A) 实验流程的图示。Go-no-go：≥106 细胞是进行细胞分离的必要条件；最佳细胞数量为107. (BE16 胚胎脑的代表性图像。下丘脑和脑膜已标出. (C用于靶细胞分离与纯化的MACS装置。图中标明了磁力架、磁性分离器和分离柱。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：DIV2 至 DIV6 期间的神经元培养。 （A）通过阳性筛选获得的 LepR+ 细胞表现出较低的细胞密度和连接性，但神经突（红色箭头）、轴突（蓝色箭头）和树突（绿色箭头）的发育正常。细胞接种密度为 120,000 cells/mm3。比例尺 = 100 μm。（B）普通下丘脑神经元，接种密度为 200,000 cells/mm3，表现出正常的发育、生长特征和连接性（黑色箭头）。比例尺 = 100 μm。缩写：DIV = 体外培养天数（days in vitro）；LepR = 瘦素受体。生成或分析本图所用的全部数据可通过 https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c 获取。请点击此处查看本图的高清版本。
图3: 在体 培养的LepR+神经元可重现神经元的特性。 (A) 表达LepR的神经元培养的代表性图像（绿色为LepR；DAPI染色为蓝色）。99%的细胞表达LepR。神经元接种密度为120,000个细胞/mm²3 密度。在DIV7时，神经元呈现出延长的轴突、树突成熟以及神经元连接（箭头所示）。比例尺 = 40 μm. (B) 使用抗 MAP2 抗体进行免疫荧光染色，以确认细胞的神经元特性。图中显示了神经元特异性的形态结构，如轴突、树突和突起（箭头所示）。比例尺 = 40 μm. (CLepR+ 细胞的放大图像。LepR 为绿色，DAPI 为蓝色。比例尺 = 10 μm. (D) LepR（绿色）与 POMC（红色）共染色。约 30% 的 LepR+ 神经元对 POMC 呈免疫反应阳性，信号位于细胞核水平（红色箭头）。比例尺 = 10 μm缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；MAP2 = 微管相关蛋白2；POMC = 前阿黑皮素原；LepR = 瘦素受体。生成或分析本图所用的所有数据均可在 https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c 获取。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4: 在体 通过培养的通用下丘脑神经元重现了这些细胞。 (A) 泛素下丘脑神经元培养的代表性图像，经 Synapsin 1（绿色）、PSD95（红色）和 DAPI（蓝色）染色。神经元表现出良好的连接性及突触功能（箭头所示）。比例尺 = 40 μm. (B) 方框内区域的放大 (A)，显示突触素1（绿色）与PSD95（红色，箭头所示）的共定位。比例尺 = 20 μm. (C，D代表性图像显示普通培养条件下的 LepR+ 细胞。LepR+ 细胞（绿色）约占总数的 ~5%。箭头指示代表性 LepR+ 细胞。比例尺 = 40 μm. (E，F) 图中框选区域的放大图C，D) 显示绿色斑点状瘦素受体定位于胞体。比例尺 = 20 μm. 构建此图所生成或分析的全部数据均可在 https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c 获取。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
研究下丘脑神经元的生物化学和电学特性，对于理解代谢、体温调节、情绪调控、摄食行为等分子机制至关重要。然而，下丘脑神经元的高度异质性使得这一研究面临挑战，亟需开发用于分离和研究特定下丘脑亚群神经元的方法。
在体 技术采用CRE重组酶、光遗传学、光纤光度法和钙成像。这些方法主要用于研究下丘脑神经元的电学特性，而目前可用于探究其非电学属性的方法极少。本研究开发的MACS技术可为分离特定下丘脑神经元亚群提供一种可行的技术手段 体外 从而实现针对性的治疗和分析。与不同神经元群体的共培养相比，神经元纯培养更易于管理。此外，纯培养可避免胶质细胞和小胶质细胞存在所导致的干扰效应。因此，可研究来自相同下丘脑区域和类型的神经元对特定代谢和激素刺激的反应。
在本实验方案中，我们选择了表达瘦素受体（LepR）的下丘脑神经元。分离得到的 LepR+ 细胞被用于培养，以研究其细胞、形态及分子特性，这些特性在体内难以进行分析。in vivo。培养物的纯度达到99%，表明该方法具有较高的准确性。此外，LepR+ 细胞在体外培养第7天（DIV7）至第21天（DIV21）期间保持健康且具有活性。
然而，该技术存在一些局限性。E18或更晚期的纯神经元培养难以维持，因此取材时间窗口仅限于E14至E16。这意味着E16之后发生的细胞变化将被遗漏。例如，弓状核（ARC）神经元中瘦素受体的表达在出生后早期阶段逐渐增加22。组织分离操作必须尽可能迅速完成，以减少细胞应激和死亡，提高收获率。整个操作过程可能长达5小时，因此必须保持无菌条件，并将操作步骤减少到最低必要程度。由于可用组织量较少，阳性筛选可能导致收获率偏低，从而限制单次制备所能开展的实验数量。实验中观察到神经元死亡率升高，可能原因是细胞密度较低以及神经元间连接性和神经元内支持减少所致。
此外，针对目标抗原的抗体必须能够结合细胞表面，以确保分离的准确性；通常用于流式细胞术的抗体适用于MACS技术。如果该抗体此前未用于细胞分离方法，则需要进行验证和滴定实验，以确定其最佳使用浓度。靶向细胞的分离需要依赖细胞表面标志物。本研究中使用了生物素标记的抗体，但原则上，也可使用与其他分子偶联的抗体，例如FITC（异硫氰酸荧光素）或PE（纯化抗藻红蛋白）。MACS技术还可应用于表达荧光蛋白（如GFP或其他标签蛋白）的神经元，从而可能提高分离的特异性和得率。若不使用荧光蛋白，则可在进行活细胞实验前，通过免疫荧光染色来确认目标分子的表达情况作为替代方案。未来的研究将验证这些替代方法的有效性。
本研究未涉及的一个重要方面是 "保真度" 亚神经元群体。我们确定培养的LepR+神经元表达了POMC，这是原生ARC的标志性特征POMC 神经元。然而，要得出LepR+神经元培养物能够重现其天然特性的结论，还需要进行更多测试 体内 对应物。总体而言，本文介绍的MACS神经元分离方案可能为研究提供一种有效且可靠的方法 体外 难以研究的下丘脑机制 体内.
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
