方法文章

在单分子尺度上研究肌肉转录动态 黑腹果蝇

7.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65713

⸱

2023年9月8日

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR), UMR6290 CNRS - Université de Rennes, 2BIOSIT, UAR 3480 US 018, Université de Rennes

本文内容

摘要

Drosophila 是研究调控肌生成关键分子的成熟模型。然而，现有方法尚不足以确定合胞体内部 mRNA 的转录动态及其空间分布。为克服这一局限，我们优化了一种RNA荧光原位杂交方法，可在单分子水平上实现对mRNA的检测与定量。

摘要

骨骼肌是由大量成束的肌纤维组成的多核合胞体，可产生力量并实现身体运动。 果蝇 是研究肌肉生物学的经典模型。两者的结合 果蝇 遗传学与先进的组学方法推动了调控肌肉形态发生和再生的关键保守分子的发现。然而，这些分子的转录动态及其信使RNA在合胞体内的空间分布无法通过传统方法进行评估。本文中，我们优化了一种现有的单分子RNA荧光原位杂交技术 原位 采用单分子荧光原位杂交（smFISH）方法，以实现对成年飞行肌及其肌肉干细胞中单个mRNA分子的检测与定量。作为概念验证，我们分析了两种进化上保守的转录因子Mef2和Zfh1/Zeb的mRNA表达与分布情况。结果表明，该方法能够有效检测并定量肌肉前体细胞、成年肌肉及肌肉干细胞中这两种转录本的单个mRNA分子。

引言

成年骨骼肌由分化的多核肌纤维构成，其收缩特性可产生运动。肌肉的生长、维持和再生依赖于在胚胎发育过程中被确定的肌源性前体细胞和肌肉干细胞（MuSCs）1。肌源性程序受到一组核心肌源性转录因子（TFs）（如 Pax3/7、MYOD、Mef2 和 ZEB）的精细调控2,3,4。解析调控肌肉生物学的分子机制，对于阐明与肌生物学相关的基本科学问题以及治疗肌肉退行性疾病可能的治疗应用均具有重要意义。

Drosophila 作为研究肌发生遗传学的模式生物有着悠久的历史5。 近年来，它也逐渐成为研究肌肉再生的新模型6,7,8。果蝇与哺乳动物之间的肌肉结构和核心肌生成程序高度保守。例如，转录因子 Mef2 和 Zfh1/ZEB 在调控肌肉发育和再生方面具有保守的功能3,9,10,11。成年 Drosophila 肌肉（如间接飞行肌，IFMs）由一类特定的肌肉干细胞（MuSCs）——即成肌前体细胞（AMPs）——发育而来12。这些 AMPs 在胚胎发育期间被确定，并与翅盘和腿盘等上皮结构相关联。在整个胚胎期和幼虫期，AMPs 保持未分化状态，直到变态期才启动分化并融合形成 IFMs13,14。转录因子 Spalt major（spalt, salm）在飞行肌发育过程中表达，对于决定其结构特性至关重要15。Mef2 是另一个重要的肌源性转录因子，对成年肌肉的形成必不可少16,17。它在 AMPs 中表达，并在成年 IFMs 中持续存在10,18。尽管大多数 AMPs 会分化为功能性肌肉，但有一部分逃避了分化，形成了成年 MuSCs11。与脊椎动物类似，转录因子 Zfh1/ZEB 对于防止成年 MuSCs 过早分化以及维持其干性至关重要9,10。

基因表达动态已被证实可调控多种肌肉生物学过程19,20高通量单细胞和单细胞核RNA测序技术的出现，使得对这些转录动态的全面探索成为可能21,22一个显著的局限性在于这些方法无法提供多核肌纤维中 mRNA 分子的空间分布信息。这些特征可通过单分子荧光技术进行研究 原位 杂交（smFISH）可显示两种类型的mRNA信号：1. 分散在细胞质中的单个mRNA分子，代表成熟RNA；2. 最多两个明亮的核内焦点，对应新生转录本，指示转录活跃的等位基因23因此，smFISH 是单个 mRNA 分子定量、研究其空间分布以及获取基因转录动态快照的首选方法。

