方法文章

使用复杂脂质混合物在模拟研究中实现逼真的膜建模

DOI：

10.3791/65712

⸱

2023年9月1日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York at Buffalo, 2Department of Mathematics, State University of New York at Buffalo

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

膜脂质在结构和组成上的多样性对细胞过程具有重要影响，并可作为疾病的标志物。分子动力学模拟使我们能够在原子分辨率水平上研究膜及其与生物分子的相互作用。本文提供了一种构建、运行和分析复杂膜系统的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂质是细胞膜的结构基本组成单元；不同细胞器及不同生物体中的脂质种类各不相同。这种多样性导致膜具有不同的力学和结构特性，直接影响发生在该界面上的分子及其相关过程。脂质组成具有动态性，可调节细胞信号传导过程。计算方法正被越来越多地用于预测生物分子间的相互作用，并为实验观测结果提供分子层面的解释。分子动力学（MD）是一种基于统计力学的技术，可根据作用在原子上的力来预测其运动轨迹。MD模拟可用于表征生物分子之间的相互作用。本文简要介绍该技术，为希望开展脂质双分子层模拟的初学者概述实际操作步骤，使用易于上手的软件演示具体操作流程，并讨论该过程中的可选方案、挑战及重要注意事项。特别地，我们强调在模拟中使用复杂脂质混合物的重要性，以准确再现目标细胞膜所需的疏水环境和力学环境。此外，我们还讨论了一些实例，说明膜的组成和性质如何调控双分子层与其他生物分子之间的相互作用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂质是细胞膜的主要组成成分，可为细胞提供边界并实现细胞内区室化1,2,3。脂质具有两亲性，包含一个极性头部基团和两条疏水性脂肪酸链；这些分子可自组装形成双分子层，以最大限度减少疏水性脂肪酸链与水的接触3,4。亲水性头部基团与疏水性脂肪酸链的不同组合，导致生物膜中存在多种类型的脂质，例如甘油磷脂、鞘脂和固醇类脂质（图1）1,5,6。甘油磷脂是真核细胞膜的主要结构单元，由甘油磷酸、长链脂肪酸以及低分子量的头部基团组成7。脂质的命名基于其头部基团的差异，常见的例子包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）以及未修饰的磷脂酸（PA）5,6。至于疏水性脂肪酸链，其长度、饱和度以及骨架结构均存在差异。这些变量的可能组合极为丰富，导致哺乳动物细胞中存在数千种不同的脂质分子6。细胞膜脂质组成的改变会引起膜的力学和结构特性的变化，从而影响整合膜蛋白和外周膜蛋白的功能活性2,6。

脂质结构示意图；甘油磷脂、鞘脂、甾醇；化学式。
图1．代表性脂质结构。 脂肪酸链以蓝色框表示，常见的脂质头部基团为橙色，骨架示例为紫色。 请点击此处查看此图的放大版本。

脂质在细胞过程、信号级联中的蛋白质激活以及健康细胞稳态中发挥着重要作用8,9脂质代谢异常是感染所致的结果，也可能是疾病发病机制的标志物10,11,12,13,14,15作为细胞的屏障，膜脂质及其在小分子渗透中作用的研究对于药物递送系统和膜破坏机制具有重要意义16,17细胞器、组织和生物体间脂质种类的化学多样性和不同比例导致了复杂的膜动力学2因此，在脂质双分子层的建模研究中保留这些特性尤为重要，特别是当研究目的是探讨其他生物分子与膜之间的相互作用时。模型中所考虑的脂质种类取决于目标生物体及特定的细胞区室。例如，磷脂酰甘油（PG）脂质在光合细菌的电子传递过程中具有重要作用。18而磷酸化肌醇脂质（PIPs）在哺乳动物细胞质膜（PM）动态变化和信号转导级联中起着关键作用19,20细胞内，质膜（PM）、内质网（ER）、高尔基体和线粒体膜含有独特的脂质丰度，这些脂质影响其功能。例如，内质网是脂质生物合成的中心，负责将胆固醇转运至质膜和高尔基体；其脂质种类多样，富含磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），但固醇含量较低，有利于维持膜的流动性21,22,23,24相比之下，质膜包含数百甚至数千种脂质分子，具体种类数量取决于生物体25，其含有高水平的鞘脂和胆固醇，与其他细胞膜相比具有特征性的刚性24应考虑膜的不对称性，例如质膜（PM），其外层小叶富含鞘磷脂、PC 和胆固醇，而内层小叶富含 PE、PI 和 PS，这些成分在信号转导级联中具有重要作用。24最后，脂质的多样性还会促进形成在排列和内部有序性上不同的微区，即所谓的脂质筏24,26；这些结构表现出侧向不对称性，被认为在细胞信号传导中发挥重要作用26，且由于其瞬态特性而难以研究。

