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电刺激下平铺视网膜的钙成像

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DOI：

10.3791/65705

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2023年8月18日

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1Institut de Ciències Fotòniques (ICFO), The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Catalan Institute of Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), CSIC and BIST, Campus UAB, 3Institut de Física d'Altes Energies (IFAE), The Barcelona Institute of Science and Technology, Campus UAB, 4Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

本文内容

摘要

视网膜假体能够产生视觉感知。为了推动新型假体的开发，需要在植入前使用离体（ex vivo）方法对装置进行测试。本文提供了一套全面的实验方案，用于研究在电刺激条件下视网膜神经节细胞层的钙活性。

摘要

视网膜营养不良是全球范围内导致失明的主要原因之一。目前，研究人员正在大力开发先进的视网膜假体，旨在绕过退化视网膜中功能受损的感光光感受器细胞，通过诱发视觉感知来部分恢复视力。其中一种常见的研究方向是设计和制造具有柔性物理结构的可植入装置，并集成大量电极，从而实现高效且精确的视觉感知生成。然而，随着每一项技术的进步，都需要一种可靠且易于操作的ex vivo方法，在进入in vivo实验之前验证设备的功能性，因为在体内实验中，除设备性能外还会引入其他影响因素。本文介绍了一种完整的实验方案，用于研究电刺激后视网膜神经节细胞层（GCL）中的钙活动。具体步骤包括：（1）利用基因编码的钙指示剂对大鼠视网膜进行荧光标记；（2）在施加不同模式的电刺激的同时，使用倒置荧光显微镜采集荧光信号；（3）从GCL中的单个细胞中提取并分析钙信号轨迹。通过遵循该流程，研究人员可在开展in vivo实验前高效地测试新的刺激方案。

引言

视网膜包含感光细胞，这些细胞负责感知光线。它们捕获光子并将其转化为神经冲动。这些冲动随后在视网膜内进行处理，并传递至视觉皮层，从而形成视觉图像1。视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa, RP）和年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration, AMD）是一类以感光细胞进行性丧失为特征的退行性疾病。这些视网膜病变是全球范围内导致失明的主要原因之一1，影响数以百万计的个体，对患者、医疗系统以及整个社会带来重大的医学、个人及社会经济影响。此外，随着人口老龄化，预计到2050年，AMD病例将增加15%2。

目前，针对这些疾病导致视力受损的患者，已有大量研究致力于恢复其视力3。其中一种有前景的方法是使用视网膜假体，该技术已证明可在一定程度上恢复视力4,5。这类设备可捕获视觉场景中的光线，并将其转化为电脉冲。这些电脉冲通过植入眼内的微电极阵列（MEA）中的电极传递，刺激尚存的神经元，从而绕过已丧失功能的感光细胞。被激活的视网膜神经节细胞（RGCs）将信号输出至大脑，并被解读为视觉感知。然而，现有植入设备的主要局限在于电极-组织界面的分辨率6以及对不同类型细胞的非选择性刺激。因此，为了优化新型可植入设备的设计，实现更高效的视力恢复，关键在于理解如何开发刺激范式，以选择性地激活靠近电极的细胞。

钙成像是一种广泛用于研究神经活动的技术，相较于非光学方法具有多项优势7,8。首先，它可提供细胞级和亚细胞级的分辨率；其次，钙指示剂可靶向特定类型的细胞；第三，该技术适用于长期追踪；第四，它能够在区分活跃与非活跃细胞的同时，观察整个细胞群体。该方法可间接反映细胞活动，其时间分辨率可达数百毫秒量级。基因编码的荧光钙指示剂（如GCaMP传感器）在结合钙离子后会发生构象变化，从而导致荧光增强9。重组腺相关病毒载体（AAVs）是将GCaMP转导至视网膜细胞的有效手段10。

本方案介绍了一种利用钙成像技术测试视网膜植入物刺激方案的高效方法。具体而言，我们关注于 离体 大鼠视网膜组织，并提供从样本获取到数据分析的详细逐步操作说明。通过提供这一全面指南，来自不同研究背景的科研人员均可自信地开展电刺激实验。