单分子荧光原位杂交（smFISH）方法依赖于一组特异性设计为与目标转录本互补的短荧光寡核苷酸探针。在退火后，可产生高强度的点状信号源，从而利用共聚焦显微镜在单分子水平上检测mRNA。24该方法正被 increasingly 应用于多种细胞类型，包括哺乳动物肌肉组织19,20。然而，在 果蝇 与其他动物模型类似，关于成体肌肉基因表达的大部分知识均来源于整体分子检测，这类方法缺乏mRNA分子空间定位的定量信息。本文中，我们优化了一种在肌肉前体细胞和成体组织中进行单分子荧光原位杂交（smFISH）的方法 果蝇 肌肉23,25本方案包含一个完全自动化的分析流程，用于细胞核分割以及mRNA计数与定位。

方案

1. 翅盘和成体肌肉的解剖与制备

注意：使用RNase抑制剂溶液清洁解剖台和所有解剖器械（材料表）。整个实验过程中应佩戴实验室手套。

  1. 翅盘
    1. 将L3期幼虫置于冰冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中（图1A）。
    2. 用1× PBS清洗幼虫3次，每次5分钟，并将其保留在该溶液中5分钟。
    3. 使用两对尖头镊子，用一对夹住幼虫前端，另一对拉住并弃去其余身体组织（约2/3）。
    4. 用一对镊子夹住幼虫前1/3部分，另一对夹住口钩，将口钩向内拉，使幼虫完全内翻。
      注：每个实验建议解剖约30只幼虫，以确保分析所需的足够样本量。
    5. 观察到翅盘与沿幼虫体侧分布的两条主要气管分支紧密相连。
    6. 去除所有其他幼虫组织（腿盘和脑），获得一个干净的内翻幼虫残体，其气管上附有一对翅盘（图1B）。
    7. 将样品放入1 mL离心管中，加入用1× PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA）在室温下振荡固定45分钟。
      注：样品振荡可通过振荡搅拌器实现（材料表）。
    8. 用70%乙醇（EtOH，用无RNA酶水配制）洗涤样品3次，每次5分钟，然后将样品保存在相同洗涤液中，于4 °C下保存至少2天，最多1周。
  2. 间接飞行肌
    1. 将成年果蝇置于CO2麻醉垫上进行麻醉，去除头部、腹部、腿部和翅膀。
    2. 将解剖后的胸部组织置于冰冷的1× PBS中，并继续操作直至所有样品均完成解剖（图1D）。
    3. 在室温下振荡条件下，用含1% Triton的4% PFA对胸部组织进行预固定20分钟。
    4. 用1× PBT洗涤液（含1% Triton的1× PBS）洗涤样品3次，每次5分钟。
    5. 将胸部组织置于载玻片上的双面胶带上（材料表），使用锋利的切片刀将其纵向切开，得到两个半胸体（图1E、F）。
    6. 在室温下振荡条件下，用含1% Triton的4% PFA固定样品45分钟。
    7. 在室温下振荡条件下，用1× PBT洗涤液（含1% Triton的1× PBS）洗涤2次，每次20分钟。
    8. 将半胸体置于冰冷的1× PBS中，用镊子轻轻将间接飞行肌（IFMs）从半胸体中分离出来（图1G）。
      ​注：为实现此操作，需尽可能彻底地去除表皮。
    9. 为使样品通透，将分离的IFMs置于70% EtOH溶液中，在4 °C下保存至少2天，最多1周。
      ​注：每个实验建议从约10个胸部组织中分离IFMs，以确保分析所需的足够样本量。

