本文介绍了一种从小鼠中分离和培养原代耳蜗毛细胞的详细方案。首先，在显微镜下从新生小鼠（3-5日龄）耳蜗中分离出柯蒂氏器。随后，通过酶消化法将组织解离为单细胞悬液，并在培养数天后通过免疫荧光鉴定细胞。
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本文内容
摘要
摘要
耳蜗毛细胞是听觉系统的感受器。这些细胞位于内耳骨迷路中的柯蒂氏器（Corti 器）内，柯蒂氏器是负责听觉的感官器官。耳蜗毛细胞在结构和功能上分为两种不同类型：外毛细胞和内毛细胞。任一类细胞受损均会导致听力损失。值得注意的是，内毛细胞无法再生，因此其损伤是永久性的。 体外 原代毛细胞的培养对于研究耳蜗毛细胞的保护或再生作用至关重要。本研究旨在探索一种分离和培养小鼠毛细胞的方法。
在手动去除耳蜗侧壁后，于显微镜下仔细将听觉上皮从耳蜗蜗轴分离，用含0.25%胰蛋白酶-EDTA的溶液在37 °C孵育10分钟，随后使用200 µL移液器枪头轻柔地悬浮于培养基中。细胞悬液经细胞滤器过滤，滤液离心后，将细胞接种于24孔板中进行培养。毛细胞的鉴定依据包括其表达机械转导复合物——参与产生运动张力的肌球蛋白-VIIa的能力，以及利用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行特异性标记。培养4天后，细胞融合度达到>90%。该方法有助于加深对体外培养毛细胞生物学特性的理解，验证耳蜗毛细胞培养的有效性，为后续听觉研究建立坚实的实验方法基础。
引言
耳蜗毛细胞在声音检测和向听觉神经传递信号方面发挥着重要作用。毛细胞是一种机械感受细胞，在脊椎动物中作为主要的感觉受体，将声波振动转化为电信号。哺乳动物内耳的听觉上皮由一排内毛细胞和三排外毛细胞组成。在基底膜的不同区域，毛细胞可感知不同频率的声音（20 至 2,000 Hz）1。外毛细胞的功能是一种主动的机械放大过程，有助于精细调节哺乳动物内耳，从而赋予其对声音的高度敏感性。内毛细胞则负责声音的检测。经过分级去极化后，声学信息通过听觉神经纤维传递至大脑2。
听力损失可能由遗传缺陷、衰老、噪声创伤或耳毒性药物的过度使用引起，这在全球范围内构成重大的健康问题3,4。听力损失主要源于毛细胞不可逆的损伤5。关于噪声性听力损失，尽管研究人员在其病因的多个细节上已达成共识，但对其众多潜在机制的全面理解仍显不足。外毛细胞尤其容易受到声音过度暴露的损害6。机械敏感性耳蜗毛细胞参与了年龄相关性听力损失的过程；然而，导致毛细胞退变的分子与细胞机制仍不清楚。多种分子过程的变化可导致毛细胞老化、氧化应激、DNA损伤反应、自噬以及与毛细胞特化相关的基因表达和转录调控失常
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方案
所有动物实验均经西安交通大学动物使用与护理委员会批准（批准号：2021-847）。
1. 灭菌与材料准备
- 使用高温高压蒸汽灭菌法对解剖工具进行灭菌，并在50 °C培养箱中过夜干燥。
- 提前配制100 mL含10%胎牛血清（FBS）和10 mg/mL青霉素/链霉素的培养基（将10 mL FBS和10 µL青霉素储备液加入90 mL杜氏改良伊格尔培养基（EMEM）中），并于4 °C保存。
2. 收集听觉上皮组织的颞骨解剖与摘除
- 在冰上通过断头法处死总共10只新生小鼠（年龄介于P3至P5之间）。如有需要，可采用其他经伦理批准的方法。
- 固定头部，沿矢状缝用显微手术剪刀切开头皮，并用手指将头皮向两侧分开并固定，如图1A所示。
- 使用小型骨膜剥离器取出脑组织，并将颅底一分为二。用剪刀剪开颅骨并向前翻折以打开颅腔；用剪刀尖刮除脑组织，暴露颅底。
- 观察颅底两侧的颞骨（图1C）。用剪刀沿颅底中线剪开，刮除皮肤，并去除多余骨组织（图1D、D'
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结果
按照本方案，我们接种了分离的细胞。若细胞在培养基中不漂浮，并在24小时内贴壁并铺展，则认为原代耳蜗毛细胞接种成功。我们在细胞贴附并铺展成扁平聚集体后，计数毛细胞数量。培养1天后，活的毛细胞已牢固贴附于培养皿底部，未贴壁的细胞通过PBS冲洗去除。通常情况下，培养3天后细胞数量增加一倍（图2）。
免疫荧光（IF）检测显示，肌球蛋白-VIIa 和鬼笔环肽的表达持续至第6天（图3A）。我们观察到，肌球蛋白-VIIa 的灰度值和阳性细胞比例随时间逐渐下降，而鬼笔环肽的灰度值和阳性细胞比例在培养后与第1天相比保持不变（图3B-D）。我们采用器官培养作为阳性对照，以验证肌球蛋白-VIIa 阳性细胞确为毛细胞。补充图S1 展示了培养2天后听觉上皮中肌球蛋白-VIIa（绿色）、鬼笔环肽（绿色）和4′6-二脒基-2-苯基吲哚.......
