本文提供了一种针对幼年美国西鲱进行声学微型发射器植入的优化操作流程。我们实验室研究的结果表明，这些标记技术可在幼年美国西鲱的野外研究中应用，并具有较高的存活率。
本文内容
摘要
摘要
利用遥测技术研究幼年美洲西鲱（Alosa sapidissima）在通过水电系统迁移过程中的行为与存活情况一直面临挑战，因为西鲱被普遍认为对操作处理极为敏感。本研究旨在建立一种使用新型微型声学发射器的标记方案，以尽量减少标记过程带来的不利影响，并最大程度提高幼年美洲西鲱标记后的存活率。研究表明，采用简单的胸鳍植入法标记西鲱时，减少离水操作时间，并在标记前后使用微咸盐水（7.5‰）处理，有助于提高其存活率。本方案提供了使用声学发射器标记幼年西鲱的详细分步操作流程。在实验室条件下饲养60天后，采用该流程标记的鱼类存活率为81.5%，而未标记对照组的存活率为70%。本研究建立的有效标记与操作方法可应用于幼年西鲱及其他敏感物种的野外遥测研究。
引言
美洲西鲱（Alosa sapidissima）是一种原产于美国东海岸的溯河产卵鱼类。由于栖息地减少以及水电站的大量建设，导致其原生分布区内的种群数量显著下降1,2。幼年西鲱及其他鲱形鱼类在向海洋迁徙的过程中，经过水电设施时可能特别容易受到伤害甚至死亡3,4,5。了解幼年西鲱在水电站的通过率和存活率，对于这些设施的重新许可审批以及该物种的恢复工作至关重要。然而，目前尚缺乏有效的标记技术来评估美洲西鲱在向海洋迁徙过程中的通过率和存活率。用于遥测研究的西鲱标记个体应能代表未标记的目标种群，且不应因标记物或标记过程而受到负面影响6,7。
为了提高对幼年西鲱的追踪能力，美国西北太平洋国家实验室（PNNL）开发了一种新型声学微型发射器，用于研究美洲西鲱及其他具有类似侧扁体型的鱼类。研究美洲西鲱及其他鲱科鱼类时，一个常见的挑战是，相较于其他鱼类，这些鱼类对操作、运输和标记更为敏感。例如，Raquel 等人8发现，在其研究中，幼年美洲西鲱在操作和卡车运输过程中的死亡率始终高于其他五种幼鱼。在少数已发表的针对幼年美洲西鲱标记的研究中，报道的存活率差异较大，标记后7天的存活率低至2%9，而标记后48小时的存活率则高达100%10，但关于标记后幼鱼的长期存活情况及发射器保留率的信息仍十分有限。
成功处理和标记美洲西鲱等敏感物种所面临的挑战，凸显了人们对这类物种的迁徙、行为及栖息地利用等方面的知识仍存在空白。若能追踪其通过水电站大坝的移动情况，将极大促进对美洲西鲱通过率和存活率的理解，有助于指导现有水电设施的管理决策，并推动设计出对以往未充分研究的鱼类物种及其生活阶段影响更小的新系统。随着新型发射器技术的发展，了解发射器本身及标记过程对鱼类的影响至关重要，以最大限度减少偏差，准确评估其通过率和存活率。本研究的目标是评估幼年美洲西鲱在植入新型声学微型发射器后的60天存活率，并制定一套处理与标记操作规程，以降低标记对西鲱的负面影响，使其表现更接近未标记个体。
方案
PNNL 获得实验动物照护评估与认证协会的认证。美国西鲱的处理遵循联邦政府关于实验动物照护与使用的指导方针11，本研究的实验方案均符合并经 PNNL 机构动物照护与使用委员会批准。
1. 准备标签后恢复装置
- 当无法 readily 获得半咸盐水（7.5 ppt）时，可在放流前使用静态系统暂养西鲱 1 至 2 天，并确保适当曝气和水体循环（图 1）。
- 在静态圆形水箱中安装气升式系统以提供曝气。将一根 PVC 管连接至水箱侧壁，使一个三通接头位于顶部，另一个三通接头靠近中部，管底则螺纹连接一个带筛网的接头。
- 随后，将气石连接至压缩空气管路，并将气石置于管底靠近筛网处。
注意：筛网可防止鱼类游入气升系统。 - 向水箱中注入淡水，直至气升系统的出水口（中部 PVC 三通）约有一半浸没于水中，然后关闭进水。
- 接着，打开气源并逐步增加供气量，直至从出水口流出的充气水体形成定向水流，供鱼类定向游动。
- 加入商用海盐，配制成 7.5 ppt 的半咸盐水溶液，并搅拌至完全溶解。
2. 盐水鱼源桶和盐水麻醉液的制备
- 每0.5升水中称取7.5克海盐，倒入桶中并溶解。
注意：在步骤3.5中，将含有鲱鱼的等体积淡水加入，以获得最终浓度为7.5 ppt的溶液。 - 在另一个桶中，每升水中称取并溶解7.5克海盐。
- 每升盐水中加入120 mg三卡因甲磺酸盐（MS-222）和120 mg碳酸氢钠作为缓冲剂。
- 向麻醉用桶中补充空气。
3. 通过淡水至咸淡水的水对水转移收集西鲱
- 用淡水部分装满另一个水桶，并将其侧放至预标记的水源池中。
- 使用网具或手轻轻引导鲱鱼游入水桶中。