方案

所有动物实验均按照标准动物伦理准则（欧洲共同体指令 86/609/EU）进行，并经当地动物伦理委员会批准。本研究采用 8 周龄的 Long Evans 大鼠。动物购自商业来源（见材料表）。

1. 培养基制备与平铺装片组件的准备

  1. Ames 培养基（1 L）
    1. 在 1 L 玻璃瓶中，加入 Ames 培养基粉末、1.9 g/L NaHCO3、10 ml 青霉素/链霉素 100 倍浓缩液以及 1 L 去离子水（参见材料表）。使用去离子水或 NaHCO3 将 pH 调整至 7.4，渗透压调整至 280 mOsm。在超净台中通过 0.2 µm 孔径滤膜过滤溶液，以实现灭菌。
      注意：将灭菌后的培养基在 4 °C 下保存。该溶液稳定，可使用长达 1 个月。
  2. 安装膜片
    1. 使用少量胶水将一张 PTFE 多孔膜（参见材料表）固定在垫圈上。静置干燥至少 15 分钟。
    2. 为获得半透明效果，将膜片浸入 70% 乙醇中 1 分钟。
    3. 用去离子水冲洗膜片两次，以彻底去除乙醇。将其保存在去离子水中，防止变浑浊。

2. GCL 标记与大鼠视网膜平铺制备

注意：该标记方法无法区分视网膜神经节细胞（RGCs）与移位的无长突细胞。若需特异性标记RGCs，可考虑使用带有RGC特异性启动子的AAV病毒11和/或通过视神经进行逆行标记12。为区分ON型和OFF型中心RGC亚类，可根据RGC对光刺激的反应进行分类13,14，并使用新一代基因编码的钙指示剂，其具有更高的灵敏度，并可检测单个动作电位15。

