使用自动化平台Lustro在酵母中进行高通量光遗传学实验

摘要

本方案概述了利用自动化平台Lustro在酵母中进行光遗传系统高通量表征的步骤。

摘要

光遗传学通过利用基因编码的光敏蛋白，实现对细胞行为的精确控制。然而，为了优化这些系统以达到预期功能，通常需要进行多次设计-构建-测试循环，这一过程可能耗时且劳动密集。为应对这一挑战，我们开发了Lustro平台，该平台将光刺激与实验室自动化相结合，能够高效地对光遗传系统进行高通量筛选与表征。

Lustro 利用配备有照明装置、振荡装置和酶标仪的自动化工作站。通过使用机械臂，Lustro 可在这些设备之间自动转移微孔板，从而实现对光遗传菌株的刺激及检测 其响应。本实验方案提供了使用Lustro对芽殖酵母中用于基因表达调控的光遗传学系统进行表征的逐步操作指南 酿酒酵母该方案涵盖了Lustro组件的设置，包括将照明装置与自动化工作站整合。同时提供了对照明装置、酶标仪和机器人进行编程的详细说明，以确保整个实验过程中操作的顺畅及数据采集的可靠性。

引言

光遗传学是一种强大的技术，利用光敏蛋白以高精度控制细胞行为^1,2,3。然而，构建光遗传元件原型并确定最佳光照条件可能耗时较长，使得优化光遗传系统变得困难^4,5。高通量方法可快速筛选和表征光遗传系统的活性，从而加速构建-测试-设计循环，推动元件原型开发及其功能探索。

Lustro 平台作为一种实验室自动化技术，旨在实现光遗传系统的高通量筛选与表征。该平台将微孔板读板仪、光照装置和振荡装置与自动化工作站集成在一起⁶。Lustro 可在微孔板中对细胞进行自动培养和光刺激（图1 和 补充图1），从而实现对不同光遗传系统的快速筛选与比较。Lustro 平台具有高度可适应性，可推广应用于其他实验室自动化机器人、光照装置、微孔板读板仪、细胞类型以及光遗传系统，包括响应不同波长光的系统。

本方案演示了Lustro系统的设置及其在表征光遗传学系统中的应用。以光遗传学控制酵母中分裂转录因子为例，通过探究光输入与荧光报告基因mScarlet-I⁷表达之间的关系，展示该平台的功能与实用性。遵循本方案，研究人员可简化光遗传学系统的优化流程，并加快发现调控生物系统的新型动态控制策略。

方案

本研究中使用的小鼠品系已在材料表中列出。这些品系在22 °C至30 °C的温度范围内表现出良好的生长能力，并可在多种标准酵母培养基中培养。

1. 设置自动化工作站

1. 为自动化工作站配备能够移动微孔板的机器人抓手（RGA，参见材料表）（图1）。
2. 将微孔板加热振荡器（参见材料表）安装至自动化工作站内（图1(1)），并配备自动锁板机构，以允许RGA进入。
3. 将微孔板检测仪置于自动化工作站旁侧（图1(2)），确保RGA可顺利访问。
4. 配置一个允许RGA便捷访问的微孔板照明装置（图1(3)），例如本研究所用的optoPlate⁸或LITOS⁹（参见材料表）。

2. 照明装置的制备

1. 根据已建立的方法构建并校准 optoPlate（或替代照明装置）^8,10,11。
2. 在照明装置上使用适配器，以实现 RGA 访问。
3. 通过电子表格输入¹⁰或图形界面¹²对 optoPlate 进行编程。按照步骤 3 执行光刺激程序。

3. 设计光刺激程序

1. 确定实验所需的光照条件。
2. 将所需的光照条件（包括光照强度、光照起始时间、脉冲长度、脉冲次数和脉冲间持续时间）输入电子表格中。
   注意：请按照 GitHub 仓库（github.com/mccleanlab/Optoplate-96）中提供的说明将这些信息烧录至 optoPlate。请注意，样品板在微孔板读数仪或加热振荡器中时不会被照射。这些事件的持续时间和频率可能需要根据具体的实验需求进行优化。
3. 为每种菌株设置黑暗条件，以便进行适当的背景测量。
4. 在初步表征实验中评估转化子功能时，使用高强度光照。
   ​注意：对于更敏感的实验，应优化光照强度，因为过强的光照可能对酵母产生光毒性¹³。

