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方法文章

从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

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DOI:

10.3791/65698

2023年9月1日

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞(iPSCs)高效生成肾类器官的全面方法。本研究的重点在于确定初始细胞密度和WNT激动剂浓度,从而为对肾类器官研究感兴趣的科研人员提供参考。

摘要

可通过多种方法从诱导性多能干细胞(iPSCs)生成肾类器官。这些类器官在疾病建模、药物筛选以及潜在的治疗应用方面具有广阔前景。本文介绍了一种从iPSCs逐步生成肾类器官的操作流程,起始于后部原始条纹(PS),进而诱导为中间中胚层(IM)。该方法依赖于APEL 2培养基,这是一种成分明确且不含动物源成分的培养基。培养过程中,首先添加高浓度的WNT激动剂(CHIR99021)处理4天,随后加入成纤维细胞生长因子9(FGF9)/肝素及低浓度CHIR99021继续培养3天。在此过程中,特别强调在iPSC起始阶段选择最佳的细胞密度和CHIR99021浓度,因为这些因素对成功生成肾类器官至关重要。本实验方案的一个重要环节是在低黏附培养板中进行悬浮培养,使中间中胚层逐步发育为包含肾小球、近端小管和远端小管结构的肾单位结构,并以直观易懂的可视化形式呈现。总体而言,该详细实验方案提供了一种高效且特异的技术,可用于从多种iPSC系生成肾类器官,确保实验结果的成功性和可重复性。

引言

肾脏在维持生理稳态中发挥关键作用,其功能依赖于基本功能单位肾单位。肾单位能够排泄代谢废物,并调节体液成分。由遗传性突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病(CKD)最终将进展为终末期肾病(ESKD)。1,2. 终末期肾病显然源于肾单位有限的再生能力,因此需要进行肾脏替代治疗。人诱导多能干细胞的定向分化使得 体外 生成患者特异性的三维肾脏类器官,可用于研究肾脏发育、构建患者特异性疾病模型以及进行肾毒性药物筛选3,4.

在胚胎发育过程中,肾脏起源于中间中胚层(IM),而中间中胚层由原条(PS)分化而来。经典的WNT信号通路可能在FGF(FGF9、FGF20)和BMP(通过JNK通路的Bmp7信号)的协同作用下,进一步诱导IM的分化5,6,7。这些信号通路产生两种重要的肾祖细胞(NPC)群体:输尿管芽(UB)和后肾间充质(MM),分别形成集合管和肾单位8,9。每个肾单位由肾小球和肾小管节段组成,包括近端小管、远端小管以及亨利氏袢10,11。根据上述理论,目前发表的实验方案通过模拟信号级联反应和生长因子刺激,以诱导生成肾脏类器官5,12

近年来,已开发出多种将人iPSCs分化为肾类器官的方案5,6,7,12。Takasato等7优化了在替换为FGF9之前使用CHIR(WNT激动剂)处理的时间。根据其方案,在iPSCs中诱导中间中胚层(IM)最有效的方法是使用CHIR处理4天,随后使用FGF9处理3天。他们在实验中采用Transwell滤膜作为培养体系;然而,该方法对初学者而言较难掌握。因此,Kumar等13尝试改变培养方式,选择了悬浮培养。他们在第7天将贴壁细胞解离,并接种至低黏附培养板中,以促进其自组装形成包含肾单位样结构的拟胚体(EBs)。然而,这些方法的批次效应较为明显,尤其是在不同iPSC系之间。此外,不同文献报道的CHIR浓度也存在差异,范围从7 µM到12 µM不等5,13,14

我们推测,细胞密度和CHIR的浓度可能影响不同iPSCs类器官的生成,这一假设已在我们的多次实验中得到验证。本方案对Kumar等人的研究方法13进行了轻微修改,并为使用者提供了逐步操作流程。该方法的时间安排和示意图见图1

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方案

本研究使用的诱导多能干细胞(iPSCs)购自商业来源。细胞在商品化的基底膜基质包被的培养板上,使用mTeSR培养基进行维持培养(参见材料表)。表1列出了本研究中使用的所有培养基成分。

1. 铺板iPSC细胞以进行分化并诱导后部原始条纹(PS)