- 当适量的鱼进入水桶后，将水桶竖直 upright，并用带孔的盖子固定。
- 通过盖子倒出多余的水，使鱼保留在目标量的淡水中（即最终7.5 ppt盐水水桶体积的一半）。
- 将鲱鱼和淡水轻轻倒入步骤2.1中准备好的盐水水桶中。
注意：最终盐度为7.5 ppt。 - 使用水族箱气泵和气石为预标记鱼所在的水桶提供额外供气，以维持溶解氧在可接受水平（>90%饱和度为理想状态）。
4. 在鲱鱼体内植入声学发射器
- 使用70%乙醇对发射器消毒20分钟，使用前用无菌水冲洗。
- 使用带有光滑超细网眼（约0.4 mm）的抄网，将鱼从来源桶中捞出并放入麻醉桶中。鲱鱼应在约2–3分钟内失去平衡和脊髓反射，具体时间取决于水温和其他水质参数。
- 当鱼完全麻醉至第四阶段12时，用手套包裹的手轻轻将鱼放置在湿润的测量板上，测量其体长。
- 将鱼移至置于已去皮重天平上的盛水称量舟中，测量其体重。
- 记录体长和体重、声学标签编号，以及标记前有关鱼体状况的任何备注，例如鳞片脱落或出血情况。
- 将鱼放入装有麻醉海水的转移容器中，并连同声学发射器一起送至鱼类外科操作人员。
- 将鱼左侧朝下放置在预先开有V形槽的湿润防水泡沫垫上（图2A）。
注：V形槽可防止鱼在操作过程中过度滑动，并使水聚集在鱼口部周围，以便其主动将水吸入并流经鳃部。 - 通过连接重力供水储水罐的管路，向鱼的口部持续供应新鲜水。
- 使用已消毒或全新的#11不锈钢手术刀片，在胸鳍远端附近肌节之间垂直做一道3 mm长的切口。
- 如需要，若鱼鳞阻碍刀尖接触皮肤，可先将该处鳞片小心移除。
- 小心将发射器插入切口，并向后推送，直至整个标签完全进入体腔内（图2B）。
- 如需要，可用手术刀的钝端（或尖头镊子）小心将标签完全推入。
- 将已标记的鱼放入盛有7.5 ppt盐水并充气的小型容器中，使其从麻醉状态中恢复。
- 当鱼恢复平衡后，将其从恢复容器中进行“水对水”转移至含有7.5 ppt盐水的标记后暂养池中。
- 在释放前，让已标记的鱼在盐水中恢复1–2天。
结果
为评估对幼年西鲱进行标记的有效性，共开展了两轮标记试验——2020年的初步试验和2021年的长期暂养研究。2020年11月，在PNNL开展了初步的实验室评估，以确定使用新型声学微型发射器对美洲西鲱进行植入标记的最佳方法。将四种原型发射器设计（n = 4，P1-P4）分别与四种不同的标记位置（胃部、胸鳍、腹鳍和背鳍）组合，共形成4种独特的声学发射器-标记位置处理方案（每种处理 n = 40 条鱼，表1）。所有试验鱼随机分配至各处理组及暂养水箱中。每条处理组的鱼均等分为两组，分别置于两个暂养水箱中（即每个水箱中每种处理组各20条鱼），暂养期为14天。在试验前两天，西鲱被饲养于盐度为7.5 ppt的半咸水中，以恢复标记和操作造成的应激。随后，在试验剩余期间，水箱切换为流水式淡水环境。
初步评估中，标记鱼和剪鳍对照组的叉长范围为 50–80 mm。与采用其他标记技术相比，通过胸鳍切口植入标记的幼年西鲱存活率和标记保留率最高（图 3）。额外的预实验评估还表明，在标记等应激事件前后，采用水中转移和将鱼暂养于咸淡水中的操作技术，对提高存活率至关重要。
采用初步评估中成功的标记与操作方案，2021年在美国西北太平洋国家实验室（PNNL）开展了一项实验室研究，旨在评估通过胸鳍切口标记法植入声学发射器的幼年美洲西鲱在60天内的长期存活率及标记保留率。该长期评估使用了模拟发射器P5（图 4），一种在形状和尺寸上与初步评估中使用的P1设计相似的改进型原型设计。假P5标签的平均尺寸和重量为长7.6 mm、直径2.3 mm，空气中重量为0.058 g（标准差0.002 g），由此产生的标签负担为 <1%。带有功能组件的原型声学发射器（图4尺寸为 7.6 mm 长 × 2.0 mm 直径，空气中重量为 0.050 g。
用于长期评估的幼年美国西鲱在测试时已在人工养殖条件下饲养了4个月。尽管实验设计为在两个水箱中分别饲养数量相等的处理组和对照组鱼类，为期60天，但在标记时剩余的西鲱数量较少。因此，为了更全面地评估标记技术对西鲱的长期有效性，随机分配到标记处理组的西鲱数量多于对照组。每个水箱中包含27条处理组鱼和9至10条对照组鱼。然而，由于A水箱的存活率（13.8%）显著低于B水箱（78.4%；Fisher精确检验，p < 0.001），且每个水箱内标记组与对照组之间的存活率无显著差异，因此本文仅报告B水箱的结果。
