本方案概述了利用自动化平台Lustro在酵母中进行光遗传系统高通量表征的步骤。
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本文内容
摘要
摘要
光遗传学通过利用基因编码的光敏蛋白，实现对细胞行为的精确控制。然而，为了优化这些系统以达到预期功能，通常需要进行多次设计-构建-测试循环，这一过程可能耗时且劳动密集。为应对这一挑战，我们开发了Lustro平台，该平台将光刺激与实验室自动化相结合，能够高效地对光遗传系统进行高通量筛选与表征。
Lustro 利用配备有照明装置、振荡装置和酶标仪的自动化工作站。通过使用机械臂，Lustro 可在这些设备之间自动转移微孔板，从而实现对光遗传菌株的刺激及检测 其响应。本实验方案提供了使用Lustro对芽殖酵母中用于基因表达调控的光遗传学系统进行表征的逐步操作指南 酿酒酵母该方案涵盖了Lustro组件的设置，包括将照明装置与自动化工作站整合。同时提供了对照明装置、酶标仪和机器人进行编程的详细说明，以确保整个实验过程中操作的顺畅及数据采集的可靠性。
引言
光遗传学是一种强大的技术，利用光敏蛋白以高精度控制细胞行为1,2,3。然而，构建光遗传元件原型并确定最佳光照条件可能耗时较长，使得优化光遗传系统变得困难4,5。高通量方法可快速筛选和表征光遗传系统的活性，从而加速构建-测试-设计循环，推动元件原型开发及其功能探索。
Lustro 平台作为一种实验室自动化技术，旨在实现光遗传系统的高通量筛选与表征。该平台将微孔板读板仪、光照装置和振荡装置与自动化工作站集成在一起6。Lustro 可在微孔板中对细胞进行自动培养和光刺激（图1 和 补充图1），从而实现对不同光遗传系统的快速筛选与比较。Lustro 平台具有高度可适应性，可推广应用于其他实验室自动化机器人、光照装置、微孔板读板仪、细胞类型以及光遗传系统，包括响应不同波长光的系统。
本方案演示了Lustro系统的设置及其在表征光遗传学系统中的应用。以光遗传学控制酵母中分裂转录因子为例，通过探....
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方案
本研究中使用的小鼠品系已在材料表中列出。这些品系在22 °C至30 °C的温度范围内表现出良好的生长能力，并可在多种标准酵母培养基中培养。
1. 设置自动化工作站
- 为自动化工作站配备能够移动微孔板的机器人抓手（RGA，参见材料表）（图1）。
- 将微孔板加热振荡器（参见材料表）安装至自动化工作站内（图1(1)），并配备自动锁板机构，以允许RGA进入。
- 将微孔板检测仪置于自动化工作站旁侧（图1(2)），确保RGA可顺利访问。
- 配置一个允许RGA便捷访问的微孔板照明装置（图1(3)），例如本研究所用的optoPlate8或LITOS9（参见材料表）。
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结果
图4A 显示了一株表达荧光报告蛋白的光遗传学菌株在时间进程中的荧光值，该报告蛋白由光诱导的分裂型转录因子调控。实验中使用了不同的光照条件，这些条件通过占空比的变化来体现，占空比表示光照开启时间所占的百分比。观察到整体荧光水平与光刺激的占空比成正比。图4B 展示了同一实验中对应的OD700 值。在不同光照条件下，光密度读数保持一致，表明该实验技术在不同光照条件下对菌株生长速率无显著影响。
通过随时间测量荧光和光密度，相较于仅在单个时间点获取输出结果的技术，能够更深入地理解光遗传系统对不同光刺激程序的响应。这种时间序列数据对于选择特定时间点以比较不同菌株和条件具有重要价值。 图5 展示了两种不同的光遗传学菌株在不同光刺激程序诱导下，于光照诱导10小时时单个时间点的测量结果。两种菌株均采用光诱导型分裂转录因子来驱动荧光报告蛋白的表达。光脉冲强度、周期和占空比的变化在这两种菌株中引发不同的响.......
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讨论
本文介绍的Lustro方案通过自动化细胞培养、光照和检测流程，实现了光遗传系统的高通量筛选与表征6。该方案通过将光照装置、微孔板读板仪和振荡装置整合到自动化工作站中，实现上述功能。本方案特别展示了Lustro在筛选整合于酵母S. cerevisiae中的不同光遗传元件以及比较不同光照诱导程序方面的应用价值。
本方案中强调的几个关键步骤对于有效使用Lustro至关重要。必须精心设计定制的光照程序，使其与所研究的光遗传学元件的动力学特性相匹配。此外，对酶标仪进行精确校准对于获得可靠的测量结果至关重要。在机器人平台上对实验进行充分的预演，包括进行必要的调整以确保与光照程序的正确同步，是确保实验脚本顺利运行的关键。
本实验方案描述了在不同光照刺激条件下，比较由光诱导型分裂转录因子驱动的荧光报告基因表达与非荧光对照的情况。每30分钟从微孔板的每个孔中采集一次荧光信号，在测量前先在加热振荡器上振荡1分钟。如本方案所示，Lustro适用于整合了蓝光响应型光遗传系统的非贴壁细胞.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 R35GM128873 和美国国家科学基金会资助项目 2045493（授予 M.N.M.）的支持。Megan Nicole McClean 博士获得了伯勒斯威康基金会在科学交叉领域颁发的职业发展奖。Z.P.H. 受美国国立人类基因组研究所对基因组科学培训项目 5T32HG002760 的培训资助支持。我们感谢 McClean 实验室成员的有益讨论，特别感谢 Kieran Sweeney 对本文手稿提出的修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带 #1.5 盖玻片的 96 孔玻璃底板 | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm（加热振荡器） | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent 自动化工作站 | Tecan | ||
| LITOS（替代照明装置） | Hohener 等，Scientific Reports，2022 | ||
| optoPlate-96（照明装置） | Bugaj 等，Nature Protocols，2019 | ||
| 机器人抓手机械臂 | Tecan | ||
| Spark（酶标仪） | Tecan | ||
| 合成完全培养基 | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect（用户提醒应用程序） | Tecan | ||
| yMM1734（BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 同源序列, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 同源序列 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5） | Harmer 等，ACS Syn Bio，2023 | ||
| yMM1763（BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 同源序列, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 同源序列 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5） | Harmer 等，ACS Syn Bio，2023 | ||
| yMM1765（BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 同源序列, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 同源序列 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5） | Harmer 等，ACS Syn Bio，2023 | ||
| YPD 琼脂 | SigmaAldrich | Y1500 |
参考文献
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....
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重印与许可