  1. 用 2 mL DPBS 清洗膜基质包被的 6 孔板中的 iPSCs。使用移液器吸除 DPBS。
  2. 加入1 mL市售的细胞解离溶液(参见 材料表) 以解离iPSCs,并于37 °C孵育5 min。
  3. 加入1 mL mTeSR至iPSCs中,并确保细胞已从塑料培养表面脱落。
  4. 以 400 x g 离心细胞 g 室温(RT)孵育3分钟。重悬细胞沉淀,使用血细胞计数板计数细胞数量。
  5. 在已包被基底膜基质的24孔板或6孔板中接种不同密度的细胞,并使用添加了10 µM Rho激酶抑制剂(Y-27632)的mTeSR培养基进行培养(参见 材料表)。在37 °C CO₂培养箱中培养过夜2 培养箱
    注意:不同iPSC细胞系诱导PS时,CHIR99021的最佳浓度和适宜的细胞密度各不相同。建议接种一系列不同密度(例如,0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 × 10⁵)3 每平方厘米单个细胞)以及7 µM–12 µM浓度范围的CHIR99021。在同一天开始对每种细胞密度和每种CHIR浓度进行诱导分化。在24孔板中确定CHIR99021的最佳浓度和合适的细胞密度,然后在6孔板中扩大培养。本文提供的方案基于6孔板。
  6. 次日,吸除 mTeSR 培养基,并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。
  7. 加入2 mL第一阶段培养基(含8-12 µM CHIR99021的干细胞分化培养基)(表1),记为第0天。
  8. 在37 °C培养箱中培养4天,每两天更换一次I期培养基。

2. 诱导生肾中间中胚层(IM)

  1. 第4天,移除第一阶段培养基,并用2 mL DPBS洗涤。
  2. 向细胞中加入2 mL第二阶段培养基(含200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素和1 µM CHIR99021的干细胞分化培养基)(表1)。
  3. 在37 °C培养箱中培养,并每隔2天更换一次培养基,直至第7天。

3. 在悬浮培养中生成肾类器官

注意:在第0天至第7天的观察期间,细胞状态至关重要。若细胞表现出成功扩增且聚集成堆,且无明显细胞碎片,则表明中间中胚层(IM)已成功诱导,提示可进入下一阶段。然而,若细胞出现早期凋亡,继而发生坏死或破裂,则可能提示CHIR99021浓度或细胞密度不适宜。

  1. 第7天,移除第二阶段培养基,并用2 mL DPBS洗涤细胞。
  2. 向每孔加入1 mL细胞解离溶液,在37 °C孵育5分钟,直至在相差显微镜下观察到细胞变圆发亮。
  3. 用移液器向细胞中加入1 mL第二阶段培养基,混匀,确保细胞已从培养表面脱离。
  4. 将细胞悬液收集至15 mL离心管中,在室温下以400 × g离心3分钟。
  5. 弃去上清液,将细胞沉淀重悬于2 mL第三阶段培养基中(含200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素、1 µM CHIR99021的干细胞分化培养基,溶于0.1%甲基纤维素(MC)和0.1%聚乙烯醇(PVA)中),并补充10 µM Rho激酶抑制剂(Y-27632)(见材料表),轻轻混匀。
  6. 混匀细胞悬液后,按1:3的比例接种至6孔低黏附培养板中。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱内的轨道摇床上(耐CO2,转速60 rpm)。
  7. 24小时后,移除Rho激酶抑制剂(Y-27632),更换为第三阶段培养基(干细胞分化培养基补充200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素、1 µM CHIR99021、0.1% MC、0.1% PVA)。继续培养2天。按照以下步骤更换悬浮培养中的培养基:
    1. 使用无菌剪刀剪去1 mL移液枪头的尖端。
    2. 轻轻摇动6孔板,使类器官聚集于孔中央。
    3. 用准备好的移液枪将类器官吸至15 mL离心管中,静置5分钟。
    4. 吸走上清液,保留类器官于管底。
    5. 加入新鲜培养基重悬类器官,并重新接种回6孔低黏附培养板中。
  8. 继续在培养箱中以60 rpm振荡低黏附培养板。每隔两天更换一次第三阶段培养基,直至第12天。
  9. 第12天,将培养基更换为第四阶段培养基(含0.1% MC和0.1% PVA的干细胞分化培养基)。
  10. 每隔两天更换一次培养基,直至第25天。类器官可在第12至25天期间逐渐发育为成熟的肾单位结构。