  1. 玻璃体内注射
    1. 用2%异氟烷/1%氧气麻醉8周龄Long Evans大鼠2 直到足底反射消失，然后使用大鼠鼻罩维持麻醉（参见 材料表).
      注意：麻醉期间，将动物置于加热垫上以维持其体温。
    2. 使用市售眼药水一滴（参见 材料表以扩大瞳孔。
    3. 在进行手术前，使用检眼镜和光学相干断层扫描（OCT）检查眼部是否存在异常 体内 视网膜成像系统。滴加一滴2%甲基纤维素（Methocel 2%），以促进角膜与物镜之间的接触（参见 材料表).
      注意：如果发现任何异常，请勿对该眼继续进行后续步骤。
    4. 滴加一滴普鲁卡因作为局部麻醉剂。使用市售缝合线固定眼睑和角膜缘结膜（参见 材料表用30 G针头在距角膜缘4 mm处制作一个1 mm的巩膜切口。
      1. 将36 G钝针连接至精密注射器，以45°角向玻璃体腔内注射携带基因编码钙指示剂的AAV颗粒，持续30秒。本研究中使用的病毒为AAV2-CAG-GCaMP5G（7.5 × 1011 GC/mL 在 HBSS 中）（参见 材料表).
        注意：不编码潜在致瘤性基因产物或毒素分子、且在无辅助病毒条件下生产的腺相关病毒（AAV）构建体可在生物安全一级（BSL-1）设施中操作。否则，若被归类为需在生物安全二级（BSL-2） containment 条件下的生物危害性材料，则必须采取适当的防护措施16编码 GCaMP 的 AAV 被视为 BSL-1 级别，无需在生物安全柜内操作。
    5. 滴加一滴托百士（Tobradex）（参见 材料表以预防炎症并作为抗生素预防措施。
    6. 如有需要，对另一只眼睛重复步骤2、3和4。
      注意：术后12-24小时检查动物，以确保无不良反应。
    7. 注射后3天，使用检眼镜和光学相干断层扫描（OCT）检查视网膜结构 体内 视网膜成像系统（参见 材料表).
    8. 注射两周后，GCL 应发出荧光。使用荧光眼底镜检查视网膜结构和 AAV 表达情况 体内 视网膜成像系统
      注意：根据 Weitz 等人的研究12注射后1周，AAV2-CAG-GCaMP5G 的荧光开始明显，2周时增强。从第4周开始，GCaMP过表达引发细胞病变。死亡细胞在细胞核和细胞质中均表现出高水平的基础荧光信号，且该信号不随刺激而波动。在健康细胞中，GCaMP的表达局限于细胞质，排除在细胞核之外7,8,12,17,18这些特征可以被观察到 离体 显微成像期间，基因表达的时间窗口可能因病毒载体和所选启动子的不同而有所差异。
  2. 视网膜切除与平铺 mounting
    注意：根据标准伦理准则（欧洲共同体指令 86/609/EU）并经当地伦理委员会批准，玻璃体内注射后 2 至 3 周，大鼠在电生理实验方案开始前立即实施安乐死。二氧化碳（CO₂）2吸入法被用作本方案中的安乐死方法。
    1. 眼球摘除
      1. 使用一对弯头镊子轻轻按压眼眶外侧，使眼球略微从眼窝中突出。
      2. 使用弹簧剪剪断固定眼球的肌肉并摘除眼球，注意避免刺破眼球。
        注意：从这一步开始，在体视显微镜下于充氧（95% O₂2 / 5% CO₂2Ames 培养基
    2. 视网膜切除
      1. 使用一对小型弯头镊子和精细弹簧剪去除眼球周围的所有组织。
      2. 取一块约 3 cm × 3 cm 的滤纸，放置于 3.5 cm 培养皿的皿盖上，用 Ames 培养基浸润滤纸。
      3. 将眼球置于纸片上方，前段朝向操作者。用一把直镊夹住眼球，镊子位置位于锯齿缘上方，与培养皿表面呈约45°角。以直镊之间的空隙为参考，用刀片做一小切口。
      4. 将眼球重新置于Ames培养基中。使用直镊子和精细弹簧剪将眼睛的前段和后段分离。
      5. 使用两把直镊子小心地取出晶状体。然后，将视网膜与巩膜分离。
      6. 使用精细的弹簧剪从巩膜向视神经方向剪切，直至视网膜从眼杯中分离。
      7. 使用荧光体视显微镜鉴定视网膜中钙指示剂表达最佳的区域。
        注意：病毒扩散的程度取决于玻璃体内注射的成功与否。要实现视网膜大范围的荧光标记可能需要多次练习。操作人员的经验对于获得最佳结果至关重要。
      8. 使用剪去尖端的塑料移液管，将选定的视网膜组织转移至载样膜上（参见载样膜操作步骤）。用一对直镊将视网膜展平，使神经节细胞层（GCL）朝上。
      9. 使用连接100 µL吸头的塑料移液器移除培养基，使视网膜组织贴附于多孔膜上。将装置翻转至MEA上，使神经节细胞层（GCL）位于电极上方。
      10. 用充氧的Ames培养基填充样品槽。

3. 离体 电刺激下的钙成像

注意：本研究中使用了一种概念验证性的MEA 离体 实验。定制的微电极阵列（MEA）采用直径为25 µm的多孔石墨烯基电极，制备于500 µm厚的硼硅酸盐玻璃上，带有Ti/Au导线，并随后用氮化硅和SU-8光刻胶进行绝缘处理。12然而，钙成像方法的有效性不受用于刺激的电极材料影响。

