从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞进行脂肪生成

摘要

本文介绍了从小鼠腹主动脉周围脂肪组织中分离的基质血管组分来源的前脂肪细胞的分离、培养及成脂诱导方法，可用于研究血管周围脂肪组织的功能及其与血管细胞之间的关系。

摘要

血管周围脂肪组织（PVAT）是一种包绕血管的脂肪组织库，具有白色、米色和棕色脂肪细胞的表型。近年来的研究揭示了PVAT在调节血管稳态以及参与心血管疾病发病机制中的核心作用。深入理解PVAT的特性及其调控机制，对未来治疗策略的开发具有重要意义。主动脉周围脂肪细胞的原代培养体系对于研究PVAT功能以及主动脉周围脂肪细胞与血管细胞之间的相互作用具有重要价值。本文介绍了一种经济且可行的实验方案，用于从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养并诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞向脂肪细胞分化，该方法可用于脂肪生成或脂质合成过程的建模研究 体外该方案概述了从年轻小鼠分离主动脉周围脂肪组织并进行细胞培养和分化的组织处理步骤。本方案将为深入研究血管周围脂肪组织（PVAT）功能提供重要的实验技术基础。

引言

血管周围脂肪组织（PVAT）是一种血管周围结构，由成熟的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）混合构成，被认为通过其分泌组以旁分泌方式与邻近的血管壁相互作用¹。作为血管稳态的关键调节者，PVAT功能障碍被认为参与了心血管疾病的发病机制^2,3,4。脂肪组织的SVF包含多种预期的细胞群体，包括内皮细胞、免疫细胞、间皮细胞、神经元细胞以及脂肪干细胞和前体细胞（ASPCs）^5,6。众所周知，存在于脂肪组织SVF中的ASPCs能够分化为成熟的脂肪细胞⁵。因此推断，SVF是PVAT中成熟脂肪细胞的关键来源。已有若干研究表明，PVAT-SVF在特定诱导条件下可分化为成熟的脂肪细胞^6,7,8。

目前，从脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）的方法主要有两种：一种是酶消化法，另一种是非酶法

方案

动物实验方案经上海交通大学医学院附属上海市胸科医院机构动物护理和使用委员会批准（批准号：KS23010），并符合相关伦理规定。本实验建议选用4至8周龄的雄性和雌性C57BL/6小鼠。

1. 手术器械、缓冲液和培养基的准备

1. 将手术器械（例如手术剪和标准镊子）在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。使用 75% 酒精对显微外科器械进行消毒。
2. 制备含 1% v/v 青霉素-链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS），另准备 10 mL 含 10% v/v 青霉素-链霉素的 PBS。
   注意：在后续章节中，若无特别说明，PBS 均指常规无菌 PBS。
3. 制备 Krebs Ringer HEPES BSA 缓冲液：将 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 20 mM HEPES 溶解于 Krebs Ringer 溶液中。
4. 现配消化液：将 I 型胶原酶（1 mg/mL）和分散酶 II（4 mg/mL）溶解于 Krebs Ringer HEPES BSA 缓冲液中。使用 0.2 µm 滤器对溶液进行除菌。
5. 制备胶原包被的 12 孔板。
   1. 用无菌去离子水将胶原溶液（1 mg/mL）稀释至 40 µg/mL。每孔加入 1 mL 稀释后的胶原溶液，使包被浓度达到 6–10 µg/cm²。室温孵育 1 小时。
   ....

结果

按照上述方案，我们仔细分离了小鼠胸主动脉周围附着的血管周围脂肪组织（PVAT）（图1A–D）。用无菌剪刀将PVAT清洗并剪碎成小片后（图1E、F），将组织碎片置于含有I型胶原酶（1 mg/mL）和dispase II（4 mg/mL）的消化液中，在37 °C条件下振荡孵育30–45分钟（图1G）。消化后的组织经70 µm细胞筛过滤至50 mL离心管中（图1H）。离心后收集细胞沉淀（图1I）。

为验证SVF来源的前脂肪细胞的成脂潜能，我们使用含有1 nM三碘甲腺原氨酸、1 µM罗格列酮、1 µM胰岛素、0.5 mM IBMX和1 µM地塞米松的棕色脂肪诱导培养基对细胞进行诱导。经7-10天.......

讨论

我们提出一种实用且可行的方法，用于从小鼠胸主动脉周围脂肪组织中分离并诱导SVF来源的前脂肪细胞进行脂肪生成。该方案的优点在于操作简便且经济。足够的小鼠数量对于成功分离至关重要，因为组织量不足可能导致SVF密度低、细胞生长状态差，最终影响脂质生成效率。此外，小鼠年龄也是需要考虑的重要因素，因为SVF的脂肪生成潜能随年龄增长而下降。在分离纵隔脂肪组织（PVAT）时，快速且谨慎地操作以最大限度减少血管组织污染尤为关键。消化液同样是关键组分，在I型胶原酶中添加dispase II可提高组织消化效率和细胞得率。在消化过程中需密切观察，避免过度消化，以免影响细胞活力。在整个实验过程中遵循无菌操作技术并维持适当的培养条件至关重要。

主动脉周围脂肪组织原代脂肪细胞培养对于研究血管周围脂肪组织（PVAT）的特性与功能具有重要价值。从基因修饰小鼠的主动脉周围脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）来源的前脂肪细胞，并进行脂肪生成诱导，为探索调控PVAT分化及脂肪生成的关键因子提供了研究平台。 体外. PVAT 通过产生过氧化氢、脂联素、血管紧张素1-7、棕榈酸甲酯、硫化氢、一氧化氮和瘦素.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm 注射器滤器	PALL	4612
12 孔板	Labselect	11210
15 mL 离心管	Labserv	310109003
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL 离心管	Labselect	CT-002-50A
抗脂联素抗体	Abcam	ab22554	1:1,000 工作浓度
抗 COX IV 抗体	CST	4850	1:1,000 工作浓度
抗 FABP4 抗体	CST	2120	1:1,000 工作浓度
抗 PGC1α 抗体	Abcam	ab191838	1:1,000 工作浓度
抗 PPARγ 抗体	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 工作浓度
抗 UCP1 抗体	Abcam	ab10983	1:1,000 工作浓度
抗 α-肌动蛋白抗体	CST	6487	1:1,000 工作浓度
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
4–8 周龄 C57BL/6 小鼠（雌雄皆可）	上海南方模式生物中心股份有限公司
70 µm 尼龙细胞筛	Falcon	352350
小牛皮胶原	Sigma-Aldrich	C8919
I 型胶原酶	Worthington	LS004196	1 mg/mL
地塞米松	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
胎牛血清	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
高糖 DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
带轨道摇床的培养箱	上海龙跃仪器设备有限公司	LYZ-103B
胰岛素（牛源）	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
异氟烷	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer 溶液	Pricella	PB180347	避光保存
显微外科镊	Beyotime	FS233
显微外科剪	Beyotime	FS217
油红 O	生工生物工程（上海）股份有限公司	A600395-0050
PBS（磷酸盐缓冲液）	生工生物工程（上海）股份有限公司	B548117-0500
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 羊抗小鼠 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 工作浓度
辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 羊抗兔 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 工作浓度
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
普通镊子	Beyotime	FS225
手术剪	Beyotime	FS001