玻璃体和房水标本游离DNA提取用于玻璃体视网膜淋巴瘤的诊断与监测

摘要

本文建立了一种从玻璃体和房水中提取游离细胞DNA以进行分子学研究、从而诊断玻璃体视网膜淋巴瘤的方法。该方法能够同时从样本的细胞成分中提取DNA，或将其保留用于其他辅助检测。

摘要

玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是一种侵袭性淋巴瘤，通常归类为原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤。诊断VRL时，通常采集玻璃体液，近年来也采集房水样本。对这些样本的诊断检测包括细胞学、流式细胞术和分子检测。然而，细胞病理学和流式细胞术，以及基于细胞DNA的分子检测，均需要完整完整的细胞。难点在于，玻璃体和房水通常细胞含量较低，且在采集、储存和处理过程中许多细胞会被破坏。此外，由于玻璃体液黏度高，且玻璃体和房水样本体积小，这些样本在进行分子检测时还面临额外困难。本研究提出一种从玻璃体和房水样本中提取无细胞DNA的方法。该方法可作为细胞DNA提取的补充，或使这些样本的细胞成分可用于其他诊断方法，包括细胞学和流式细胞术。

引言

玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是一种侵袭性淋巴瘤，与原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤相关^1,2,3。由于累及中枢神经系统，VRL通常具有致命性^1,2。尽管该病较为罕见^1,4，但其临床表现常与后部葡萄膜炎及其他玻璃体视网膜疾病相似^4,5。因此，出现葡萄膜炎症状的患者需进行诊断，以确认或排除VRL的可能性。

近期已发布诊断VRL的共识标准，该标准结合了临床检查和实验室检查结果⁶。用于诊断VRL的常见标本包括玻璃体液，以及近期应用的房水⁷。玻璃体液通过一种称为经平坦部玻璃体切除术的外科手术获取，该手术可进入眼球的后段结构⁸。

在本方案中，采集了房水和玻璃体液样本用于细胞和游离DNA（cfDNA）的提取。在对患者进行麻醉后，于角膜缘约4 mm处放置套管，使用1 mL结核菌素注射器在角膜缘处采集约100–200 µL的房水样本。对于人工晶状体眼患者，通过向灌注液中注入无菌空气以获取未稀释的玻璃体液，从而可采集较大体积的未稀释玻璃体液（最多达3.5 mL）。对于自然晶状体眼患者，在开启平衡盐溶液灌注前，先移除约500至1000 µL的未稀释玻璃体液。在某些情况下，通过切换灌注液并将在玻璃体基底部操作的玻璃体切割头采集500至2,000 µL的二次稀释玻璃体液。最稀释的玻璃体组分则通过在手术结束时保留 cassette 袋（补充图1）获得；当该袋送达病理科后，将袋中流出的液体收集至锥形管中，以获取稀释玻璃体液用于后续DNA提取。

玻璃体液的细胞病理学检查通常被视为金标准⁹。然而，多项研究表明，由于样本处理过程以及细胞数量过少，其敏感性有限^10,11,12。流式细胞术有助于识别克隆性B细胞，但也可能受限于细胞数量少以及大淋巴瘤细胞的脆弱性^13,14,15。细胞病理学和流式细胞术均需要完整的全细胞。然而，许多细胞在样本采集、储存和处理过程中已被破坏。当使用从完整细胞中提取的DNA（细胞DNA）进行分子检测时，同样受到这一限制的影响。此外，将有限的玻璃体样本分配用于上述各项检测，会进一步减少每项检测可用的材料量。

游离细胞DNA（cfDNA）是另一种无需完整细胞的DNA来源。已利用玻璃体样本中的cfDNA检测玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）^16，17以及葡萄膜黑色素瘤¹⁸。本方案中，从玻璃体和房水中提取细胞及游离细胞DNA，用于检测VRL。

方案

本方案遵循人体研究伦理指南，并已获得密歇根大学机构审查委员会（IRB）的批准。本研究已从IRB获得知情同意豁免。所涉及患者无相关纳入或排除标准。

1. 细胞组分与无细胞组分的分离

注意：玻璃体腔液（VRL）诊断检测可接收三种类型的样本：未稀释的玻璃体液（玻璃体切除术中开始灌注前采集的液体）、保存在盒式袋中的稀释玻璃体液（图1），以及房水（来自眼球前房的液体）。