美国西鲱（叉长 69-105 mm；体重 3.9-11.7 g）采用胸鳍切口法植入 P5 发射器进行标记（n = 27），或被分配至对照组（n = 10）。对照组鱼类接受相同的操作流程，包括在手术垫上放置约 20 秒，但不进行鳍条剪取、切口操作，也不植入发射器。标记后，两组鱼类均在盐度为 7.5 ppt 的半咸水中饲养 1 天，随后转为流水式河水环境，直至实验结束。标记组在 60 天时的存活率为 81.5%，未标记对照组为 70%（图 5）。在本项评估中，标记鱼的存活率定义为存活且保留发射器，因为在遥测研究中无法区分发射器排出与死亡事件。两组之间的存活率差异无统计学显著性（Fisher 精确检验，P = 0.884）；然而，由于样本量较小，检测差异的统计效能仅为 38.4%。尽管检测处理间差异的效能较低，长期评估结果表明，该操作与标记方案可用于将声学发射器植入美国西鲱，且具有中等程度的成功率。
图1：充满微咸盐水的标记后恢复鱼缸。 气升式系统为静置水箱提供氧气。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2： 幼年美洲西鲱的声学发射器植入。 幼年美洲西鲱（A）显示胸鳍处的切口，以及（B）假P5发射器已插入切口。注意，西鲱的口部部分浸没在从蓝色导管流出的水中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3: 在为期14天的初步评估中，一组未标记对照组和四组标记的幼年美洲西鲱的存活率百分比。 标记处理包括四个标记位置（胃部、胸部、骨盆部和背部），每个位置分别与一种独特的发射器原型（P1-P4）配对。标记鱼的存活定义为鱼体存活且标记保留。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：用于标记幼年美洲鲥鱼的声学发射器与假标签。（A）功能性声学微型发射器；（B）用于60天实验室存活率研究的P5型假标签原型。注意标尺上的数字4-7代表厘米。请点击此处查看此图的放大版本。
图5: 美国西鲱在为期60天的长期保活饲养研究中的存活率 幼年西鲱分为未标记组（未标记对照组；实线）和标记组（标记组[胸鳍P5]；虚线），标记组使用了模拟发射器。标记组的存活率定义为存活且标记物保留。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 标签类型 | 标签位置 | N | 叉长（mm） | 平均标签重量（标准差；g） | 标签负担（%） | 存活率（%） | 平均贴标/夹标时间（s） | |
| 范围 | 均值（标准差） | |||||||
| P1 | 胃部 | 40 | 50 - 76 | 60 (6.0) | 0.058 (0.003) | 1.5 - 5.2 | 45 | 12 |
| P2 | 胸鳍 | 40 | 50 - 78 | 60 (7.3) | 0.039 (0.001) | 1.0 - 3.2 | 80 | 23 |
| P3 | 腹鳍 | 40 | 50 - 70 | 58 (5.3) | 0.039 (0.001) | 1.0 - 4.1 | 55 | 26 |
| P4 | 背鳍 | 40 | 50 - 80 | 61 (6.8) | 0.088 (0.004) | 0 | 60 | 57 |
| 对照 | 无（夹具） | 40 | 50 - 80 | 59 (5.7) | 无 | 0 | 92.5 | 14 |
表1：在初步评估中植入原型发射器（P1-P4）或以上尾叶和下尾叶鳍剪标记（对照组）的美国鲥鱼的标记与存活信息。 对照组的标记位置不适用（NA），因为这些鱼仅接受了鳍剪标记（Clip）。注意，P4型标记为中性浮力设计。平均值的标准差（SD）列于括号中。
讨论
研究幼年美洲西鲱在水电设施周围活动的需求，推动了一项操作与标记方案的制定，以提高标记后西鲱的存活率。在PNNL，最初尝试在不使用盐水的情况下将新型声学发射器植入幼年西鲱体内，结果在24小时内导致100%的死亡率。随后精心制定的操作与标记方案表明，美洲西鲱可以成功植入声学微型发射器，并在实验室条件下长期饲养，且存活率较高（81.5%）。减少离水操作时间，以及在标记前后使用半咸盐水，是成功标记幼年美洲西鲱的关键因素。
在初步评估中，使用四种植入方法对体长小至50 mm的西鲱进行了假发射器标记。胃标记法是标记成年西鲱最常用的方法之一13,14,15，在预试验中结果良好，但在初步评估期间标签脱落率较高。通过腹鳍切口植入的方法已成功用于研究成年滩栖西鲱的移动行为16，而背侧附着法已被用于幼年美洲西鲱的短期监测10。最近，通过胸鳍切口植入标签的方法被用于研究成年西鲱在河流和海洋环境中的长期移动情况17。在PNNL进行的初步评估中，胸鳍切口位置的表现优于其他三个评估位置，标记后7天的存活率超过90%。