图表使用 BioRender.com 制作。本工作获得了美国国家衰老研究所资助（R01AG060919）和美国国家科学基金会资助（2030348）的支持，资助对象为 FS。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胚胎提取 | |||
| 1 把弯头尖头镊子 | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 把精细手术剪 | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 2 把直头精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm 培养皿 | Corning | 430196 | |
| 70% 乙醇 | Decon Laboratories, INC. | 2801 | 190 证明乙醇 |
| 抗生物素微珠 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| 抗 MAP2 抗体 | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| 实验台垫 | |||
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| 缓冲液 Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 缓冲液 Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 细胞培养 | |||
| 抗生物素微珠 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| 缓冲液 Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 缓冲液 Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 酶 A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 酶 P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5，12 mm 直径，#1.5 厚度，100 片细胞培养测试级德国盖玻片 | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 添加剂 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco 基础培养基 Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's 盐，(-) L-谷氨酰胺 |
| Gibco HBBS (1x) Hank's 平衡盐溶液 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | 含钙、镁，不含酚红 |
| Gibco 热灭活胎牛血清 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-谷氨酰胺 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco 青霉素/链霉素 | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco 丙酮酸钠 (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS 分离器及起始试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 小鼠瘦素受体生物素化抗体 | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 个细胞 |
| MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neubauer 改良亮线 100 µm 计数板 | Hausser Scientific | 3120 | |
| 神经组织解离试剂盒 - 新生神经元 | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 神经元培养基 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| 非神经元细胞生物素化抗体混合物（小鼠）1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 变倍体视显微镜 | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce 原代神经元分离试剂盒 | ThermoFisher | 88280Y | |
| 染色 | |||
| 抗 MAP2 抗体 | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| 驴抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| 驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| 山羊抗鸡 IgY (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen 瘦素受体重组兔单克隆抗体 (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| 小鼠瘦素受体生物素化抗体 | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 594 标记物 | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 单克隆抗体 (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus 抗荧光淬灭封片剂（含 DAPI）10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
参考文献
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