荧光透视、光谱学以及巨型单层囊泡（GUVs）等模型膜系统等实验技术已被用于研究生物分子与膜之间的相互作用。然而，仅依靠实验方法难以充分捕捉所涉及组分的复杂性和动态特性。例如，在成像蛋白质跨膜区域、研究中所用膜系统的复杂性，以及识别目标过程中的中间态或瞬时态等方面均存在局限性27,28,29。自20世纪80年代分子模拟技术被应用于脂质单层和双层体系以来29，如今已能够在分子水平上量化脂质-蛋白质系统及其相互作用。分子动力学（MD）模拟是一种常见的计算技术，其基于分子间作用力预测粒子的运动行为。加和性相互作用势能用于描述系统中粒子之间的键合与非键合相互作用30。用于模拟这些相互作用的一组参数称为模拟力场（FF）。这些参数来源于从头计算（ab initio）、半经验方法和量子力学计算，并经过优化以重现X射线和电子衍射实验、核磁共振（NMR）、红外光谱、拉曼光谱以及中子散射等多种实验方法所得的数据31。

分子动力学（MD）模拟可用于研究不同分辨率水平的系统32,33,34。旨在表征特定生物分子相互作用、氢键及其他高分辨率细节的系统通常采用全原子（AA）模拟进行研究。相比之下，粗粒化（CG）模拟将原子归并为较大的功能基团，以降低计算成本并考察更大尺度的动力学行为33。介于两者之间的是联合原子（UA）模拟，其中氢原子与其相应的重原子合并，以加快计算速度33,35。分子动力学模拟是研究脂质膜动力学及其与其他分子相互作用的有力工具，可为膜界面感兴趣过程提供分子层面的机制解释。此外，分子动力学模拟还可用于缩小实验研究目标范围，并基于微观相互作用预测特定系统的宏观分子性质。

简而言之，在给定一组初始坐标、速度以及恒定温度和压力等条件的情况下，通过数值积分相互作用势能和牛顿运动定律，计算每个粒子的位置和速度。该过程被反复迭代，从而生成模拟轨迹30。这些计算由分子动力学（MD）引擎执行；在多个开源软件包中，GROMACS36 是最常用的引擎之一，也是本文所描述的引擎。GROMACS 还包含用于分析以及构建待模拟系统初始坐标的工具37。其他 MD 引擎包括 NAMD38、CHARMM39 和 AMBER40，用户可根据特定系统的计算性能自行选择。在模拟过程中以及对结果进行分析和解释时，对轨迹进行可视化至关重要。目前有多种可用工具；本文讨论的是可视化的分子动力学（VMD）软件，其提供广泛的功能，包括采用多种绘图和着色方法进行三维（3-D）可视化、体数据可视化、构建、准备和分析分子动力学模拟系统的轨迹，以及在内存允许的情况下不受系统大小限制地生成轨迹动画41,42,43。

系统组分间预测动力学的准确性直接受用于轨迹传播的力场（FF）选择的影响。目前仅有少数研究团队致力于经验力场的参数化工作。分子动力学（MD）中最成熟且常用的力场包括CHARMM39、AMBER40、Martini44、OPLS45和SIRAH46。全原子加和型CHARMM36（C36）力场47因其能准确再现实验结构数据，被广泛应用于膜系统的全原子（AA）分子动力学模拟。该力场最初由CHARMM研究社区开发，可兼容多种分子动力学引擎，如GROMACS和NAMD。尽管各类常用力场已不断改进，但研究者仍持续致力于优化参数集，以实现更接近实验可观测量的预测结果，这一努力主要由对特定研究系统的兴趣所推动48,49。

