本方案介绍了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞（iPSCs）高效生成肾类器官的全面方法。本研究的重点在于确定初始细胞密度和WNT激动剂浓度，从而为对肾类器官研究感兴趣的科研人员提供参考。
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本文内容
摘要
摘要
可通过多种方法从诱导性多能干细胞（iPSCs）生成肾类器官。这些类器官在疾病建模、药物筛选以及潜在的治疗应用方面具有广阔前景。本文介绍了一种从iPSCs逐步生成肾类器官的操作流程，起始于后部原始条纹（PS），进而诱导为中间中胚层（IM）。该方法依赖于APEL 2培养基，这是一种成分明确且不含动物源成分的培养基。培养过程中，首先添加高浓度的WNT激动剂（CHIR99021）处理4天，随后加入成纤维细胞生长因子9（FGF9）/肝素及低浓度CHIR99021继续培养3天。在此过程中，特别强调在iPSC起始阶段选择最佳的细胞密度和CHIR99021浓度，因为这些因素对成功生成肾类器官至关重要。本实验方案的一个重要环节是在低黏附培养板中进行悬浮培养，使中间中胚层逐步发育为包含肾小球、近端小管和远端小管结构的肾单位结构，并以直观易懂的可视化形式呈现。总体而言，该详细实验方案提供了一种高效且特异的技术，可用于从多种iPSC系生成肾类器官，确保实验结果的成功性和可重复性。
引言
肾脏在维持生理稳态中发挥关键作用，其功能依赖于基本功能单位肾单位。肾单位能够排泄代谢废物，并调节体液成分。由遗传性突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病（CKD）最终将进展为终末期肾病（ESKD）。1,2. 终末期肾病显然源于肾单位有限的再生能力，因此需要进行肾脏替代治疗。人诱导多能干细胞的定向分化使得 体外 生成患者特异性的三维肾脏类器官，可用于研究肾脏发育、构建患者特异性疾病模型以及进行肾毒性药物筛选3,4.
在胚胎发育过程中，肾脏起源于中间中胚层（IM），而中间中胚层由原条（PS）分化而来。经典的WNT信号通路可能在FGF（FGF9、FGF20）和BMP（通过JNK通路的Bmp7信号）的协同作用下，进一步诱导IM的分化5,6,7。这些信号通路产生两种重要的肾祖细胞（NPC）群体：输尿管芽（UB）和后肾间充质（MM），分别形成集合管和肾单位8,9。每个肾单位由肾小球和肾小管节段组成，包括近端小管、远端小管以及亨利氏袢10,11。根据上述理论，目前发表的实验方案通过模拟信号级联反应和生长因子刺激，以诱导生成肾脏类器官5,12。
近年来，已开发出多种将人iPSCs分化为肾类器官的方案5,6,7,12。Takasato等7优化了在替换为FGF9之前使用CHIR（WNT激动剂）处理的时间。根据其方案，在iPSCs中诱导中间中胚层（IM）最有效的方法是使用CHIR处理4天，随后使用FGF9处理3天。他们在实验中采用Transwell滤膜作为培养体系；然而，该方法对初学者而言较难掌握。因此，Kumar等13尝试改变培养方式，选择了悬浮培养。他们在第7天将贴壁细胞解离，并接种至低黏附培养板中，以促进其自组装形成包含肾单位样结构的拟胚体（EBs）。然而，这些方法的批次效应较为明显，尤其是在不同iPSC系之间。此外，不同文献报道的CHIR浓度也存在差异，范围从7 µM到12 µM不等5,13,14。
我们推测，细胞密度和CHIR的浓度可能影响不同iPSCs类器官的生成，这一假设已在我们的多次实验中得到验证。本方案对Kumar等人的研究方法13进行了轻微修改，并为使用者提供了逐步操作流程。该方法的时间安排和示意图见图1。
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方案
本研究使用的诱导多能干细胞（iPSCs）购自商业来源。细胞在商品化的基底膜基质包被的培养板上，使用mTeSR培养基进行维持培养（参见材料表）。表1列出了本研究中使用的所有培养基成分。
1. 铺板iPSC细胞以进行分化并诱导后部原始条纹（PS）
- 用 2 mL DPBS 清洗膜基质包被的 6 孔板中的 iPSCs。使用移液器吸除 DPBS。
