本文建立了一种从玻璃体和房水中提取游离细胞DNA以进行分子学研究、从而诊断玻璃体视网膜淋巴瘤的方法。该方法能够同时从样本的细胞成分中提取DNA，或将其保留用于其他辅助检测。
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摘要
摘要
玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是一种侵袭性淋巴瘤，通常归类为原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤。诊断VRL时，通常采集玻璃体液，近年来也采集房水样本。对这些样本的诊断检测包括细胞学、流式细胞术和分子检测。然而，细胞病理学和流式细胞术，以及基于细胞DNA的分子检测，均需要完整完整的细胞。难点在于，玻璃体和房水通常细胞含量较低，且在采集、储存和处理过程中许多细胞会被破坏。此外，由于玻璃体液黏度高，且玻璃体和房水样本体积小，这些样本在进行分子检测时还面临额外困难。本研究提出一种从玻璃体和房水样本中提取无细胞DNA的方法。该方法可作为细胞DNA提取的补充，或使这些样本的细胞成分可用于其他诊断方法，包括细胞学和流式细胞术。
引言
玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是一种侵袭性淋巴瘤，与原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤相关1,2,3。由于累及中枢神经系统，VRL通常具有致命性1,2。尽管该病较为罕见1,4，但其临床表现常与后部葡萄膜炎及其他玻璃体视网膜疾病相似4,5。因此，出现葡萄膜炎症状的患者需进行诊断，以确认或排除VRL的可能性。
近期已发布诊断VRL的共识标准，该标准结合了临床检查和实验室检查结果6。用于诊断VRL的常见标本包括玻璃体液，以及近期应用的房水7。玻璃体液通过一种称为经平坦部玻璃体切除术的外科手术获取，该手术可进入眼球的后段结构8。
在本方案中，采集了房水和玻璃体液样本用于细胞和游离DNA（cfDNA）的提取。在对患者进行麻醉后，于角膜缘约4 mm处放置套管，使用1 mL结核菌素注射器在角膜缘处采集约100–200 µL的房水样本。对于人工晶状体眼患者，通过向灌注液中注入无菌空气以获取未稀释的玻璃体液，从而可采集较大体积的未稀释玻璃体液（最多达3.5 mL）。对于自然晶状体眼患者，在开启平衡盐溶液灌注前，先移除约500至1000 µL的未稀释玻璃体液。在某些情况下，通过切换灌注液并将在玻璃体基底部操作的玻璃体切割头采集500至2,000 µL的二次稀释玻璃体液。最稀释的玻璃体组分则通过在手术结束时保留 cassette 袋（补充图1）获得；当该袋送达病理科后，将袋中流出的液体收集至锥形管中，以获取稀释玻璃体液用于后续DNA提取。
玻璃体液的细胞病理学检查通常被视为金标准9。然而，多项研究表明，由于样本处理过程以及细胞数量过少，其敏感性有限10,11,12。流式细胞术有助于识别克隆性B细胞，但也可能受限于细胞数量少以及大淋巴瘤细胞的脆弱性13,14,15。细胞病理学和流式细胞术均需要完整的全细胞。然而，许多细胞在样本采集、储存和处理过程中已被破坏。当使用从完整细胞中提取的DNA（细胞DNA）进行分子检测时，同样受到这一限制的影响。此外，将有限的玻璃体样本分配用于上述各项检测，会进一步减少每项检测可用的材料量。
游离细胞DNA（cfDNA）是另一种无需完整细胞的DNA来源。已利用玻璃体样本中的cfDNA检测玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）16，17以及葡萄膜黑色素瘤18。本方案中，从玻璃体和房水中提取细胞及游离细胞DNA，用于检测VRL。
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方案
本方案遵循人体研究伦理指南，并已获得密歇根大学机构审查委员会（IRB）的批准。本研究已从IRB获得知情同意豁免。所涉及患者无相关纳入或排除标准。
1. 细胞组分与无细胞组分的分离
注意：玻璃体腔液（VRL）诊断检测可接收三种类型的样本：未稀释的玻璃体液（玻璃体切除术中开始灌注前采集的液体）、保存在盒式袋中的稀释玻璃体液（图1），以及房水（来自眼球前房的液体）。
- 对于未稀释的玻璃体液（黏度较高），用 3–5 mL PBS 稀释以方便移液操作。
- 对于保存在盒袋中的稀释玻璃体液（补充图 1），将液体排入 50 mL 锥形管中（每 45 mL 液体使用一支管）。
- 房水体积非常小（<200 µL）。为最大限度回收细胞，将样本转移至 1.5 mL 离心管中，用与样本等体积的 PBS 冲洗原采集样本所用的 500 µL 微量离心管，并将冲洗液加入 1.5 mL 管中。
- 在室温下以 3,000 × g 离心 15 分钟，沉淀玻璃体液或房水中的细胞。
- 用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
2. 从细胞组分中提取DNA
- 加入适量的细胞裂解液（小量沉淀加 300 µL，大量沉淀加 1 mL 或更多）（参见 材料表）。用移液器反复吹打混匀。
- 待细胞完全裂解后，加入相当于裂解液体积 1/3 的蛋白沉淀液（300 µL 裂解液加 100 µL）（参见 材料表）。
- 剧烈涡旋振荡 20–30 秒。室温下以 3,000 x g 离心 3 分钟。
- 将 300 µL 异丙醇加入一个干净的微量离心管中。小心地将上一步的上清液移入含异丙醇的离心管中。
- 加入 1.5 µL 的 20 mg/mL 糖原溶液（适用于 300 µL 裂解液）（参见 材料表）。
- 充分颠倒混匀，然后将样品置于 -20 °C 冰箱中静置 1 小时至过夜，以促进 DNA 沉淀。
- 将 1.5 mL 离心管在室温下以 3,000 x g 离心 5 分钟。用移液器吸除异丙醇。
- 加入 0.5 mL 70% 乙醇，颠倒混匀以洗涤沉淀。