2. 杂交、免疫染色和封片

注意：翅盘和间接飞行肌样本均采用相同的杂交程序。在开始杂交前，必须将翅盘从幼虫体壳中分离，并置于200 µL缓冲液A中。

  1. 用 400 µL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）重悬探针，配制成终浓度为 12.5 µM 的储备溶液。
  2. 将样品转移至含有缓冲液 A（材料表）的 0.5 mL 离心管中。
    注意：通过减小容器体积，可更易于观察样品，并在洗涤过程中避免样品丢失。
  3. 用缓冲液 A 洗涤样品，每次 20 分钟，共洗涤 2 次。
  4. 吸除缓冲液 A，加入 400 µL 杂交缓冲液（材料表），在 37 °C 的恒温混匀仪（材料表）中预杂交 30 分钟。
  5. 在杂交缓冲液中将探针稀释至终浓度：翅盘样品为 125 nM，成体肌肉样品为 200 nM，并加入一抗。
    注意：一抗的稀释比例取决于所使用的一抗种类（材料表）。添加抗体为可选步骤。用户可选择不进行蛋白染色，而采用类似的单分子荧光原位杂交（smFISH）方案，该方案不包含抗体添加步骤。
  6. 吸除杂交缓冲液，替换为 100 µL 含有探针和一抗的杂交缓冲液。
  7. 将样品置于恒温混匀仪中，在 37 °C、300 rpm 振荡条件下避光孵育至少 16 小时。
  8. 将一份缓冲液 A 预热至 37 °C。
  9. 在恒温混匀仪中，以 37 °C、300 rpm 振荡条件洗涤样品，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。
  10. 在最后一次洗涤时，将二抗（1/200 稀释）和 DAPI（1/10,000 稀释）加入缓冲液 A 中，将样品在此溶液中于 37 °C 孵育至少 1 小时。
  11. 用缓冲液 B（材料表）洗涤样品，每次 20 分钟，共洗涤 3 次。
  12. 小心将样品转移至显微镜载玻片上，擦去残留的缓冲液 B，加入 30 µL 封片介质，盖上 18 × 18 mm 盖玻片，并用指甲油密封样本。
  13. 样品可在 4 °C 保存最多 1 周。
    ​注意：但建议尽快进行成像，以避免探针信号降解。

3. 成像

  1. 使用配备40倍和63倍油镜物镜的共聚焦显微镜，以xyz采集模式获取图像（材料表）。通过HyD探测器的光子计数模式检测smFISH信号。
  2. 利用DAPI信号和紫外灯定位样品。
  3. 为成像翅盘相关肌前体细胞和间接飞行肌（图2 和 图3），设置以下激光线和发射滤光片参数：选择DAPI （激发（ex.）405 nm，发射（em.）450 nm）、Alexa Fluor 488（ex. 496 nm，em. 519 nm）以及用于smFISH探针的Quasar 670 （ex. 647 nm，em. 670 nm）。
  4. 为成像成年肌肉干细胞（MuSCs）（图2D），设置以下激光线和发射滤光片参数：选择DAPI （ex. 405 nm，em. 450 nm）、Alexa Fluor 488 （ex. 496 nm，em. 519 nm）、Alexa Fluor 555（ex. 555 nm，em. 565 nm）以及用于smFISH探针的Quasar 670（ex. 647 nm，em. 670 nm）。
    注意：成像时可根据与二抗和探针偶联的染料调整波长。
  5. 将共聚焦图像保存为.TIFF文件。

4. 成像后分析

  1. 启动 ImageJ，然后导航至 Plugins 菜单。从中选择 Macros | Edit 以打开宏的源代码。
    注意：这将允许根据需要调整参数，如有必要，还可修改宏源代码中每个通道的文件夹目录。
  2. 按照本方案对幼虫中的 Mef2 smFISH 斑点进行定量时，请使用以下设置：Log_radius = 3.0 和 Log_quality = 20.0。使用 blur = 2；nucleus_scale_parameter = 30；nucleus_threshold = -8.0；nucleus_size = 300 对 Mef2 阳性细胞核进行分割。
  3. 在肌纤维中，请使用以下参数：Log_radius = 2.5；Log_quality = 60.0；blur = 2；nucleus_scale_parameter = 100；nucleus_threshold = 0.0；nucleus_size = 300。
  4. 要启动宏，只需执行运行命令，然后等待宏自动从指定文件夹加载所有图像，并按顺序进行定量。
    注意：此过程所需时间可能从几秒到数小时不等，具体取决于待分析数据的规模。
  5. 查看生成的两个新 .csv 文件中的结果：file_FISH_results 和 file_nuclei_results。第一个文件显示转录斑点的数量及其平均强度和最大强度。 第二个文件提供细胞核总数以及每个细胞核内斑点的数量。