4. 肾类器官的免疫荧光染色

  1. 将肾类器官收集至15 mL离心管中,并用2 mL PBS洗涤。
  2. 静置5–10分钟后,用新鲜配制的2%多聚甲醛(PFA)在4 °C固定肾类器官20分钟。
  3. 去除PFA,加入含0.3% Triton X-100的PBS(0.3% PBST)1 mL洗涤类器官,在摇床上均匀振荡(转速不超过60 rpm)8分钟,静置5分钟后吸去上清液。重复此步骤三次。
    注意:类器官可在4 °C条件下保存于0.3% PBST中2–4周。
  4. 将固定的类器官与含10%驴血清的PBST(封闭液)(见材料表)在4 °C孵育过夜。
  5. 用封闭液按1:300比例稀释一抗(见材料表)。
  6. 将类器官与一抗在4 °C条件下避光孵育过夜,并持续振荡。
    注意:确保同一类器官中的肾小球和肾小管可同时被染色。
  7. 用1 mL 0.3% PBST洗涤类器官,在摇床上均匀振荡(转速不超过60 rpm)8分钟,静置5分钟后吸去上清液。重复此步骤三次。
  8. 将类器官与二抗(见材料表)及DAPI在4 °C避光孵育过夜,并持续振荡,随后重复步骤4.7。
    注意:二抗和DAPI均用封闭液稀释,二抗稀释比例为1:400,DAPI为1:1000。
  9. 染色完成后,依次用甲醇(25%、50%、75%和100%,每步5分钟)对类器官进行脱水处理,然后用苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液(BABB,1:2)通透5分钟(见材料表)。
  10. 将透明化处理后的类器官置于玻璃底培养皿(见材料表)中,使用共聚焦显微镜观察。
    ​注意:成像时应选择底部为玻璃的培养皿;通透时可直接将BABB加入培养皿中,以保持皿底湿润。

5. 体外 葡聚糖摄取实验

  1. 第25天,在37 °C、5% CO2的培养箱中,用100 µg/mL的荧光标记葡聚糖(参见材料表)孵育类器官4小时。
  2. 4小时后,更换新鲜培养基,并使用宽场荧光显微镜拍摄活细胞培养图像。

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结果

通过使用GSK3抑制剂CHIR99021激活经典的WNT信号通路,随后加入FGF9/肝素,可实现IM的生成。从第0天到第4天,iPSC迅速扩增,并呈现菱形或三角形形态。细胞融合度在第7天达到90%–100%,并均匀累积。在悬浮培养后,细胞团于第7天解离后自发形成肾单位结构。通过悬浮培养生成的肾类器官呈现出类似小管的结构,在聚集培养18天后可通过明场图像轻松观察到(图2图3)。

通常,从一个24孔板中的iPSCs孔开始进行一次实验,可获得200–300个类器官。其中80%–90%含有类似肾单位的结构(图2)。对于hiPSC-B1 iPSC细胞系,生成肾脏类器官的最佳条件是在24孔板的一个孔中培养1.8–2.0 × 104个细胞,并使用8 µM CHIR99021(图2图3

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讨论

本文详细描述了由iPSCs生成肾类器官的实验方案,涉及基础培养基、初始细胞密度以及CHIR99021浓度的微小调整。在多项实验中,成功生成肾类器官的关键因素被确定为中间中胚层(IM)的初始分化以及第7天时的细胞状态。此外,不同的iPSC细胞系在细胞增殖能力和分化潜能方面存在差异,导致其最佳细胞密度和CHIR99021浓度各不相同5,13,14。因此,确定每种iPSC细胞系的理想培养条件,对于从患者特异性iPSCs中大量生成肾类器官至关重要。

为了确定最佳条件,建议先使用24孔板进行预实验,再将培养规模扩大至6孔板以进行更大规模的生产。此步骤可使研究人员根据细胞形态和数量评估诱导效果。此外,类器官在固定后可保持其完整结构长达2至4周,从而提高了该方法的可行性和实用性。

采用本方案生成的肾类器官通常直径约为50–300 µm,在明场显微镜下可观察...