  1. 设置灌流系统，使含氧的Ames培养基以5 mL/min的恒定流速持续灌流样品浴，并维持温度为33 °C。
  2. 使用配备荧光灯、FITC滤光片组和CMOS相机的倒置荧光显微镜，观察视网膜上刺激电极与表达GCaMP的细胞荧光均可见的区域。本研究使用20倍、数值孔径（NA）为0.75的干镜物镜。
    注意：为了有效通过电极刺激（并记录）细胞，视网膜与电极必须紧密接触，因此细胞应与电极处于同一焦平面。若未达到此状态，请从第8步开始重复视网膜分离操作。当使用来自健康动物模型（具有正常功能的感光细胞）的视网膜时，需注意每次打开荧光灯都会因视网膜对激发GCaMP传感器所用波长的光敏感而引发一定的反应。这些光诱导的钙信号变化可用于评估组织的健康状况。为避免光刺激与电刺激诱发的反应混淆，在开始图像采集前至少1分钟开启荧光灯。
  3. 为在神经节细胞层（GCL）中诱发电刺激响应，选择一个电极发送电流控制脉冲。在脉冲发生器设备的软件中设置电刺激参数，例如脉冲的波形、幅度、持续时间、相位延迟和频率。
    注意：有效的刺激参数差异较大，脉宽范围可从50 µs到100 ms，幅度范围为0.1 µA至10 µA。这些参数，连同刺激频率、刺激极性、脉冲数量和相间延迟，均可能影响钙成像所观察到的时空响应19,20,21,22。通常，一组40个双相脉冲（每个脉冲1 ms，2 µA）常可在标记的神经元中引发可观察的响应。
  4. 为同步图像采集与刺激施加过程，使用脉冲发生器作为外部触发信号来控制图像采集的启动。通过输出触发信号将相机（见材料表）与脉冲发生器连接，并将相机软件中的"采集模式"设置为"外部启动触发"。在相机软件中点击“开始”，使其等待外部触发信号启动采集。随后通过脉冲发生器软件启动图像采集。
    注意：不同相机的外部触发设置可能有所不同。本研究通常以每秒10帧的速度采集1分钟的图像（512 × 512像素，16位灰度），每10秒施加一次双相脉冲串。脉冲在10秒后开始，因此所有实验的前若干帧对应自发活动。根据所使用的GCaMP传感器及后续分析需求，可能需要根据钙指示剂的上升和衰减时间调整记录速率8。请考虑钙指示剂对单个动作电位的检测灵敏度15。
  5. 将图像保存为包含所用电刺激参数的文件名，例如[电极编号]_[脉冲幅度]_[脉冲持续时间]_[脉冲频率]_Image001。

4. 数据分析

  1. 使用 ImageJ/FIJI 从细胞胞体中提取随时间变化的荧光强度分布及空间坐标
    1. 使用 "区域选择工具"对感兴趣区域（ROI）进行分割，并将其添加到 ROI 管理器中（分析 > 工具 > ROI 管理器 > 添加）。在 ROI 管理器菜单中，将其保存为 .zip 文件夹（更多 > 保存）。
      注：通常情况下，相同的 ROI 可应用于所有刺激实验，因为它们对应于相同的视野（FOV）。
    2. 选择 "平均灰度值"作为待提取参数（分析 > 设置测量值）。
    3. 通过点击 更多 > 多次测量，从细胞胞体中提取 "平均灰度值"。此时将弹出一个对话框。启用 测量全部 600 帧 和 每帧对应一行 选项，以生成一个列对应 ROI、行对应时间帧的单一表格。将生成的表格保存为 .xls 电子表格文件。
    4. 选择 "质心"作为待提取参数（分析 > 设置测量值）。
    5. 通过点击 测量，从 ROI 中提取 "质心"。生成的表格对应于 ROI 的坐标（X, Y）。将其保存为 .xls 电子表格文件。
  2. 自定义脚本用于识别对刺激有响应的细胞
    注：此处使用了 MATLAB（参见材料表），但所描述的步骤可在任何编程语言中实现。用户可通过联系通讯作者获取我们的自定义脚本。
    1. 光漂白效应校正：为减轻背景信号和光漂白效应，从每次脉冲串刺激前的非刺激期选取 15–20 帧，并将其拟合为线性曲线 [拟合 (poly1)]。
      注：在此示例中，对于总帧数为 600 帧、每 10 秒周期性发送脉冲串的视频，非刺激期包括帧 1:90、170:190、270:290、370:390、470:490 和 570:590。
    2. 使用公式进行归一化：(X - min) / (max - min)
    3. 识别响应细胞
      1. 计算归一化数据中非刺激期的均方根（RMS），该值将被视为基线信号。
      2. 计算刺激期（非刺激期间的帧段）的最大值。在此示例中，对于总帧数为 600 帧、每 10 秒周期性发送脉冲串的视频，刺激期包括帧 91:169、191:269、291:369、391:469 和 491:569。
      3. 若某一特定 ROI 在某个刺激期的最大值超过基线信号的 2.5 倍，则标记该细胞对该刺激期有响应。若该细胞在五个刺激期中有三个产生响应，则将其归类为响应细胞。