结果

在本实验方案中，我们使用了商业化的探针，靶向 Mef2 和 zfh1 mRNA。探针设计借助生产商提供的FISH探针设计工具完成（材料表）。Mef2 探针组靶向所有 Mef2 RNA 亚型共有的外显子区域（从第3至第10外显子）。zfh1 探针组靶向 zfh1-RB 和 zfh1-RE 两种亚型共有的第三外显子10。两种探针均偶联了Quasar 670荧光染料。

我们自行开发了一个与ImageJ软件兼容的宏，用于自动分析原始的.tif数据。该宏通过Cellpose26结合Fiji插件BIOP实现细胞核的三维分割，并利用Trackmate插件中实现的高斯拉普拉斯算法对转录位点进行定量分析27。MorpholibJ插件28用于后续处理（补充文件1）。

作为第一步，我们在翅成虫盘上进行了单分子荧光原位杂交（smFISH）， Mef2 和 zfh1 已知在AMPs中表达。这些数据表明，使用Mef2或Zfh1抗体共染色的AMPs群体中均可均匀检测到这两种转录本。图 2A，B活跃的转录位点（TS）可通过单分子FISH（smFISH）进行显示并区别于成熟mRNA，因为这些位点通常比单个细胞质转录本或成熟的核内转录本更大且信号更强. 一致地，AMPs 的高倍镜观察可区分 TS 焦点与散布在细胞质中的成熟 mRNA图2A，B)，验证了该smFISH实验方案的灵敏度。然而需要指出的是，我们观察到两种情况下每个细胞核中均只有一个活跃的TS zfh1 和 Mef2 (图2A，B). 这些数据进一步验证了探针设计的准确性，因为 Mef2 和 zfh1 抗菌肽（AMPs）的转录模式与其相应蛋白质的检测共定位图2).

在第二步中，我们检测了分化后的成年间接飞行肌（IFMs）及其相关干细胞中Mef2和zfh1 mRNA 的转录位点及分布情况（图 2C，D）。这些数据清晰地显示了Mef2的转录位点位于合胞体肌细胞核内，且Mef2 mRNA 在细胞质中广泛分布（图 2C，C'）。Zfh1 特异性地标记了肌肉干细胞（MuSCs）群体10,11。利用本 smFISH 实验方案，我们成功检测到由 Zfh1-Gal4 > GFP 表达标记的 MuSCs 中的zfh1转录信号。高倍放大图像进一步展示了zfh1的转录位点以及细胞质中单个 mRNA 分子的检测结果（图 2D'）。

最后，我们使用自主开发的 ImageJ 宏程序对Mef2的转录动态和空间分布进行定量分析。该计算流程能够高效地识别并分割Mef2信号点和肌细胞核（图 3A-C）。然而，由于信噪比问题，在某些情况下部分信号点可能未被检测到（图 3A',B'）。我们利用这一自动化方法探究Mef2 mRNA 的丰度在肌肉前体细胞（AMPs）与分化后的成体间接飞行肌（IFMs）之间是否存在差异。分析结果表明，成体 IFMs 与 AMPs 中每个细胞核内的Mef2 mRNA 数量无显著差异（图 3D）。

为了深入了解成年个体飞行肌（IFM）肌肉中Mef2转录本的空间分布，我们量化了细胞质与细胞核内Mef2 mRNA信号点所占的比例（图3E、F）。利用我们的程序，我们统计了Mef2 mRNA信号点的总数以及与细胞核染色区域重叠的Mef2 mRNA信号点数量（Mef2）。从总的mRNA信号点数中减去与细胞核相关的mRNA信号点数，即可得到细胞质中mRNA信号点的数量。研究结果表明，约92%的Mef2 mRNA存在于细胞质中，其余8%则与肌肉细胞核相关联，如图3E、F所示。