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披露

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

我们非常感谢毛和胡实验室所有过去和现在的成员,感谢他们对本项目提出的富有启发性的讨论和重要贡献。感谢中国国家儿童健康临床研究中心给予的大力支持。本研究由国家自然科学基金(项目编号 U20A20351,负责人:Jianhua Mao;项目编号 82200784,负责人:Lidan Hu)、浙江省自然科学基金(项目编号 LQ22C070004,负责人:Lidan Hu)以及江苏省自然科学基金(项目编号 BK20210150,负责人:Gang Wang)提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔细胞培养板,平底NESTCat #701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat #07920
抗体
苯甲醇Sigma-AldrichCat #100-51-6
苯甲酸苄酯Sigma-AldrichCat #120-51-4
生物安全柜HaierCat #HR40 figure-materials-1 A2
生物素标记抗人LTL抗体(1:300)Vector LaboratoriesCat #B-1325
人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞hiPS-B1(iPSc,女性)N/AN/A
二氧化碳振荡培养箱HAMANYCat #C0-06UC6
化学品、多肽及重组蛋白
CHIR99021(Wnt通路激活剂)STEMCELL TechnologiesCat #72054
Costar 多孔6孔细胞培养板CorningCat #3516
Costar 超低吸附6孔板CorningCat #3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat #07930
DAPI染色液CoolaberCat #SL7102
葡聚糖,Alexa Fluor 647标记Thermo SCIENTIFICCat #D22914
DMEM/F-12(无HEPES)ServicebioCat #G4610
驴抗羊IgG H&L(Alexa Fluor 647标记)AbcamCat #ab150179
驴血清封闭液MeilunbioCat #MB4516-1
D-PBS(无钙、无镁、无酚红)Solarbio Life ScienceCat #D1040
干式恒温培养器上海精芯Cat #JX-10
Dylight 488标记山羊抗小鼠IgG(1:400)EarthoxCat #E032210
Dylight 488标记山羊抗兔IgG(1:400)EarthoxCat #E032220
Dylight 549标记山羊抗小鼠IgG(1:400)EarthoxCat #E032310
Dylight 549标记山羊抗兔IgG(1:400)EarthoxCat #E032320
Dylight 649标记山羊抗兔IgG(1:400)EarthoxCat #E032620
实验模型:细胞系
Forma Steri-Cycle CO2 培养箱Thermo SCIENTIFICCat #370
Geltrex LDEV-FreeGibcoCat #A1413202
玻璃底培养皿NESTCat #801002
山羊抗人CUBN抗体(1:300)Santa Cruz BiotechnologyCat #sc-20607
肝素溶液(细胞培养添加剂)STEMCELL TechnologiesCat #07980
人重组FGF-9STEMCELL TechnologiesCat #78161
倒置显微镜OLYMPUSCat #CKX53
激光扫描共聚焦显微镜OLYMPUSCat #FV3000
甲基纤维素Sigma-AldrichCat #M7027
微量离心机HENGNUOCat #2-4B
小鼠抗人CD31抗体(1:300)BD BiosciencesCat #555444
小鼠抗人ECAD抗体(1:300)BD BiosciencesCat #610182
小鼠抗人整合素β1抗体(1:300)AbcamCat #ab30394
小鼠抗人MEIS 1/2/3抗体(1:300)Thermo SCIENTIFICCat #39795
Mowiol 4-88(聚乙烯醇4-88)Sigma-AldrichCat #81381
mTeSR1 5X添加剂STEMCELL TechnologiesCat #85852
mTeSR1基础培养基STEMCELL TechnologiesCat #85851
Nunc 冻存管Thermo SCIENTIFICCat #377267
其他
兔抗人GATA3抗体(1:300)Cell Signaling TechnologyCat #5852S
兔抗人LRP2抗体(1:300)Sapphire BioscienceCat #NBP2-39033
兔抗人Synaptopodin抗体(1:300)AbcamCat #ab224491
兔抗人WT1抗体(1:300)AbcamCat #ab89901
兔抗小鼠PDGFR抗体(1:300)AbcamCat #ab32570
重组人血清白蛋白(rHSA)YEASENCat #20901ES03
羊抗人NPHS1抗体(1:300)R&D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2培养基STEMCELL TechnologiesCat #05275
链霉亲和素Cy3标记(1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene(1X)GibcoCat #15040066
Y-27632(盐酸二氢盐)STEMCELL TechnologiesCat #72304

参考文献

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