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讨论
与HEI-OC1细胞系相比，毛细胞的原代培养能更准确地模拟体内细胞的生理状态。因此，通过从耳蜗器官中分离活细胞并立即进行培养所建立的听觉系统原代培养方法，似乎是开展听觉系统广泛研究的一项重要工具。某些技术环节对于成功培养至关重要。首先，尽量缩短耳蜗器官从颞骨中分离出来的时间，有助于提高毛细胞持续存活的几率。因此，研究人员必须尽可能缩短解剖操作与将组织浸入PBS之间的时间间隔。根据我们的实验观察，解剖10只小鼠并同时获取20个内耳组织，大约需要2-3小时即可完成。在酶消化解离过程中，建议将总时间控制在12分钟以内，并在孵育8分钟后将耳蜗组织转移至移液器中。经过约10次吹打后，在显微镜下观察组织状态，当几乎所有细胞均已从基底膜上脱离时，即停止酶解过程；否则，需将组织放回培养箱继续孵育4分钟。抗生素的选择也十分重要。我们推荐使用10 mg/mL青霉素/链霉素，以预防潜在的污染问题，因为某些氨基糖苷类抗生素具有耳毒性，可能导致毛细胞死亡。
尽管VII类肌球蛋白在动物组织中广泛表达，但肌球蛋白-VIIa仅在内耳前庭和耳蜗器官的毛细胞中表达。VIIa类肌球蛋白在维持静纤毛结构方面发挥重要作用，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家自然科学基金（NFSC 82101224，项目负责人：YG）资助。 作者衷心感谢日本东京大学医学部耳鼻喉—头颈外科Teru Kamogashira博士（医学博士、哲学博士）在本研究中提供的关键性学术指导和概念性贡献。本研究的原始研究框架是在他的指导下建立的，他的深刻见解极大地影响了本工作的研究方向。我们对其持续的学术支持深表感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm BioLite 细胞培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 130182 | 用于培养 |
| 35 mm Nunc 细胞培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 150318 | 用于培养 |
| 6 孔板 | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | 用于培养 |
| 70 µm 细胞筛 | BD Company | 352350 | 用于过滤 |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | 免疫荧光染色 |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | 免疫荧光染色 |
| 出生后第 3–5 天的小鼠 | 由西安交通大学提供 | ||
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | 用于培养 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | 用于培养 |
| 镊子 | Dumont | 5# | 用于解剖 |
| Leica 解剖显微镜 | 德国 | S9i | 用于解剖 |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 用于培养 |
| 兔多克隆 Myosin VIIa 抗体 | Abcam company | ab92996 | 免疫荧光染色 |
| 剪刀 | Belevor | 10 cm/04.0524.10 | 用于解剖 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | 免疫荧光染色 |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | 用于培养 |
参考文献
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E.
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