1. 对于未稀释的玻璃体液（黏度较高），用 3–5 mL PBS 稀释以方便移液操作。
2. 对于保存在盒袋中的稀释玻璃体液（补充图 1），将液体排入 50 mL 锥形管中（每 45 mL 液体使用一支管）。
3. 房水体积非常小（<200 µL）。为最大限度回收细胞，将样本转移至 1.5 mL 离心管中，用与样本等体积的 PBS 冲洗原采集样本所用的 500 µL 微量离心管，并将冲洗液加入 1.5 mL 管中。
4. 在室温下以 3,000 × g 离心 15 分钟，沉淀玻璃体液或房水中的细胞。
5. 用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。

2. 从细胞组分中提取DNA

1. 加入适量的细胞裂解液（小量沉淀加 300 µL，大量沉淀加 1 mL 或更多）（参见 材料表）。用移液器反复吹打混匀。
2. 待细胞完全裂解后，加入相当于裂解液体积 1/3 的蛋白沉淀液（300 µL 裂解液加 100 µL）（参见 材料表）。
3. 剧烈涡旋振荡 20–30 秒。室温下以 3,000 x g 离心 3 分钟。
4. 将 300 µL 异丙醇加入一个干净的微量离心管中。小心地将上一步的上清液移入含异丙醇的离心管中。
5. 加入 1.5 µL 的 20 mg/mL 糖原溶液（适用于 300 µL 裂解液）（参见 材料表）。
6. 充分颠倒混匀，然后将样品置于 -20 °C 冰箱中静置 1 小时至过夜，以促进 DNA 沉淀。
7. 将 1.5 mL 离心管在室温下以 3,000 x g 离心 5 分钟。用移液器吸除异丙醇。
8. 加入 0.5 mL 70% 乙醇，颠倒混匀以洗涤沉淀。
9. 室温下以 3,000 x g 离心 1 分钟，倾去乙醇。重复乙醇洗涤一次。
10. 将离心管倒置于干净的纱布上，使液体流尽并干燥沉淀，或直接倾去残留液体。短暂离心收集管壁残留液滴，并用细尖一次性移液器吸头吸除残留的乙醇液滴（当管内无可见乙醇残留时，DNA 即已干燥，可在 5–10 分钟内进行水合）。
11. 向干燥的 DNA 沉淀中加入 45 µL DNA 水合液（参见 材料表）。
12. 将离心管置于 50 °C 金属浴中，孵育 1–2 小时以促进溶解。用移液器反复吹打以加快水合过程。
    ​注意：若样品黏度过高，可适量增加 DNA 水合液体积。

3. 无细胞DNA提取

1. 步骤 1.5 中的上清液量是可变的。每毫升上清液中加入 70 µL 裂解缓冲液（见材料表）。
2. 通过涡旋充分混匀澄清珠。若处理的无细胞上清液量 <14 mL，则加入 10 µL 澄清珠；若处理量为 14–40 mL，则加入 20 µL。
3. 通过涡旋充分混匀样品与珠子的混合物。在室温下以 3,000 × g 离心 15 分钟。
4. 吸取上清液时避免扰动沉淀，若使用了 10 µL 澄清珠，则保留 100 µL 上清液；若使用了 20 µL 澄清珠，则保留 200 µL。
5. 向沉淀中加入等体积的尿液沉淀消化缓冲液（见材料表），并通过涡旋或移液充分重悬沉淀。
6. 向重悬的沉淀中加入蛋白酶 K（终浓度为 5% (v/v)）（例如，向 200 µL 混合液中加入 10 µL 蛋白酶 K），并轻轻涡旋充分混匀。
7. 将沉淀混合物在 55 °C 下孵育 30 分钟。
8. 向消化混合物中加入等体积的基因组裂解缓冲液（见材料表）（例如，向 210 µL 消化混合物中加入 210 µL 基因组裂解缓冲液），并通过涡旋混匀。
9. 将市售的离心柱（见材料表）转移至新的收集管中。
10. 向离心柱中加入 200 µL 尿液 DNA 制备缓冲液，在室温下以 ≥16,000 × g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
11. 向柱中加入 700 µL 尿液 DNA 洗涤缓冲液，在室温下以 ≥16,000 × g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
12. 用 200 µL 尿液 DNA 洗涤缓冲液重复此步骤一次。
13. 将离心柱转移至无 DNase/RNase 的微量离心管中。
14. 根据后续分子检测的需求，加入适量的 DNA 洗脱缓冲液，直接加至柱基质上，在室温下静置 3–5 分钟。
    注意：在示例中使用了 30 µL 洗脱缓冲液。若需进行更多检测，可增加洗脱缓冲液用量。
15. 在室温下以 ≥16,000 × g 离心 1 分钟，收集无细胞 DNA 洗脱液。