- 加入1 mL市售的细胞解离溶液（参见 材料表) 以解离iPSCs，并于37 °C孵育5 min。
- 加入1 mL mTeSR至iPSCs中，并确保细胞已从塑料培养表面脱落。
- 以 400 x g 离心细胞 g 室温（RT）孵育3分钟。重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板计数细胞数量。
- 在已包被基底膜基质的24孔板或6孔板中接种不同密度的细胞，并使用添加了10 µM Rho激酶抑制剂（Y-27632）的mTeSR培养基进行培养（参见 材料表）。在37 °C CO₂培养箱中培养过夜2 培养箱
注意：不同iPSC细胞系诱导PS时，CHIR99021的最佳浓度和适宜的细胞密度各不相同。建议接种一系列不同密度（例如，0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 × 10⁵）3 每平方厘米单个细胞）以及7 µM–12 µM浓度范围的CHIR99021。在同一天开始对每种细胞密度和每种CHIR浓度进行诱导分化。在24孔板中确定CHIR99021的最佳浓度和合适的细胞密度，然后在6孔板中扩大培养。本文提供的方案基于6孔板。 - 次日，吸除 mTeSR 培养基，并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。
- 加入2 mL第一阶段培养基（含8-12 µM CHIR99021的干细胞分化培养基）（表1），记为第0天。
- 在37 °C培养箱中培养4天，每两天更换一次I期培养基。
2. 诱导生肾中间中胚层（IM）
- 第4天，移除第一阶段培养基，并用2 mL DPBS洗涤。
- 向细胞中加入2 mL第二阶段培养基（含200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素和1 µM CHIR99021的干细胞分化培养基）（表1）。
- 在37 °C培养箱中培养，并每隔2天更换一次培养基，直至第7天。
3. 在悬浮培养中生成肾类器官
注意：在第0天至第7天的观察期间，细胞状态至关重要。若细胞表现出成功扩增且聚集成堆，且无明显细胞碎片，则表明中间中胚层（IM）已成功诱导，提示可进入下一阶段。然而，若细胞出现早期凋亡，继而发生坏死或破裂，则可能提示CHIR99021浓度或细胞密度不适宜。
- 第7天，移除第二阶段培养基，并用2 mL DPBS洗涤细胞。
- 向每孔加入1 mL细胞解离溶液，在37 °C孵育5分钟，直至在相差显微镜下观察到细胞变圆发亮。
- 用移液器向细胞中加入1 mL第二阶段培养基，混匀，确保细胞已从培养表面脱离。
- 将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以400 × g离心3分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL第三阶段培养基中（含200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素、1 µM CHIR99021的干细胞分化培养基，溶于0.1%甲基纤维素（MC）和0.1%聚乙烯醇（PVA）中），并补充10 µM Rho激酶抑制剂（Y-27632）（见材料表），轻轻混匀。
- 混匀细胞悬液后，按1:3的比例接种至6孔低黏附培养板中。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱内的轨道摇床上（耐CO2，转速60 rpm）。
- 24小时后，移除Rho激酶抑制剂（Y-27632），更换为第三阶段培养基（干细胞分化培养基补充200 ng/mL FGF9、1 µg/mL肝素、1 µM CHIR99021、0.1% MC、0.1% PVA）。继续培养2天。按照以下步骤更换悬浮培养中的培养基：
- 使用无菌剪刀剪去1 mL移液枪头的尖端。
- 轻轻摇动6孔板，使类器官聚集于孔中央。
- 用准备好的移液枪将类器官吸至15 mL离心管中，静置5分钟。
- 吸走上清液，保留类器官于管底。
- 加入新鲜培养基重悬类器官，并重新接种回6孔低黏附培养板中。