结果

本研究中描述的实验方案基于 Weitz 等人进行的荧光成像与电刺激研究12。该方案包括三个主要部分：（1）对神经节细胞层（GCL）进行荧光标记，并将视网膜平铺固定在多电极阵列（MEA）上（图1-左）；（2）在电刺激过程中可视化GCL的钙活动（图1-中）；（3）成像数据的提取、处理与解释（图1-右）。

首先，如图1-左侧所示，在成像前将AAV2-CAG-GCaMP5G通过玻璃体内注射至Long Evans大鼠眼内。该病毒载体的最佳表达时间为注射后2至3周12,18。在动物完全麻醉后，先用30 G针头钻出引导孔，然后使用连接在精密注射器上的36 G钝头针缓慢向玻璃体腔内注射5 µL AAV2-CAG-GCaMP5G，以防止反流。在病毒表达期间，采用in vivo视网膜成像系统评估术后视网膜状态，其中OCT图像可提供视网膜各层的详细可视化信息。待基因表达完成后，使用体视显微镜和高精度解剖工具小心地从眼球杯状结构中取出视网膜组织。此后，所有操作均在充氧的培养介质中进行，以保持组织活性。将取出的视网膜组织神经节细胞层（GCL）朝上，置于专为平铺制备设计的平台上，以确保稳定性并防止样本漂浮。随后将样本以GCL面向电极的方式固定在MEA表面。

接下来，将MEA安装在倒置荧光显微镜上的接口板中（图1-中图）。使用灌流系统以33 °C的含氧培养基对视网膜样本进行灌流。样本在此条件下可维持数小时。设定所需的刺激方案，并以每秒10帧的速度采集图像。建议根据所施加的电刺激参数命名视频文件。应在启动刺激前开始图像采集，以获取部分无刺激的基线帧，作为阴性对照。

最后，如图1-右侧所示，通过分割细胞胞体从延时图像中提取数据。对光漂白效应通过数据拟合进行校正，并识别出有响应的细胞。有响应的细胞定义为在刺激期间荧光峰值超过其基线水平2.5倍的细胞。若一个细胞在五次刺激脉冲中有三次产生响应，则认为该细胞对该特定刺激序列有响应。

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图1研究概述 视网膜GCL荧光标记及样品制备流程示意图（左）、实验装置准备（中） 离体 通过MEA提供电刺激进行记录（左），以及分析钙成像数据以分类响应性细胞（右）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

玻璃体内注射的视网膜
玻璃体内注射相关并发症的发生率极低。然而，无论注射何种成分，手术本身均可能引发某些并发症。这些并发症包括白内障形成、玻璃体出血、眼内压升高以及眼内炎23。为确定这些并发症是否由手术引起，需在手术前通过检眼镜检查和光学相干断层扫描（OCT）对动物进行评估。注射后第3天应进行随访观察。在图2A–D中，展示了健康动物注射后的视网膜情况。注射两周后，视网膜神经节细胞（RGCs）开始表达荧光，可通过荧光眼底成像观察到（图2B、C）。OCT图像可清晰显示视网膜各层的排列结构和厚度（图2D），其分辨率高于眼底成像，尤其适用于评估视网膜脱离情况。当视网膜经铺片处理并使用倒置荧光显微镜成像后，可进一步区分细胞及轴突束。与其他钙离子指示剂不同，GCaMP指示剂局限于细胞质7，细胞核区域无荧光信号（图2E）。

使用OCT扫描和眼底摄影进行视网膜成像序列，显示详细的眼部结构。
图2：玻璃体内注射后视网膜的代表性图像。 （A）眼底检查图像，（B）荧光眼底成像，（C）荧光眼底成像的放大图，（D）OCT图像，以及（E）将切除的视网膜安装在定制MEA上后获得的表层荧光图像，该MEA采用基于石墨烯的电极并置于500 µm厚的硼硅酸盐玻璃上。在（E）中，黑色线条对应Ti/Au导迹。比例尺：115 µm（D）和100 µm（E）。 请点击此处查看此图的放大版本。