总体而言，这些评估结果表明，在声学发射器电池寿命之外的时间段内，标记鲥鱼的存活率与未标记鲥鱼的存活率相当。该声学发射器预计工作时间约为30天，每5秒发射一次声学信号。
这种发射器设计和标记方案在野外应用中对研究体型较小、敏感且濒危的鱼类（如美国西鲱）展现出巨大潜力，使研究人员能够获取鱼类在水电设施附近活动的宝贵信息。例如，该标记技术将应用于即将开展的野外研究，以观察携带声学标记的幼年西鲱在接近水电站溢洪道和发电厂房时的行为。通过河流中的研究获得的结果可为这些设施的管理决策提供更科学的依据，并有助于保护该物种在其幼年阶段的生存。未来的研究应评估该方法在野外条件下对随流鱼类进行标记和追踪的有效性。此外，这些技术可轻松推广应用于将西鲱或其他敏感物种植入被动集成应答器（PIT）标签，从而实现对其整个生活史的长期监测。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国能源部（DOE）水力发电技术办公室资助。实验室研究在PNNL进行，PNNL由Battelle为美国能源部依据合同DE-AC05-76RL01830运营。作者谨此感谢美国能源部的Dana McCoskey和Tim Welch，PNNL的Eric Francavilla、Ryan Harnish、Huidong Li、Stephanie Liss、Brian Mason、Megan Nims、Brett Pflugrath和Ashlynn Tate在研究和论文撰写过程中提供的协助，以及美国陆军工程兵团和太平洋沿岸各州海洋渔业委员会在收集幼年西鲱方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #11 不锈钢手术刀片 | Exel | 29502 | 购自 Med-Vet International；刀片供应商无特殊偏好 |
| #11 不锈钢手术刀片 | Miltex | MIL4-311 | 购自 Med-Vet International；刀片供应商无特殊偏好 |
| 2 加仑桶 | Leaktite | #2GL White Pail | |
| 美洲西鲱声学发射器 | 太平洋西北国家实验室 | 专利申请中 | BattelleIPID: 32500 |
| 气石 | Pentair | AS3 | |
| 水族箱空气泵 | Tetra | Whisper | |
| 溶解氧测定仪 | YSI | ProODO 或 ProSolo | |
| 乙醇 | Decon Laboratories | 2805HC | |
| 细网网兜 | Blue Ribbon | ABLEC8 | |
| 鱼类暂养箱 | Reiff Manufacturing | NA | 圆形水产养殖箱 |
| 泡沫园艺护膝垫 | Tommyco | 12003 | |
| 塑料储物盒 | Ziploc | 已停产；带盖 8 盎司容器 | |
| PVC 胶水 | Oatey | 30821 | |
| PVC 管 | Charlotte Pipe | NA | PVC Schedule 40 2" 直径 |
| PVC 底漆 | Oatey | 30757 | |
| PVC 三通接头 | Charlotte Pipe | NA | 2" PVC Schedule 40 S x S x S 三通接头 |
| 海盐 | InstantOcean | SS15-10 | |
| 硅胶管 3/16" | Pentair | tp30s | 标记过程中用于供水的管路 |
| 碳酸氢钠 | Fisher Chemical | S233-500 | |
| 无菌水 | NA | NA | 通过高压灭菌器对水进行灭菌 |
| 三卡因甲磺酸盐 | Syndel USA | 15650 | |
| 通气管路 | Hydromaxx | 1403038050 |
参考文献
- Dadswell, M. J., Rulifson, R. A. Macrotidal estuaries: A region of collision between migratory marine animals and tidal power development. Biological Journal of the Linnean Society. 51, 93-113 (1994).