- 继续在培养箱中以60 rpm振荡低黏附培养板。每隔两天更换一次第三阶段培养基，直至第12天。
- 第12天，将培养基更换为第四阶段培养基（含0.1% MC和0.1% PVA的干细胞分化培养基）。
- 每隔两天更换一次培养基，直至第25天。类器官可在第12至25天期间逐渐发育为成熟的肾单位结构。
4. 肾类器官的免疫荧光染色
- 将肾类器官收集至15 mL离心管中，并用2 mL PBS洗涤。
- 静置5–10分钟后，用新鲜配制的2%多聚甲醛（PFA）在4 °C固定肾类器官20分钟。
- 去除PFA，加入含0.3% Triton X-100的PBS（0.3% PBST）1 mL洗涤类器官，在摇床上均匀振荡（转速不超过60 rpm）8分钟，静置5分钟后吸去上清液。重复此步骤三次。
注意：类器官可在4 °C条件下保存于0.3% PBST中2–4周。 - 将固定的类器官与含10%驴血清的PBST（封闭液）（见材料表）在4 °C孵育过夜。
- 用封闭液按1:300比例稀释一抗（见材料表）。
- 将类器官与一抗在4 °C条件下避光孵育过夜，并持续振荡。
注意：确保同一类器官中的肾小球和肾小管可同时被染色。 - 用1 mL 0.3% PBST洗涤类器官，在摇床上均匀振荡（转速不超过60 rpm）8分钟，静置5分钟后吸去上清液。重复此步骤三次。
- 将类器官与二抗（见材料表）及DAPI在4 °C避光孵育过夜，并持续振荡，随后重复步骤4.7。
注意：二抗和DAPI均用封闭液稀释，二抗稀释比例为1:400，DAPI为1:1000。 - 染色完成后，依次用甲醇（25%、50%、75%和100%，每步5分钟）对类器官进行脱水处理，然后用苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液（BABB，1:2）通透5分钟（见材料表）。
- 将透明化处理后的类器官置于玻璃底培养皿（见材料表）中，使用共聚焦显微镜观察。
注意：成像时应选择底部为玻璃的培养皿；通透时可直接将BABB加入培养皿中，以保持皿底湿润。
5. 体外 葡聚糖摄取实验
- 第25天，在37 °C、5% CO2的培养箱中，用100 µg/mL的荧光标记葡聚糖（参见材料表）孵育类器官4小时。
- 4小时后，更换新鲜培养基，并使用宽场荧光显微镜拍摄活细胞培养图像。
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结果
通过使用GSK3抑制剂CHIR99021激活经典的WNT信号通路，随后加入FGF9/肝素，可实现IM的生成。从第0天到第4天，iPSC迅速扩增，并呈现菱形或三角形形态。细胞融合度在第7天达到90%–100%，并均匀累积。在悬浮培养后，细胞团于第7天解离后自发形成肾单位结构。通过悬浮培养生成的肾类器官呈现出类似小管的结构，在聚集培养18天后可通过明场图像轻松观察到（图2 和 图3）。
通常，从一个24孔板中的iPSCs孔开始进行一次实验，可获得200–300个类器官。其中80%–90%含有类似肾单位的结构（图2）。对于hiPSC-B1 iPSC细胞系，生成肾脏类器官的最佳条件是在24孔板的一个孔中培养1.8–2.0 × 104个细胞，并使用8 µM CHIR99021（图2、图3
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讨论
本文详细描述了由iPSCs生成肾类器官的实验方案，涉及基础培养基、初始细胞密度以及CHIR99021浓度的微小调整。在多项实验中，成功生成肾类器官的关键因素被确定为中间中胚层（IM）的初始分化以及第7天时的细胞状态。此外，不同的iPSC细胞系在细胞增殖能力和分化潜能方面存在差异，导致其最佳细胞密度和CHIR99021浓度各不相同5,13,14。因此，确定每种iPSC细胞系的理想培养条件，对于从患者特异性iPSCs中大量生成肾类器官至关重要。
为了确定最佳条件，建议先使用24孔板进行预实验，再将培养规模扩大至6孔板以进行更大规模的生产。此步骤可使研究人员根据细胞形态和数量评估诱导效果。此外，类器官在固定后可保持其完整结构长达2至4周，从而提高了该方法的可行性和实用性。
采用本方案生成的肾类器官通常直径约为50–300 µm，在明场显微镜下可观察...