电极与GCL接触
为了有效诱发神经反应，必须确保平铺的视网膜与MEA表面紧密接触。一种简单的验证方法是通过显微镜观察细胞与电极是否位于同一焦平面（图3A）。如果细胞与电极不在同一焦平面（图3B），则表明接触不理想，这将导致刺激效果降低。

显示具有胆碱能神经元标记的黑斑的荧光显微镜图像，对比图像。
图3：电极与颗粒层（GCL）接触情况。（A）细胞与电极（星号）位于同一焦平面。（B）细胞与电极不在同一焦平面，表明该区域的电刺激接触不理想。请点击此处查看该图的放大版本。

离体 条件下通过微电极阵列（MEA）提供的电刺激进行钙成像
钙成像所获得的数据包含时间序列图像，用于监测数百个细胞在电刺激下的神经活动。超阈值刺激会引起细胞胞体内钙离子流入，导致荧光强度突然变化（视频 1）。本方案可用于确定某个电极、MEA 和/或刺激算法是否在神经组织中引发预期的反应。MEA 上电极的尺寸与间距，以及所研究组织的比例，将决定应选用的物镜放大倍数。通常情况下，对于电极直径在 5 µm 至 100 µm 范围内的单电极刺激实验，选用 20–25 倍物镜放大倍数较为合适（图 4A），可提供约 600 µm × 600 µm 的视场（FOV）。对于涉及多电极刺激的实验，则可能需要使用 4–10 倍物镜放大倍数，以评估约 2 mm × 2 mm 的更大区域。通过生成时间序列视频的标准差图像投影，可轻松识别有反应的细胞（图 4B 和 视频 1）。

神经科学显微镜、脑组织中的光学激发、荧光成像、神经元活动。
图 4：通过直径为 25 µm 的电极进行电刺激下对颗粒层（GCL）进行钙成像。 （A）60 秒时间序列视频的最大投影图像，以及（B）标准差投影图像，清晰显示了对直径为 25 µm 的多孔石墨烯基电极所施加的电刺激产生响应的细胞。刺激电极位置以星号标示。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

在受控刺激下随时间变化的钙动力学分析
针对每个已识别的细胞胞体，提取其随时间变化的平均荧光强度值。图5A展示了来自响应性细胞的经光漂白校正后的钙信号轨迹。在此示例中，在60秒的成像过程中，每隔10秒施加一次双相脉冲串刺激（阴极优先，40个周期，脉宽1 ms，幅值2 µA），共施加五次（由黑色竖线标示）。在单次实验中，重复应用相同的五个脉冲串以检测响应的一致性。非刺激期间采集的图像帧（以红色高亮）用于进行线性拟合，以校正光漂白效应。

一旦确定了响应细胞，并且已知它们相对于刺激电极的坐标（x，y），就可以分析激活这些细胞所需的电流与距刺激电极距离之间的关系（图5B）。正如预期的那样，距离刺激电极较近的细胞需要较低的电流即可引发反应。

荧光强度图和脉冲幅度图；含光谱数据的瞬态分析。
图 5：电刺激诱发反应的示意图。 （A）在60秒图像采集期间，每10秒施加一次脉冲串刺激（双相、阴极优先、40个周期、持续时间1 ms、幅度2 µA），共5次脉冲串，细胞胞体的钙信号轨迹（黑色线条）。图中显示了非刺激时段（红色高亮帧）和刺激时段（黄色高亮帧）。信号强度超过非刺激时段基线信号（非刺激时段的均方根值）2.5倍的轨迹被视为诱发反应。在五次刺激时段中，有三次产生反应的细胞被归类为响应细胞。（B）钙活动分布图，显示刺激电极（黑色轮廓圆圈）和细胞（灰色轮廓圆圈）。颜色编码表示诱发细胞反应所需的最小脉冲幅度。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：通过直径为 25 µm 的电极进行电刺激，对神经节细胞层进行钙成像。 该视频展示了由基于多孔石墨烯、直径为 25 µm 的电极施加电刺激后，荧光强度的变化情况。左侧为原始视频，右侧为标准差投影图像，可清晰识别出响应细胞。比例尺：50 µm。请点击此处下载该视频。

