本文介绍了从小鼠腹主动脉周围脂肪组织中分离的基质血管组分来源的前脂肪细胞的分离、培养及成脂诱导方法，可用于研究血管周围脂肪组织的功能及其与血管细胞之间的关系。
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方法文章
从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞进行脂肪生成
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
血管周围脂肪组织（PVAT）是一种包绕血管的脂肪组织库，具有白色、米色和棕色脂肪细胞的表型。近年来的研究揭示了PVAT在调节血管稳态以及参与心血管疾病发病机制中的核心作用。深入理解PVAT的特性及其调控机制，对未来治疗策略的开发具有重要意义。主动脉周围脂肪细胞的原代培养体系对于研究PVAT功能以及主动脉周围脂肪细胞与血管细胞之间的相互作用具有重要价值。本文介绍了一种经济且可行的实验方案，用于从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养并诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞向脂肪细胞分化，该方法可用于脂肪生成或脂质合成过程的建模研究 体外该方案概述了从年轻小鼠分离主动脉周围脂肪组织并进行细胞培养和分化的组织处理步骤。本方案将为深入研究血管周围脂肪组织（PVAT）功能提供重要的实验技术基础。
引言
血管周围脂肪组织（PVAT）是一种血管周围结构，由成熟的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）混合构成，被认为通过其分泌组以旁分泌方式与邻近的血管壁相互作用1。作为血管稳态的关键调节者，PVAT功能障碍被认为参与了心血管疾病的发病机制2,3,4。脂肪组织的SVF包含多种预期的细胞群体，包括内皮细胞、免疫细胞、间皮细胞、神经元细胞以及脂肪干细胞和前体细胞（ASPCs）5,6。众所周知，存在于脂肪组织SVF中的ASPCs能够分化为成熟的脂肪细胞5。因此推断，SVF是PVAT中成熟脂肪细胞的关键来源。已有若干研究表明，PVAT-SVF在特定诱导条件下可分化为成熟的脂肪细胞6,7,8。
目前，从脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）的方法主要有两种：一种是酶消化法，另一种是非酶法9。酶法通常可获得更高产量的有核祖细胞10。迄今为止，SVF在促进伤口愈合、泌尿生殖系统及心血管疾病中的血管再生和新生血管形成方面的益处已得到广泛证实11，尤其在皮肤科和整形外科领域表现突出12,13。然而，来源于血管周围脂肪组织（PVAT）的SVF在临床上的应用前景尚未得到充分探索，这可能归因于缺乏从PVAT中标准化分离SVF的方法。本实验方案的目的是建立一种标准化的方法，用于从小鼠胸主动脉周围PVAT来源的SVF中分离、培养并诱导前脂肪细胞向脂肪细胞分化，从而为进一步研究PVAT的功能提供支持。该方案针对从年轻小鼠获取的主动脉周围脂肪细胞的培养和细胞分化技术进行了优化。
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方案
动物实验方案经上海交通大学医学院附属上海市胸科医院机构动物护理和使用委员会批准（批准号：KS23010），并符合相关伦理规定。本实验建议选用4至8周龄的雄性和雌性C57BL/6小鼠。
1. 手术器械、缓冲液和培养基的准备
- 将手术器械（例如手术剪和标准镊子）在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。使用 75% 酒精对显微外科器械进行消毒。
- 制备含 1% v/v 青霉素-链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS），另准备 10 mL 含 10% v/v 青霉素-链霉素的 PBS。
注意：在后续章节中，若无特别说明，PBS 均指常规无菌 PBS。 - 制备 Krebs Ringer HEPES BSA 缓冲液：将 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 20 mM HEPES 溶解于 Krebs Ringer 溶液中。
- 现配消化液：将 I 型胶原酶（1 mg/mL）和分散酶 II（4 mg/mL）溶解于 Krebs Ringer HEPES BSA 缓冲液中。使用 0.2 µm 滤器对溶液进行除菌。
- 制备胶原包被的 12 孔板。
- 用无菌去离子水将胶原溶液（1 mg/mL）稀释至 40 µg/mL。每孔加入 1 mL 稀释后的胶原溶液，使包被浓度达到 6–10 µg/cm2。室温孵育 1 小时。
- 吸除残余液体，每孔用 1 mL PBS 洗涤 2 次。立即使用，或在 II 级生物安全柜中风干后，用封口膜密封，于 2–8 °C 保存。
- 制备培养基：高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）、1% v/v 青霉素-链霉素。4 °C 保存，最长可保存 2 周。