Drosophila dissection process; stages: larvae, thorax isolation, hemithorax, flight muscles; timeline chart.
图1解剖及制备翅盘和间接飞行肌样本用于单分子荧光原位杂交的实验步骤 (AL3期幼虫。B幼虫前端解剖并翻转。箭头指示翅盘。C) 分离的翅盘。D解剖的成年胸部。E成年果蝇胸部固定于双面胶带上，准备沿虚线切开。F成年个体的半侧胸腔。G分离的间接飞行肌。H) 单分子荧光原位杂交（smFISH）实验流程. 缩写：IFMs = 间接飞行肌；smFISH = 单分子RNA荧光原位杂交 原位 杂交；EtOH = 乙醇。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Drosophila muscle development, immunofluorescence imaging, Mef2 and Zfh1 protein expression in larva.
图2代表性图像 Mef2 和 zfh1 翅盘和成体间接飞行肌中的单分子荧光原位杂交 (A，B) Mef2 和 zfh1 mRNAs（紫色）在AMPs中均匀分布，并与（A，A') Mef2 和 (B，B') Zfh1 蛋白（绿色），分别。A'',B''AMPs 的高倍放大图像。C) Mef2 在成年个体的间接飞行肌（IFMs）中可检测到mRNAs和Mef2蛋白。C'方框区域的高倍放大图 C. (D) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP 表达（绿色）标记成年 MuSCs。 zfh1 在成年 MuSCs 中检测到 RNA。D'方框区域的高倍放大图 D. Zfh1 转录起始位点和单个mRNA分别用箭头和箭头头表示。DAPI染色（蓝色）。比例尺＝50 µm（A、B、A'、B'），10 µm（A",B",C,D），5 µm（C',D'缩写：IFMs = 间接飞行肌；smFISH = 单分子RNA荧光原位杂交 原位 杂交；AMPs = 成年肌肉前体细胞；MuSCs = 肌肉干细胞；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GFP = 绿色荧光蛋白 请点击此处查看此图的放大版本。

Mef2 transcriptional spots detection, microscopy images, nuclei segmentation, data analysis graphs.
图3：定量分析 Mef2 通过单分子荧光原位杂交检测转录及细胞质mRNA累积。 (A分布 Mef2 转录本（紫色）和野生型成年间接飞行肌中的Mef2蛋白（绿色）。(A'方框区域的高倍放大图 A转录起始位点和单个mRNA分别用箭头和实心箭头表示。B，C自动 Mef2 斑点检测与核分割。胞质与细胞核 Mef2 mRNA 分别用绿色和品红色表示。B', C'方框区域的更高倍数放大图 B 和 C星号表示宏程序未计数的斑点。D示例 Mef2 相对于细胞核总数，AMPs 和成年 IFMs 中的斑点定量。（p = 0.0785，Student's t-检验，翅盘（n = 4），IFMs（n = 11））。E定量分析示例 Mef2 成虫间接飞行肌中的斑点分布。（*** p< 0.0007，学生氏 t-检验，n = 5)。F百分比 Mef2 细胞核内外检测到的mRNA点状信号（n = 5）。比例尺 = 10 µmA，A'缩写：IFMs = 间接飞行肌；smFISH = 单分子RNA荧光原位杂交 原位 杂交；AMPs = 成体肌肉前体细胞 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充文件1：用于后处理的宏。 请点击此处下载该文件。

讨论

近年来，smFISH技术的应用日益广泛，已扩展至多种细胞类型和模式生物。然而，在Drosophila中，关于成体肌肉基因表达的大部分知识仍来源于整体分子检测方法，这些方法无法提供mRNA分子精确定位的空间定量信息。为弥补这一空白，我们优化了一种在肌肉前体细胞及成体Drosophila肌肉中进行smFISH的方法。该方法改编自先前发表的实验方案23，并针对Drosophila肌肉组织进行了优化。