讨论

此处所述方案用于研究大鼠视网膜神经节细胞层中的钙动力学 通过MEA提供的电刺激进行记录。该方法可靠且易于操作，但需要经过一定培训，特别是需掌握如何高效地对GCL进行均匀标记，以及如何正确安装视网膜以确保组织与电极之间的最佳接触。本方案专用于啮齿类动物，若应用于其他实验动物物种，则需进行相应调整。文中详细阐述了该方法的关键步骤、改良措施及局限性。

玻璃体内注射
注射法被广泛应用于眼部基因递送，其中玻璃体内注射是首选方法。与将目标分子直接注入光感受器与视网膜色素上皮（RPE）之间的视网膜下注射相比，玻璃体内注射已被证实更安全且侵入性更小，可降低视网膜脱离的风险10。然而，该方法也存在局限性，尤其是在啮齿类动物模型中进行注射时尤为明显。玻璃体呈凝胶状，会阻碍病毒的扩散；此外，啮齿类动物眼球的晶状体较大，使得在不划伤晶状体的情况下插入针头具有挑战性。精密注射针头较为脆弱，需频繁更换。为防止堵塞，每次使用前后均应用去离子水冲洗针头，并定期更换。此外，应缓慢注射内容物，以避免溶液反流和眼内压变化。要在整个视网膜上实现强而均匀的荧光信号，可能需要反复练习。

视网膜细胞转导
病毒载体是一种极佳的方法 体内 基因递送，且腺相关病毒（AAVs）已广泛用于转导视网膜细胞10已获批用于治疗某些导致人类失明的视网膜病变24然而，其载体容量仅限于5 kb，包括必需的调控元件（如启动子）10,25有多种血清型可供选择，每种具有不同的嗜性。应根据拟递送的基因和待转导的细胞类型选择最合适的腺相关病毒（AAV）。26对于标记RGCs，建议使用AAV227.

基因表达时间窗口
AAV2-CAG-GCaMP5G 注射后的最佳病毒表达时间为 2 至 3 周12,18。超过该时间范围后，转染细胞的细胞核会呈现荧光，细胞对刺激的反应能力停止，并最终死亡7,28,29。这是由于 GCaMP 指示剂过表达并被转运至细胞核所致。最佳基因表达的时间窗口会因病毒载体和所选启动子的不同而有所差异30，在开展本实验方案前需通过实验确定。

组织-电极接触
为了获得最佳且可重复的实验结果，实现良好的组织-电极接触至关重要。接触不良通常源于视网膜的自然曲率。一种解决方法是将视网膜切成四等份，每次安装并成像其中一部分。较小的视网膜区域更容易展平，从而与多电极阵列（MEA）表面实现更有效的接触。导致接触不良的另一个可能原因是玻璃体的存在。在进行模拟表层视网膜植入物的刺激实验时，必须在视网膜切除过程中仔细去除玻璃体，因为它可能对电流起到绝缘作用。本文介绍了一种简单的方法，通过在同一焦平面上同时观察电极和细胞来判断接触是否充分。

一种替代方案 离体 在电极表面直接培养神经元是进行视网膜测量的一种方法。例如海马神经元的原代神经元培养31可用于初步测试以评估新型刺激装置的功能性。然而，该方法仍需使用实验动物，且无法体现视网膜网络的复杂性，而视网膜网络的复杂性对于评估突触对刺激的反应至关重要。

为了观察电极及电极走线下方的细胞，可使用由透明材料（如氧化铟锡（ITO））制备的微电极阵列（MEA）19,20,32。除了光学测量外，还可通过电记录来评估电刺激下神经节细胞层（GCL）的活动。MEA可用于记录组织的局部场电位（LFP）。然而，这种方法的空间分辨率较低，因为每个电极会同时捕获多个细胞的活动信号（取决于电极的尺寸）。光学记录克服了这一局限性，能够实现更高空间分辨率的成像。其主要优势在于能够在以单细胞分辨率测量大视野（FOV）的同时，区分活跃与非活跃的细胞。在所有细胞活动报告分子中，钙离子指示剂已被充分表征，并且应用最为广泛33。