- 制备成脂诱导培养基：高糖 DMEM、10% FBS、1% v/v 青霉素-链霉素、1 nM 三碘甲腺原氨酸、1 µM 罗格列酮、1 µM 胰岛素、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和 1 µM 地塞米松。4 °C 保存，最长可保存 2 周。
- 制备维持培养基：高糖 DMEM、10% FBS、1% v/v 青霉素-链霉素、1 nM 三碘甲腺原氨酸、1 µM 罗格列酮和 1 µM 胰岛素。4 °C 保存，最长可保存 2 周。
2. 血管周围脂肪组织（PVAT）的解剖与分离
- 在2%异氟烷麻醉下通过颈椎脱位或过量二氧化碳处死小鼠。用75%酒精喷洒以进行皮肤消毒。
- 将小鼠置于仰卧位（面朝上）。
- 提起皮肤，做一小切口，使用手术剪沿腹侧中线从骨盆向颈部钝性分离皮肤与腹肌。沿中线两侧剪开膈肌和肋骨，暴露心脏和肺。
- 小心移除肝脏、脾脏、肠道和肾脏。避免切破肠壁。
- 移除肺和食管。
- 一手用镊子轻轻提起心脏，另一手用手术剪将主动脉从脊柱分离。然后将心脏和主动脉放入含有1% v/v青霉素-链霉素的PBS的60 mm培养皿中。
- 将显微外科镊子和显微外科剪从酒精中取出，并在25 mL PBS中冲洗以去除残留酒精。在体视显微镜下，去除心脏和主动脉上的胸腺及其他组织，随后去除心脏，保留带有外膜脂肪组织（PVATs）的主动脉。
- 将带有外膜脂肪组织（PVATs）的主动脉转移至另一洁净的60 mm培养皿中，其中含有含1% v/v青霉素-链霉素的PBS。
- 使用显微外科镊子剥离外膜脂肪组织（PVATs），一对镊子固定主动脉，另一对镊子剥离脂肪组织。在尽可能去除血管组织的同时，尽量减少对外周血管脂肪组织的损伤。
- 将胸主动脉周围的外膜脂肪组织（PVATs）收集至预冷的2 mL微量离心管中，管内含有添加了1% v/v青霉素-链霉素的高糖DMEM，并置于冰上。
3. 基质血管组分（SVF）的分离
- 用含有10% v/v青霉素-链霉素的PBS和含有1% v/v青霉素-链霉素的PBS依次冲洗收集的组织。
注意：从这一步开始，所有实验必须在II级生物安全柜中的无菌条件下进行。 - 将组织转移至无菌的60 mm培养皿中，加入200 µL消化液，使用无菌剪刀将其剪切成约1 mm3大小的组织块。
- 使用塑料移液枪头（枪头末端经无菌剪刀剪切以扩大口径）将组织混合物转移至15 mL离心管中，并加入6 mL消化液以启动消化反应。
注意：一次消化反应（3 mL消化液）足以处理来自六只小鼠的PVAT脂肪库组织。 - 将离心管置于37 °C、配备轨道摇床（150 rpm频率以确保充分混匀）的培养箱中孵育30–45分钟。将离心管平绑在支架上，使其水平震荡，并每隔5–10分钟用手剧烈上下振荡10秒。
注意：当观察到呈均一黄色、无组织碎片残留的消化液时，可终止消化过程。 - 将消化后的组织液通过70 µm细胞滤筛过滤至50 mL离心管中。用等体积的培养基冲洗细胞滤筛，以最大限度回收细胞并终止消化反应。
- 将滤液转移至新的15 mL离心管中，在1,800 × g条件下离心10分钟。倒置离心管弃去上清液，将沉淀物重悬于5 mL PBS中，随后在1,800 × g条件下再次离心5分钟。
- 倒置离心管弃去上清液，将沉淀物重悬于适量体积的培养基中。
注意：每六只小鼠获得的细胞沉淀应重悬于1 mL培养基中，并接种至12孔板的一个孔内。 - 将细胞接种至胶原蛋白包被的12孔板中，于37 °C、含5% CO2的湿润环境中过夜培养。
- 次日，吸除培养基，用预热至37 °C、含1% v/v青霉素-链霉素的PBS洗涤细胞，以去除细胞碎片和红细胞，然后每孔重新加入1 mL新鲜培养基。
4. 腹主动脉周围脂肪组织来源SVF前脂肪细胞的成脂诱导
- 每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到约60-70%融合度。
注意：细胞通常需要3-4天达到60-70%融合度。 - 当细胞达到60-70%融合度时，吸除培养基，并更换为棕色脂肪诱导培养基。将脂肪诱导分化的开始日视为分化第0天。
- 72小时后（分化第3天），更换为维持培养基。此后每2天更换一次维持培养基，直至细胞用于实验。
- 采用适当方法分析脂肪细胞，例如油红O染色14和蛋白质印迹15。
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结果
按照上述方案，我们仔细分离了小鼠胸主动脉周围附着的血管周围脂肪组织（PVAT）（图1A–D）。用无菌剪刀将PVAT清洗并剪碎成小片后（图1E、F），将组织碎片置于含有I型胶原酶（1 mg/mL）和dispase II（4 mg/mL）的消化液中，在37 °C条件下振荡孵育30–45分钟（图1G）。消化后的组织经70 µm细胞筛过滤至50 mL离心管中（图1H）。离心后收集细胞沉淀（图1I）。
为验证SVF来源的前脂肪细胞的成脂潜能，我们使用含有1 nM三碘甲腺原氨酸、1 µM罗格列酮、1 µM胰岛素、0.5 mM IBMX和1 µM地塞米松的棕色脂肪诱导培养基对细胞进行诱导。经7-10天...