模拟脂质膜时面临的一个挑战是确定模拟轨迹的时长。这在很大程度上取决于待分析的指标以及希望表征的过程。通常，复杂的脂质混合物需要更长时间才能达到平衡，因为更多的组分必须有足够的时间在膜平面内扩散并形成稳定的侧向结构。当感兴趣的性质达到平台期并在恒定值附近波动时，可认为模拟已达到平衡状态。通常建议获得至少100–200 ns的平衡后轨迹，以便对感兴趣的性质和相互作用进行适当的统计分析。仅含膜的模拟通常运行200–500 ns，具体时长取决于脂质混合物的复杂程度和研究问题。而蛋白质-脂质相互作用通常需要更长的模拟时间，为500–2000 ns。一些用于加速膜体系采样和可观测动力学的方法包括：（i）高流动性膜模拟物（highly mobile membrane mimetic, HMMM）模型，该模型通过用有机溶剂替代膜中脂质的末端碳原子以加速采样50；（ii）氢原子质量重分配（hydrogen mass repartitioning, HMR），该方法将体系中重原子的部分质量与氢原子质量重新分配，从而允许使用更大的模拟时间步长51。

以下方案介绍了一种适合初学者的方法，用于使用AA MD构建、运行和分析真实的膜模型。鉴于分子动力学（MD）模拟的特性，必须运行多个轨迹，以确保结果的可重复性并进行适当的统计分析。目前通常的做法是对每个感兴趣体系至少运行三个重复。在为特定生物体和研究过程选定脂质种类后，构建、运行和分析纯膜体系模拟轨迹的基本步骤已在图2中概述并总结。

工作流程图：使用 PC、HPCC、Python、Bash 构建、模拟和分析系统轨迹。
图 2．运行分子动力学模拟的示意图。橙色方框对应本实验方案中描述的三个主要步骤。下方为模拟过程的工作流程。在系统构建阶段，使用如 CHARMM-GUI Membrane Builder 等系统输入生成器，构建包含溶剂化膜系统初始坐标的体系。将输入文件传输至高性能计算集群后，使用 GROMACS 等分子动力学引擎推进模拟轨迹。轨迹分析可在计算集群或本地工作站上进行，并结合可视化操作。分析可借助内置分析代码的软件包（如 GROMACS 和 VMD），也可通过 Bash 脚本或多种 Python 库实现。请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 构建系统坐标

  1. 使用网络浏览器访问 CHARMM-GUI.org (C-GUI)。在顶部菜单中，依次选择 输入发生器，然后选择 膜构建器 从屏幕左侧的垂直选项中。
  2. 构建双层膜时，选择 双层膜构建器.
    注意：首次使用的用户必须在创建第一组坐标之前激活其免费账户。
  3. 选择 膜限定系统保存生成的 JOB ID，以便在需要时检索系统并从中断处继续操作。
    1. 在构建过程的每一步中，通过点击来可视化系统 观察结构 在页面顶部的框内查看，或通过下载生成的 PDB 文件进行检查。注意是否存在缺失的组分、所选输入脂质种类或补丁尺寸的错误。
  4. 选择系统的组件。
    1. 选择 异质性脂质 选项，即使构建单组分双层膜；然后选择一个 矩形盒 类型。
    2. 每个脂质选择45个水分子进行水合；这足以确保双分子层完全水合。
    3. 根据脂质组分的数量设置 XY 的长度. 然后，选择预先确定的每种脂质在模型中包含的数量。在下一节讨论的案例研究中，构建了一个包含600个脂质并均匀分布在两个单层中的膜模型。为模拟真核细胞内质网，PI模型使用了由336个DOPC、132个DPPE、60个CHOL和72个POPI脂质组成的混合物；PI-PS模型则使用了由330个DOPC、126个DPPE、54个CHOL、66个POPI和24个DOPS脂质组成的混合物。
      注意：C-GUI 提供了可供选择的脂质结构库；点击物种名称旁边的图像可查看其化学结构。
    4. 在脂质名称旁边的两个框中分别输入上叶和下叶所需的分子数量。对于本案例研究，需要对称的膜组成——请确保上叶和下叶的脂质数量匹配，避免出现数量不匹配的错误。如果需要非对称结构，请确保每层叶中的脂质总数正确。有关构建非对称双分子层的详细信息，请参考 Park 等人的研究。52,53.
    5. 转到脂质物种列表顶部并点击 显示系统信息 按钮。组装组件并完成系统。
    6. 选择使用基于距离的算法添加中和离子，以实现更快的收敛54.
    7. 保持 KCl 的默认溶液浓度为 0.15 mM。这是 使膜双层模拟体系电中性所需的典型盐浓度。
      注意：如果要使用不同的浓度，请务必点击 计算溶剂组成 编辑后点击按钮。
  5. 选择模拟条件和设置。
    1. 选择 CHARMM36m 作为FF选项；它常用于脂质和蛋白质模拟，但用户也可选择引言中讨论的其他选项。
    2. 选择 GROMACS 作为分子动力学引擎，以获取相应格式的样本输入文件。
      注意：推荐新用户使用 GROMACS，因为它拥有丰富的在线资源、教程和论坛支持。用户可从多种分子动力学（MD）引擎中进行选择，以比较模拟性能和代码语法等方面的差异。
    3. 选择 恒定粒子数-压强-温度（NPT） 系综，迄今为止在脂质双分子层模拟中应用最广泛的动态系综。
    4. 将温度和压力分别设置为 303 K 和 1 bar。在研究生物过程时，通常将温度设定在 298 K 至 310 K 之间，以确保双分子层处于液态无序状态。
      注意：温度取决于所要模拟的过程条件，可根据需要进行调整。根据模型中脂质的种类，在运行模拟前，应将温度设定为高于纯脂质组分的相变温度。
  6. 下载生成的文件并传输至计算机集群。
    1. 使用 VMD 或 PyMol 等软件可视化最终体系，并检查设置是否正确。
      ​注意：建议检查例如膜周围是否有足够的水，以确保在模拟过程中脂质不会与像原子相互作用，同时确认叶层设置正确（即形成无间隙或夹层水的双层结构）。