4. 酶标仪的准备

1. 在开展实验前，将酶标仪配置为测量所需的特定目标参数。
   注意：本示例中，酶标仪被设置为检测目标菌株所表达报告蛋白的荧光信号。根据实验需求，也可选择其他检测信号，如发光或光密度。
2. 在合成完全（SC）培养基¹⁴（或其他低荧光背景的培养基）中培养目标菌株（同时设置非荧光对照菌株）（参见材料表），使其生长至待测的最高细胞密度。将菌液转移至黑色壁、玻璃底的微孔板（参见材料表）中进行测量，以确定酶标仪的最佳检测参数。
   注意：为确保读数准确，请正确输入微孔板的尺寸参数，并从板底部进行检测。
3. 参考荧光蛋白数据库（例如 fpbase.org），获取目标荧光蛋白的近似吸收光谱和发射光谱¹⁵。
4. 对含有荧光菌株和非荧光菌株的孔进行Z轴扫描，确定Z值（即微孔板与检测器之间的距离），选择能获得最高信噪比的Z值 。
5. 通过对荧光菌株和非荧光菌株进行吸收光谱和发射光谱扫描，优化吸收与发射波长设置，以获得最佳信噪比。
6. 将增益设置为最优水平后测量荧光菌株，确定在不导致信号溢出误差的前提下可使用的最高光学增益。
   ​注意：在涉及相同菌株的所有实验中，应手动一致地设置该光学增益，以确保结果的可重复性。
7. 在酶标仪软件中编写测量程序（参见图2），该程序用于设定仪器检测菌液的光密度以及待测荧光蛋白的荧光光谱。
   ​注意：除非菌株表达红色荧光蛋白，否则应在600 nm处测量其光密度；若表达红色荧光蛋白，则应在700 nm处测量光密度，以避免干扰¹⁶。
8. 设置测量程序，使仪器在检测过程中维持30 °C的内部孵育温度。
9. 配置测量程序，根据需要将数据导出为电子表格或ASCII文件。

5. 编程机器人

1. 根据载体（例如加热振荡器、巢板平台、光照装置）的实际布局和实验耗材（即96孔板）在自动化工作站软件中配置工作台定义（参见材料表）。在自动化工作站软件中创建一个脚本以执行光诱导和测量操作（图3），具体步骤如下。
2. 关闭任何内置光源，以防止光遗传系统发生背景激活。
3. 设置加热振荡器以维持30 °C的温度。当板未放置在加热振荡器上时，其温度将处于环境温度（22 °C）。
4. 使用循环、定时器和循环计数变量，以固定时间间隔重复执行诱导和测量细胞的步骤。
5. 在记录测量数据之前，振荡样品板以确保所有细胞充分悬浮。通常，以1,000 rpm转速、2 mm轨道直径振荡60秒足以重新悬浮S288C S. cerevisiae细胞，并避免测量偏差。
6. 使用机械臂将样品板移至微孔板读数仪，并移除盖子（如适用），以防止光密度测量产生偏差。如果微孔板读数仪载体定义设置为不允许盖子存在，则控制软件将自动将盖子移除并放置到指定位置 。
7. 执行第4步中所述的微孔板读数仪测量脚本。
8. 将盖子重新盖回样品板上，并使用机械臂将板移至光照装置。
9. 设置脚本等待，直到计时器达到指定的时间间隔（例如，30分钟乘以循环计数变量），然后重复整个循环指定次数（例如，24小时实验重复48次）。
10. 通过多次运行空板在脚本循环中，排查潜在错误，并确保载体和耗材定义正确无误，以及机器人玻璃移液器（RGA）能够准确抓取和放置板。
11. 配置用户警报，以便在协议执行过程中发生仪器状态变化或错误时通知用户。

6. 设置样品板

1. 在富含营养的培养基平板（如YPD琼脂培养基¹⁷，参见材料表）上培养酵母菌株。需包含非荧光性（阴性）对照。
2. 从平板上挑选单菌落，接种至玻璃培养管中含3 mL SC培养基¹⁴（或其他低荧光背景的培养基，如LFM¹⁸）的培养液中。将培养物置于30 °C摇床培养过夜，同时保持避光或使用非响应性光照条件（例如，对蓝光响应系统使用红光）。
3. 通过将每种过夜培养物各取200 µL稀释至1 mL SC培养基中，使用分光光度计或微孔板读板仪测定其在600 nm处的光密度（OD600）。
4. 将每种过夜培养物用玻璃培养管稀释至OD₆₀₀为0.1。若需高通量菌株检测，可在微孔板中进行自动化稀释。
5. 将稀释后的培养物转移至96孔板中。每种实验条件设置三个重复孔（即相同菌株和光照条件下三个相同的孔），以消除技术误差。设置仅含培养基的空白孔和非荧光细胞孔作为阴性对照，用于测定背景荧光和光密度。
6. 在开始光照诱导实验前，将96孔板置于30 °C振荡培养5小时。根据具体菌株和实验条件，可适当调整稀释比例和培养时间以优化实验效果。