获得高质量的smFISH图像的主要障碍是成年肌肉的厚度，这会阻碍探针的充分渗透。因此，必须将成年肌肉从动物的其他组织中分离出来，并在轻微振荡条件下进行杂交过程。这一特定步骤可有效确保组织的通透性。

另一个关键因素是，信噪比可能导致计算流程无法检测到某些mRNA位点。我们发现，通过寻找探针的最佳浓度可以提高信噪比。最佳稀释度可能因每组探针的组成而异，包括偶联染料和寡核苷酸的组成。我们建议尝试不同的稀释度；在本实验中，对于成年组织，200 nM的终浓度获得了最佳的信噪比。

利用smFISH方法，可以对转录位点（TS）焦点处新合成的RNA分子数量进行定量。当一个基因处于活跃转录状态时，多个新生RNA会同时在转录位点（TS）上生成。因此，TS的荧光强度将超过成熟的细胞质RNA，结合其位于细胞核内的特征，这一性质可用于区分TS与单个细胞质RNA信号。在肌肉生物学研究中，检测和定量转录位点对于确定同一合胞体中各个肌核内特定基因转录的同步性尤为重要。然而，本计算流程并未设计用于区分细胞质mRNA与TS信号。作为替代方案，我们建议将该smFISH方法与其他已建立的smFISH分析工具（如BayFISH或FISH-quant29,30）相结合。这些工具已被证实能够以极高的精度实现RNA聚集体的自动分割及荧光强度计算。

最后，尽管smFISH能够以高空间分辨率检测mRNA分子，但它仅限于同时分析少量mRNA。而merFISH（多重误差稳健荧光原位杂交）等多尺度方法则可实现对大量不同mRNA的同时分析31。该方法通过结合寡核苷酸探针与纠错编码技术，能够在单细胞中检测数百种RNA分子。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Alain Vincent 对本文稿的审阅。感谢 Ruth Lehmann 提供 Zfh1 抗体。感谢 Stephanie Dutertre 和 Xavier Pinson 在 MRic 成像平台提供的共聚焦显微镜技术支持。EL 获得法国高等教育与科研部博士奖学金资助。NA 获得 AFM-Telethon 博士奖学金（23846）资助。TP 获得陈-扎克伯格倡议 DAF 基金会资助（项目编号：2019-198009）。HB 获得法国国家科学研究中心（CNRS）、Atip Avenir 项目以及 AFM-Telethon 弹跳资助（23108）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
共聚焦显微镜 SP8LeicaSP8 DMI 6000
DAPIThermoFisher62248
双面胶带 Tesa 57910-00000
Dumont #55 镊子Fine Science Tools11255-20
甲醛 16%EuromedexEM-15710
Mef2 抗体DHSBNA
PBS 10xEuromedexET330
RNaseZAPSigma-AldrichR2020
Stellaris 探针LGCNA
Stellaris RNA FISH 杂交缓冲液LGCSMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH 洗涤缓冲液 ALGCSMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH 洗涤缓冲液 BLGCSMF-WB1-20
Swann-Morton 刀片Fisher scientific0210
ThermoMixerEppendorf5382000015
Triton X-100Euromedex2000
UAS-mCD8::GFP 品系BloomingtonRRID:BDSC_5137
超纯水Sigma-Aldrich95284
方形表面皿，1 5/8 英寸 Carolina742300
Zfh1 抗体由 Ruth Leahman 惠赠
Zfh1-Gal4BloomingtonBDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625

参考文献

  1. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
  2. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  3. Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
  4. Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
  5. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  6. Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112(2021).
  7. Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
  8. Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459(2022).
  9. Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364(2019).
  10. Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954(2018).
  11. Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107(2017).
  12. Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126(2014).
  13. Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
  14. Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497(2015).
  15. Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  16. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
  17. Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
  18. Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
  19. Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388(2021).
  20. Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079(2021).
  21. Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432(2022).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).
  23. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  24. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  25. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
  26. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  27. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  28. Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
  29. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  30. Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164(2017).
  31. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

smFISH mRNA ImageJ Mef2 Zfh1

相关文章