2. 运行分子动力学模拟

  1. 将 C-GUI 中的文件上传并解压至您的计算集群。进入 Gromacs 目录，创建一个弛豫阶段提交脚本。
  2. 根据计算集群的要求编写提交脚本的格式。
    1. 将 README 文件中位于“# Production”注释上方的所有命令复制到提交脚本中。
      注意：C-GUI 提供的默认设置是一个对体系进行六步弛豫的循环。如果需要采用其他成熟可靠的协议，可对其进行修改，以读取刚由 C-GUI 构建并下载的坐标文件。
  3. 提交弛豫脚本，并在进入生产运行前确认所有步骤的输出文件均已成功下载。完成之后，检查 GROMACS 在六步运行过程中生成的以下输出文件：*.log、*.tpr、*.gro、*.edr、*.trr / *.xtc
  4. 创建生产运行脚本。
    1. 从任意一个弛豫步骤中选取一个 gmx grompp 和 gmx mdrun 命令示例作为模板。
    2. 在使用脚本之前，需创建一个 *.mdp 文件，其中包含与提供的 step7_production.mdp 文件类似的模拟参数。
      注意：所提供的默认参数适用于膜体系的标准模拟；距离单位为 nm，时间单位为皮秒或步数（皮秒 / 积分时间步长）。请将 nsteps 设置为所需模拟时长（等于 dt * nsteps），并将 nst[x,v,f]out 设置为所需的数据保存频率（以积分步数为单位）。在本案例研究中，将 nsteps 设为 250,000,000，以实现 500 ns 的模拟时长（模拟时间 / 积分步长 = 500,000 ps / 0.002 ps），并将 nst[x,v,f]out 设为 50,000，以每 100 ps 保存一次数据。
  5. 在正式运行模拟之前，先进行基准测试以确定资源的最佳配置。
    1. 使用不同数量的计算节点对体系运行 1–2 ns 的测试模拟。
      注意：本研究中的 ER 案例在纽约州立大学布法罗分校计算研究中心（UB Center for Computational Research, CCR）的高性能计算集群55上提交了 2 ns 的任务，并测试了 1 至 10 个节点的性能表现。
    2. 比较每种配置下的模拟速度（ns/天），以确定最优的资源分配。通常选择能达到最大性能 75%–80% 的节点数量。
  6. 执行生产运行。
    1. 每个体系应运行三个重复样本，以确保结果的可重复性，并对数据进行统计分析。
    2. 若计算集群的队列允许运行时间耗尽，可根据基准测试结果扩展轨迹。使用 gmx convert-tpr 和 gmx mdrun 命令继续收集轨迹数据。
      ​注意：相关选项说明详见 GROMACS 在线文档（https://manual.gromacs.org/）。
    3. 对于仅含膜的体系，可通过计算每个脂质所占面积随时间的变化来判断体系是否已达到平衡。若未达到平衡，则需延长模拟轨迹。