7. 实验操作

1. 将样品板放置到加热振荡器上，并按照步骤5所述启动自动化程序。
2. 在酶标仪完成初始读数后，立即启动步骤3中描述的光刺激程序。
3. 如果自动化工作站不在暗室中，需用遮光帘将其覆盖，以避免背景光照干扰。

8. 数据分析

1. 为实验创建一个电子表格图谱，反映96孔板的8 × 12布局。确保该图谱在一个网格中包含被测量菌株的名称，在另一个网格中包含所用光照条件的描述。
2. 使用Python脚本或其它首选编程语言分析导出的数据。将图谱电子表格导入数组中，使每个孔位与对应的菌株名称和条件名称相关联。
   注意：分析的示例代码可在以下地址找到：https://github.com/mccleanlab/Lustro。此外，也可使用应用程序解析来自不同酶标仪的数据¹⁹。
3. 将导出的实验电子表格中的数据读取到另一个数组中。
4. 生成每种菌株和条件下随时间变化的光密度值和荧光值曲线图，如图4所示。
5. 检查光密度曲线图，以确定培养物处于指数生长期或饱和期的阶段。该信息有助于选择合适的时间点，用于比较不同菌株或条件之间的荧光测量值，如图5所示。

结果

图4A展示了表达荧光报告基因的光遗传学菌株在不同时间点的荧光值，该报告基因由光诱导型分裂转录因子调控。实验中使用了不同的光照条件，这些条件通过占空比的变化来体现，占空比表示光照开启时间所占的百分比。总体荧光水平与光刺激的占空比呈正比关系。图4B显示了同一实验中相应的OD₇₀₀值。在不同光照条件下，光密度读数保持一致，表明该实验技术在不同光照条件下对菌株生长速率无显著影响。

通过随时间测量荧光和光密度，相较于仅在单一时间点获取输出结果的技术，能够更深入地理解光遗传系统对不同光刺激程序的响应。这种时间序列数据对于选择特定时间点以比较不同菌株和条件具有重要价值。图5展示了两种不同的光遗传菌株在不同光刺激程序诱导下，于光照诱导10小时时的单个时间点测量结果。这两种菌株均采用光诱导型分裂转录因子来驱动荧光报告蛋白的表达。光脉冲的强度、周期和占空比的变化会在这两类菌株中引发不同的响应。

...

讨论

本文介绍的Lustro方案通过自动化细胞培养、光照和检测流程，实现了光遗传系统的高通量筛选与表征⁶。该方案通过将光照装置、微孔板读板仪和振荡装置整合到自动化工作站中，实现上述功能。本方案特别展示了Lustro在筛选整合于酵母S. cerevisiae中的不同光遗传元件以及比较不同光照诱导程序方面的应用价值。

本方案中强调的几个关键步骤对于有效使用Lustro至关重要。必须精心设计定制的光照程序，使其与所研究的光遗传学元件的动力学特性相匹配。此外，对酶标仪进行精确校准对于获得可靠的测量结果至关重要。在机器人平台上对实验进行充分的预演，包括进行必要的调整以确保与光照程序的正确同步，是确保实验脚本顺利运行的关键。

本实验方案描述了在不同光照刺激条件下，比较由光诱导型分裂转录因子驱动的荧光报告基因表达与非荧光对照的情况。每30分钟从微孔板的每个孔中采集一次荧光信号，在测量前先在加热振荡器上振荡1分钟。如本方案所示，Lustro适用于整合了蓝光响应型光遗传系统的非贴壁细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带  #1.5 盖玻片的 96 孔玻璃底板	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm（加热振荡器）	QINSTRUMENTS
Fluent 自动化工作站	Tecan
LITOS（替代照明装置）	Hohener 等，Scientific Reports，2022
optoPlate-96（照明装置）	Bugaj 等，Nature Protocols，2019
机器人抓手机械臂	Tecan
Spark（酶标仪）	Tecan
合成完全培养基	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect（用户提醒应用程序）	Tecan
yMM1734（BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 同源序列, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 同源序列  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5）	Harmer 等，ACS Syn Bio，2023
yMM1763（BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 同源序列, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 同源序列  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5）	Harmer 等，ACS Syn Bio，2023
yMM1765（BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 同源序列, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 同源序列  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5）	Harmer 等，ACS Syn Bio，2023
YPD 琼脂	SigmaAldrich	Y1500