- 室温下以 3,000 x g 离心 1 分钟，倾去乙醇。重复乙醇洗涤一次。
- 将离心管倒置于干净的纱布上，使液体流尽并干燥沉淀，或直接倾去残留液体。短暂离心收集管壁残留液滴，并用细尖一次性移液器吸头吸除残留的乙醇液滴（当管内无可见乙醇残留时，DNA 即已干燥，可在 5–10 分钟内进行水合）。
- 向干燥的 DNA 沉淀中加入 45 µL DNA 水合液（参见 材料表）。
- 将离心管置于 50 °C 金属浴中，孵育 1–2 小时以促进溶解。用移液器反复吹打以加快水合过程。
注意：若样品黏度过高，可适量增加 DNA 水合液体积。
3. 无细胞DNA提取
- 步骤 1.5 中的上清液量是可变的。每毫升上清液中加入 70 µL 裂解缓冲液（见材料表）。
- 通过涡旋充分混匀澄清珠。若处理的无细胞上清液量 <14 mL，则加入 10 µL 澄清珠；若处理量为 14–40 mL，则加入 20 µL。
- 通过涡旋充分混匀样品与珠子的混合物。在室温下以 3,000 × g 离心 15 分钟。
- 吸取上清液时避免扰动沉淀，若使用了 10 µL 澄清珠，则保留 100 µL 上清液；若使用了 20 µL 澄清珠，则保留 200 µL。
- 向沉淀中加入等体积的尿液沉淀消化缓冲液（见材料表），并通过涡旋或移液充分重悬沉淀。
- 向重悬的沉淀中加入蛋白酶 K（终浓度为 5% (v/v)）（例如，向 200 µL 混合液中加入 10 µL 蛋白酶 K），并轻轻涡旋充分混匀。
- 将沉淀混合物在 55 °C 下孵育 30 分钟。
- 向消化混合物中加入等体积的基因组裂解缓冲液（见材料表）（例如，向 210 µL 消化混合物中加入 210 µL 基因组裂解缓冲液），并通过涡旋混匀。
- 将市售的离心柱（见材料表）转移至新的收集管中。
- 向离心柱中加入 200 µL 尿液 DNA 制备缓冲液，在室温下以 ≥16,000 × g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
- 向柱中加入 700 µL 尿液 DNA 洗涤缓冲液，在室温下以 ≥16,000 × g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
- 用 200 µL 尿液 DNA 洗涤缓冲液重复此步骤一次。
- 将离心柱转移至无 DNase/RNase 的微量离心管中。
- 根据后续分子检测的需求，加入适量的 DNA 洗脱缓冲液，直接加至柱基质上，在室温下静置 3–5 分钟。
注意：在示例中使用了 30 µL 洗脱缓冲液。若需进行更多检测，可增加洗脱缓冲液用量。 - 在室温下以 ≥16,000 × g 离心 1 分钟，收集无细胞 DNA 洗脱液。
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结果
这些提取方法应用于少量病例，以确保无细胞DNA的得率和可扩增性与玻璃体（4例）和房水（4例）样本中的细胞DNA相比具有可比性。从这些样本中获得的结果显示，这些体液中无细胞组分的DNA得率与细胞组分相近（表1）。还通过分子检测方法对这些样本的细胞DNA和无细胞DNA（cfDNA）进行了评估，例如检测与玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）相关的MYD88 L265P突变。针对MYD88 L265P的等位基因特异性实时PCR检测（图1）显示，该VRL相关突变在细胞DNA和cfDNA中均可检出。在此例中，无细胞组分的疾病负荷似乎更高，表现为更低的循环阈值（Ct）。这些数据表明，采用本方法从玻璃体和房水中提取的cfDNA可作为诊断性分子检测的有效DNA来源。
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讨论
玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是一种侵袭性大的B细胞淋巴瘤1,2,3，其症状可能与其他玻璃体视网膜疾病相似4,5。近年来，对玻璃体液以及房水进行分子检测已成为诊断或排除VRL的关键方法。然而，这些液体样本体积非常小，且通常细胞含量较低。在采集、储存和处理过程中，其中许多细胞也可能受到损伤13,14,15。因此，从这些标本中提取的DNA产量通常较低。此外，这些液体中的细胞还需用于其他诊断方法，包括细胞病理学和流式细胞术。这些液体中的游离DNA（cfDNA）提供了另一种无需完整细胞即可获取DNA的来源。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Timothy Daniels、MLS(ASCP)、MB、QLS 以及 Helmut Weigelin、MLS(ASCP) 在我们实验室建立该提取方法的过程中发挥了关键作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-丙醇（异丙醇） | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene 细胞裂解液 | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA 水合溶液 | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene 蛋白沉淀溶液 | Qiagen | 158912 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA 尿液提取试剂盒 | Zymo Research | D3061 | 预处理缓冲液；还包括澄清珠、蛋白酶K和离心柱 |
| 超纯糖原，20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
参考文献
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重印与许可