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讨论
我们提出一种实用且可行的方法，用于从小鼠胸主动脉周围脂肪组织中分离并诱导SVF来源的前脂肪细胞进行脂肪生成。该方案的优点在于操作简便且经济。足够的小鼠数量对于成功分离至关重要，因为组织量不足可能导致SVF密度低、细胞生长状态差，最终影响脂质生成效率。此外，小鼠年龄也是需要考虑的重要因素，因为SVF的脂肪生成潜能随年龄增长而下降。在分离纵隔脂肪组织（PVAT）时，快速且谨慎地操作以最大限度减少血管组织污染尤为关键。消化液同样是关键组分，在I型胶原酶中添加dispase II可提高组织消化效率和细胞得率。在消化过程中需密切观察，避免过度消化，以免影响细胞活力。在整个实验过程中遵循无菌操作技术并维持适当的培养条件至关重要。
主动脉周围脂肪组织原代脂肪细胞培养对于研究血管周围脂肪组织（PVAT）的特性与功能具有重要价值。从基因修饰小鼠的主动脉周围脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）来源的前脂肪细胞，并进行脂肪生成诱导，为探索调控PVAT分化及脂肪生成的关键因子提供了研究平台。 体外. PVAT 通过产生过氧化氢、脂联素、血管紧张素1-7、棕榈酸甲酯、硫化氢、一氧化氮和瘦素...
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披露
作者声明不存在任何利益冲突，包括财务或其他方面的利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（82130012 和 81830010）以及上海胸科医院基础研究培育项目（资助编号：2022YNJCQ03）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 注射器滤器 | PALL | 4612 | |
| 12 孔板 | Labselect | 11210 | |
| 15 mL 离心管 | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3） | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL 离心管 | Labselect | CT-002-50A | |
| 抗脂联素抗体 | Abcam | ab22554 | 1:1,000 工作浓度 |
| 抗 COX IV 抗体 | CST | 4850 | 1:1,000 工作浓度 |
| 抗 FABP4 抗体 | CST | 2120 | 1:1,000 工作浓度 |
| 抗 PGC1α 抗体 | Abcam | ab191838 | 1:1,000 工作浓度 |
| 抗 PPARγ 抗体 | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 工作浓度 |
| 抗 UCP1 抗体 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 工作浓度 |
| 抗 α-肌动蛋白抗体 | CST | 6487 | 1:1,000 工作浓度 |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| 4–8 周龄 C57BL/6 小鼠（雌雄皆可） | 上海南方模式生物中心股份有限公司 | ||
| 70 µm 尼龙细胞筛 | Falcon | 352350 | |
| 小牛皮胶原 | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| I 型胶原酶 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| 高糖 DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| 带轨道摇床的培养箱 | 上海龙跃仪器设备有限公司 | LYZ-103B | |
| 胰岛素（牛源） | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| 异氟烷 | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer 溶液 | Pricella | PB180347 | 避光保存 |
| 显微外科镊 | Beyotime | FS233 | |
| 显微外科剪 | Beyotime | FS217 | |
| 油红 O | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | A600395-0050 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B548117-0500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 羊抗小鼠 IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 工作浓度 |
| 辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 羊抗兔 IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 工作浓度 |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| 普通镊子 | Beyotime | FS225 | |
| 手术剪 | Beyotime | FS001 |
参考文献
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