3. 分析轨迹

  1. 在运行分析之前，先对体系进行可视化，以确定感兴趣的分子以及用于表征的轨迹片段。
  2. 通过将原始轨迹文件（*.trr）转换为 *.xtc 格式和/或跳过部分帧来压缩文件，以减小文件大小，便于更高效地传输至本地工作站进行可视化和分析。
    注意：对于较大的膜体系，可选择从轨迹中去除水分子以进一步减小文件大小。此操作可通过 GROMACS 中的索引文件、VMD 中的 TCL 脚本，或使用 Python 库（如 MDAnalysis 和 MDTraj）实现。
  3. 根据单位脂质面积的时间序列确定体系达到平衡后的轨迹段，并在此区间内执行所选分析。
    注意：有关典型膜分析的更多细节及操作方法，请参见讨论部分。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了说明本方案的使用方法及可获得的结果，本文讨论了一项关于内质网（ER）膜模型的比较研究。该研究中包含两种模型：（i）PI 模型，含有内质网中含量最高的四种脂质组分；（ii）PI-PS 模型，在前者基础上添加了阴离子型磷脂酰丝氨酸（PS）组分。这些模型随后被用于研究一种病毒蛋白及其与膜的相互作用，其中PS被认为对病毒蛋白的膜通透化活性具有重要作用23。为了引入脂质尾部结构的多样性，膜的组成设定为 DOPC:DPPE:CHOL:POPI（56:22:10:12 mol%）和 DOPC:DPPE:CHOL:POPI:DOPS（55:21:11:9:4 mol%）。

膜结构使用 CHARMM-GUI 膜构建器生成。为了容纳4种不同的脂质种类以及后续的蛋白质，对称膜被设定为每层包含600个脂质分子。采用本方案推荐的参数设置，温度设定为303 K。为确保独立的重复实验，每种膜模型的构建过程重复三次，每次生成不同的脂质随机混合物。系统构建完成后，将输入文件转移至布法罗大学计算研究中心（CCR）的高性能计算集群5...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验技术可利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）58、荧光技术以及原子力显微镜（AFM）59在高分辨率下对生物大分子进行可视化。然而，在原子或氨基酸水平上捕捉分子相互作用之间的协同效应及其动态过程，以揭示生物通路、疾病发病机制以及治疗递送机制，仍具有挑战性。本文讨论了分子动力学（MD）模拟在研究脂质膜方面的功能，以及设计、构建、运行和分析这些系统的几个主要步骤。该计算方法的优势在于其原子级细节和用于模拟分子相互作用的基本方程，可用来提出并表征膜界面处的分子机制。

模拟细胞膜时的一个关键步骤是对所研究的生物系统有充分的理解。所包含的脂质种类取决于生物体、细胞区室，以及最重要的是所研究的过程。对于初学者而言，使用对称膜进行模拟是一个良好的起点。尽管不对称性是质膜等膜结构的已知特征，但它可能带来额外的困难，因为需要更长的模拟时间来充分采样脂质双层之间甾醇的侧向扩散和交换。这种不对称性还会导致两个单层的单位面积脂质数（APL）不匹配，在模拟中必须谨慎处理52

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢Jinhui Li和Ricardo X. Ramirez在撰写本文期间提供的模拟轨迹和讨论。O.C. 受到布法罗大学校长奖学金以及由Margarita L. Dubocovich（项目负责人）获得的美国国立卫生研究院学生发展最大化计划培训资助1T32GM144920-01的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Anaconda3Anaconda 公司（Python &以及相关文库N/A
CHARMM-GUI.org利哈伊大学实验室N/A
GROMACSGROMACS 开发团队N/A
Linux 高性能计算集群UB CCRN/A
MATLABMathWorksN/A
VMD理论与计算生物物理学研究组N/A

参考文献

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