- Limburg, K. E., Waldman, J. R. Dramatic declines in North Atlantic diadromous fishes. BioScience. 59, 955-965 (2009).
- Castro-Santos, T., Mulligan, K. B., Kieffer, M., Haro, A. J. Effects of plunge pool configuration on downstream passage survival of juvenile blueback herring. Aquaculture and Fisheries. 6 (2), 135-143 (2021).
- Dubois, R. B., Gloss, S. P. Mortality of juvenile American shad and striped bass passed through Ossberger crossflow turbines at a small-scale hydroelectric site. North American Journal of Fisheries Management. 13 (1), 178-185 (1993).
- Pflugrath, B. D., et al. The susceptibility of Juvenile American shad to rapid decompression and fluid shear exposure associated with simulated hydroturbine passage. Water. 12 (2), 586(2020).
- Brown, R. S., et al. An evaluation of the maximum tag burden for implantation of acoustic transmitters in juvenile Chinook salmon. North American Journal of Fisheries Management. 30 (2), 499-505 (2010).
- Skalski, J. R., et al. Status after 5 years of survival compliance testing in the Federal Columbia River Power System (FCRPS). North American Journal of Fisheries Management. 36 (4), 720-730 (2016).
- Raquel, P. F. Effects of handling and trucking on chinook salmon, striped bass, American shad, steelhead trout, threadfin shad, and white catfish salvaged at the John E. Skinner delta fish protective facility (Vol. 19). Interagency Ecological Study Program for the Sacramento-San Joaquin Estuary. , (1989).
- Kleinschmidt, G., Sullivan, E. Aquacoustics. Relicensing Study 3.3.3. Evaluate downstream passage of juvenile American Shad. Interim Study Report: Northfield Mountain Pumped Storage Project (No. 2485) and Turners Falls Hydroelectric Project (No. 2485) and Turners Falls Hydroelectric Project (No. 1889). FirstLight. , (2016).
- Heisey, P. G., Mathur, D., Rineer, T. A reliable tag-recapture technique for estimating turbine passage survival: application to young-of-the-year American shad (Alosa sapidissima). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 49, 1826-1834 (1992).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.: Eighth Edition. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Summerfelt, R. C., Smith, L. C. Anesthesia, surgery, and related techniques. Methods for Fish Biology. Schreck, C. B., Moyle, P. B. , 213-263 (1990).
- Bailey, M. M., Isely, J. J., Bridges, W. C. Jr Movement and population size of American shad near a low-head lock and dam. Transactions of the American Fisheries Society. 133 (2), 300-308 (2004).
- Grote, A. B., Bailey, M. M., Zydlewski, J. D. Movements and demography of spawning American Shad in the Penobscot River, Maine, prior to dam removal. Transactions of the American Fisheries Society. 143 (2), 552-563 (2014).
- Harris, J. E., Hightower, J. E. Movement patterns of American shad transported upstream of dams on the Roanoke River, North Carolina and Virginia. North American Journal of Fisheries Management. 31 (2), 240-256 (2011).
- Bolland, J. D., et al. Refinement of acoustic-tagging protocol for twaite shad Alosa fallax (Lacépède), a species sensitive to handling and sedation. Fisheries Research. 212, 183-187 (2019).
- Gahagan, B. I., Bailey, M. M. Surgical implantation of acoustic tags in American Shad to resolve riverine and marine restoration challenges. Marine and Coastal Fisheries. 12 (5), 272-289 (2020).
重印与许可
标签