披露

作者无任何披露信息需添加至稿件。

致谢

我们感谢 ICFO-光子科学研究所的 Merche Rivas、Angel Sandoval、Jesús Planagumà、Jordi Cortés、Sandra Ortonobés Lara 和 Alina Hirschmann 提供的技术支持，感谢瓦尔德布伦研究研究所（VHIR）眼科研究团队的 Anna Duarri 在玻璃体内注射方面的协助以及 体内 视网膜成像

支持本工作的资助机构包括：Fundació CELLEX；Fundació Mir-Puig；西班牙经济与竞争力部—Severo Ochoa卓越中心计划&D（CEX2019-000910-S，[MCIN/AEI/10.13039/5001100011033]）；加泰罗尼亚自治区政府通过CERCA项目资助；Laserlab-Europe（欧盟“地平线2020”计划，资助号871124）；La Caixa基金会（LCF/HR19/52160003）；以及欧洲社会基金（PRE2020-095721，M.C.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20x NA 0.75 S Fluor 空气物镜NikonCFI Super Fluor 20X-
3.5 cm 细胞培养皿Nunc12-565-90-
30 G 针头VWR613-5373-
36 G 钝头针World Precision InstrumentsNF36BL-2-
6 cm 细胞培养皿Nunc12-565-94-
AAV2-CAG-GCaMP5G Vector Biolabs--
Ames 培养基Sigma AldrichA1420-
刀片Swann-morton0308-
相机HamamatsuORCA Flash v4.0-
碳酰气（Carbogen）Air liquide--
弯头镊子 ---
精细弹簧剪FST91501-09-
FITC 滤光片组NikonStandard series-
荧光灯Nikon C-HGFI-
荧光体视显微镜 NikonSMZ25-
HBSSCapricornHBSS-1A-
ImageJ/FIJI NIHv1.50i-
活体视网膜成像系统 Phoenix Research LaboratoriesMicron III-
倒置荧光显微镜NikonEclipse Ti-
异氟烷Arrane Baxter Laboratories--
Long-Evans 大鼠Janvier--
MATLAB (版本 R2021b) Mathworks--
培养基过滤器MerckmilliporeSCGPS02RE-
2% 甲基纤维素（Methocel）Omni Vision--
微电极阵列（MEA）-定制
NaHCO3Thermofisher42427-
青霉素/链霉素 100xThermofisher15140122-
去氧肾上腺素（Phenylephrine）Alcon Cusí Laboratories653437.3100 mg/mL
塑料移液管VWR612-1793-
多孔膜Merckmillipore#JVWP01300-
精密注射器World Precision Instruments10 µl Nanofil-
普鲁卡因（Prescaina）Llorens-盐酸奥布卡因（2 mg/mL），局部麻醉剂
大鼠鼻罩XenotecXRK-RA-
小型弯头镊子 BbraunAESCBD311R-
弹簧剪 FST15040-11-
体视显微镜ZeissStemi 2000-
直头镊子 FST11252-20-
缝合线Vitrex Medical4328尼龙单丝，7/0，DS12
托百士（Tobradex）Alcon Cusí Laboratories-妥布霉素（3 mg/mL）和地塞米松（1 mg/mL）
托吡卡胺（Tropicamide）Alcon Cusí Laboratories65348610 mg/mL
垫圈ThorlabsW8S038-

参考文献

  1. Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
  2. Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
  3. Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
  4. Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , Elsevier. 469-496 (2013).
  5. Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
  6. Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
  7. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  8. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  9. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  10. Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135(2021).
  11. Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  12. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
  13. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
  14. Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
  15. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
  16. Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. NIH Guidelines April 2019. Applied Biosafety. 24, Preprint at https://doi.org/10.1177/1535676019871146 (2019).
  17. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  18. Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018(2017).
  19. Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
  20. Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017(2019).
  21. Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002(2016).
  22. Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
  23. Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
  24. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
  25. Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291(2023).
  26. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  27. Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
  28. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
  29. Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504(2018).
  30. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
  31. Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829(2022).
  32. Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
  33. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

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