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披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
我们非常感谢毛和胡实验室所有过去和现在的成员，感谢他们对本项目提出的富有启发性的讨论和重要贡献。感谢中国国家儿童健康临床研究中心给予的大力支持。本研究由国家自然科学基金（项目编号 U20A20351，负责人：Jianhua Mao；项目编号 82200784，负责人：Lidan Hu）、浙江省自然科学基金（项目编号 LQ22C070004，负责人：Lidan Hu）以及江苏省自然科学基金（项目编号 BK20210150，负责人：Gang Wang）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔细胞培养板，平底 | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| 抗体 | |||
| 苯甲醇 | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| 生物安全柜 | Haier | Cat #HR40  A2 | |
| 生物素标记抗人LTL抗体（1:300） | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| 人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞hiPS-B1（iPSc，女性） | N/A | N/A | |
| 二氧化碳振荡培养箱 | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| 化学品、多肽及重组蛋白 | |||
| CHIR99021（Wnt通路激活剂） | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar 多孔6孔细胞培养板 | Corning | Cat #3516 | |
| Costar 超低吸附6孔板 | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI染色液 | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| 葡聚糖，Alexa Fluor 647标记 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12（无HEPES） | Servicebio | Cat #G4610 | |
| 驴抗羊IgG H&L（Alexa Fluor 647标记） | Abcam | Cat #ab150179 | |
| 驴血清封闭液 | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS（无钙、无镁、无酚红） | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| 干式恒温培养器 | 上海精芯 | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488标记山羊抗小鼠IgG（1:400） | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488标记山羊抗兔IgG（1:400） | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549标记山羊抗小鼠IgG（1:400） | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549标记山羊抗兔IgG（1:400） | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649标记山羊抗兔IgG（1:400） | Earthox | Cat #E032620 | |
| 实验模型：细胞系 | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 培养箱 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltrex LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| 玻璃底培养皿 | NEST | Cat #801002 | |
| 山羊抗人CUBN抗体（1:300） | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| 肝素溶液（细胞培养添加剂） | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| 人重组FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| 倒置显微镜 | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| 微量离心机 | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| 小鼠抗人CD31抗体（1:300） | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| 小鼠抗人ECAD抗体（1:300） | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| 小鼠抗人整合素β1抗体（1:300） | Abcam | Cat #ab30394 | |
| 小鼠抗人MEIS 1/2/3抗体（1:300） | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88（聚乙烯醇4-88） | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X添加剂 | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1基础培养基 | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc 冻存管 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| 其他 | |||
| 兔抗人GATA3抗体（1:300） | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| 兔抗人LRP2抗体（1:300） | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| 兔抗人Synaptopodin抗体（1:300） | Abcam | Cat #ab224491 | |
| 兔抗人WT1抗体（1:300） | Abcam | Cat #ab89901 | |
| 兔抗小鼠PDGFR抗体（1:300） | Abcam | Cat #ab32570 | |
| 重组人血清白蛋白（rHSA） | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| 羊抗人NPHS1抗体（1:300） | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2培养基 | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| 链霉亲和素Cy3标记（1:400） | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene（1X） | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632（盐酸二氢盐） | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
参考文献
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