结果

这些提取方法在有限数量的病例中进行，以确保无细胞DNA的得率和可扩增性与玻璃体（4例）和房水（4例）标本中的细胞DNA相比具有充分性。从这些样本中可见，这些液体中无细胞成分的DNA得率与细胞成分相似（表1）。还通过分子检测方法（如针对VRL相关突变MYD88 L265P的检测）对这些样本的细胞DNA和cfDNA进行了评估。针对MYD88 L265P的等位基因特异性实时PCR（图1）显示，该VRL相关突变在细胞DNA和cfDNA中均可检出。在此例中，无细胞成分中的疾病负荷似乎更高，表现为循环阈值（Ct）更低。这些数据表明，采用该方法从玻璃体和房水中提取的cfDNA可作为诊断性分子检测的DNA来源。

图1：MYD88 L265P 等位基因特异性实时PCR。代表性扩增曲线图，显示针对细胞DNA和无细胞DNA的MYD88 L265P等位基因特异性实时PCR结果（每个PCR反应均设复孔）。绿色线表示循环阈值（Ct）。图中标注了无细胞DNA（蓝色和棕色曲线）和细胞DNA（红色和绿色曲线）的扩增曲线（均设复孔）达到阈值的点。背景荧光信号接近1.00e-003。无细胞组分中的突变负荷更高，表现为Ct值更低。请点击此处查看该图的放大版本。

	细胞内	无细胞
玻璃体 1	130.5	67.5
玻璃体 2	337.5	105
玻璃体 3	150	168
玻璃体 4	1816	654
房水 1	58.5	40.5
房水 2	153	225
房水 3	117	454.5
房水 4	TL	27

表1：细胞及无细胞DNA提取得率。 基于荧光法定量，来自四位不同个体的四份未稀释玻璃体液和四份房水（前房）样本的DNA得率（单位：ng）。TL = 浓度过低无法定量。

补充图1：玻璃体盒袋。 含稀释玻璃体液的玻璃体盒袋示例。请点击此处下载该文件。

讨论

玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）是一种侵袭性大的B细胞淋巴瘤^1,2,3，其症状可能与其他玻璃体视网膜疾病相似^4,5。近年来，对玻璃体液以及房水进行分子检测已成为诊断或排除VRL的关键方法。然而，这些液体样本体积非常小，且通常细胞含量较低。在采集、储存和处理过程中，其中许多细胞也可能受到损伤^13,14,15。因此，从这些标本中提取的DNA产量通常较低。此外，这些液体中的细胞还需用于其他诊断方法，包括细胞病理学和流式细胞术。这些液体中的游离DNA（cfDNA）提供了另一种无需完整细胞即可获取DNA的来源。

本方案用于分离玻璃体或房水中的细胞成分和无细胞成分。由于玻璃体具有黏性，需用PBS稀释以方便移液操作。对于体积极小的房水，则需进行特殊处理，以确保最大程度回收该液体。

比较这两种组分的DNA得率表明，无细胞组分可提供大量额外的核酸。对游离DNA（cfDNA）进行分子检测，例如针对MYD88 L265P等位基因特异性实时PCR，证明玻璃体和房水中无细胞组分及有细胞组分均能检测到原发性眼内淋巴瘤（VRL）。在许多情况下，无细胞组分中VRL的相对含量高于有细胞组分（图1）。

提取玻璃体和房水的无细胞成分，可对这些体液中原本会被丢弃的部分进行分子学评估。由于玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）在细胞成分和无细胞成分中均有存在，因此可联合使用细胞DNA和游离DNA（cfDNA），以最大限度地利用这些有限标本中的DNA。或者，可将体液的无细胞成分用于分子检测，而将细胞成分用于需要完整细胞的检测，例如细胞病理学和流式细胞术。这种方法可避免将这些体液分别分装用于不同检测，从而防止因样本量不足而降低各项检测对VRL的检出敏感性。鉴于该方法在玻璃体和房水标本中已取得成功，其在其他样本量有限的体液中也可能具有应用价值，有助于增加可用于分子检测的DNA总量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-丙醇（异丙醇）	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene 细胞裂解液	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA 水合溶液	Qiagen	158916
Gentra Puregene 蛋白沉淀溶液	Qiagen	158912
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P-4417
Quick-DNA 尿液提取试剂盒	Zymo Research	D3061	预处理缓冲液；还包括澄清珠、蛋白酶K和离心柱
超纯糖原，20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010