方法文章

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

DOI：

10.3791/65715

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2023年12月22日

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1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

本文内容

摘要

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单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞分析已成为解析生物过程复杂性的首选方法，这类生物过程需要以单细胞分辨率评估个体细胞对处理或感染的反应变异性。

在过去10年中，已开发出多种单细胞分子谱分析技术，其中一些专门的技术已实现商业化。10X Genomics基于微滴的单细胞分析技术是一种广泛应用的技术，可提供即用型试剂，用于转录组及多组学单细胞谱分析。该技术包含单细胞和单细胞核RNA测序（分别简称scRNA-Seq和snRNA-Seq）、scATAC-Seq、单细胞免疫谱分析（BCR/TCR测序）以及多组学（multiome）的工作流程。其中，多组学技术可整合来自同一个细胞的转录组（scRNA-Seq）和表观遗传信息（scATAC-Seq）。

通过上述任一方法从组织中分离并分析的单细胞或单细胞核悬液的质量（活性、完整性、纯度）对于获得高质量数据至关重要。因此，样品制备方案应根据每种生物组织的特性进行优化，以确保获得高质量的细胞和细胞核悬液。

本文介绍了两种用于制备脑组织和骨髓样本以进行下游10X Genomics多组学（multiome）分析流程的实验方案。这些方案按步骤逐步进行，涵盖了组织解离、细胞分选、细胞核分离以及所制备的细胞核悬液的质量控制，后者将作为细胞分选与条形码标记、文库构建和测序的起始材料。这些标准化的实验方案可生成高质量的细胞核文库，并获得稳定且可靠的数据。

引言

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多年来，单细胞技术一直是分析生物过程的金标准。最初，这些技术仅限于通过显微镜、流式细胞术及类似检测手段进行单细胞表型分析。单细胞分析领域的一项重大突破来自于单细胞分子谱型技术的发展，特别是单细胞RNA测序（scRNA-Seq），该技术使得研究人员能够表征单个细胞的整个转录组。scRNA-Seq功能强大，可提供特定条件和时间点下单个细胞转录状态的信息。然而，它无法揭示驱动转录的基因调控机制，也无法反映随时间发生的分子修饰变化。为了克服这一局限，研究人员已投入大量努力，致力于开发单细胞多组学检测技术，以实现对同一细胞中多种因素和过程的联合分析1,2,3,4。首次在单细胞内成功实现两种模态联合检测，是通过CITE-Seq方法将多重表面蛋白表达模式与单个细胞的全转录组信息关联起来实现的5。更近期的发展则将基因表达与染色质可及性（利用测序技术检测转座酶可及染色质，ATAC-Seq）相结合，从而在同一细胞中同时捕获转录组和表观基因组信息（例如sci-CAR）6。首个实现将转录组学与同一细胞的表型或表观遗传变化相关联的商业化解决方案来自10X Genomics。

单细胞分子谱型分析实验包含以下步骤：（1）组织解离或制备单细胞悬液；（2）细胞纯化和/或细胞核分离；（3）分区与条形码标记；（4）文库构建与质量控制；（5）高通量测序；（6）数据分析。尽管步骤（3）至（6）会因所采用的技术不同而有显著差异，但初始步骤在各类方法中通常具有共性。所制备的细胞/细胞核悬液的质量将决定实验的整体结果。根据组织类型的不同，获得高质量的单细胞/细胞核悬液可能具有挑战性。某些组织（如心脏、肌肉、脑、肺、肠道等）具有特殊性，需要针对每种样本类型优化组织破碎和细胞核分离方法，以确保为分子分析提供高质量的细胞核7,8,9,10。组织破碎和解离的方法可以是机械法、酶解法（例如胶原酶和DNase的混合物），或两者结合，可手动操作，也可借助仪器完成（例如Qiagen DSC-400、gentleMACS）。

单细胞技术已成为生物医学研究的首选工具。在神经生物学领域，脑内细胞类型的多样性及其功能的复杂性需要高分辨率和高通量的分析方法，以实现对稀有细胞群体的可视化并评估其异质性11,12,13,14。将单个细胞的身份与其基因调控机制相联系，有助于深入理解脑的发育过程和生理功能。另一个典型例子是针对感染性疾病、自身免疫病或癌症背景下免疫应答的研究，这些研究高度依赖于单细胞分析。免疫细胞亚群具有高度异质性，其活性及与其他细胞类型的相互作用也极为复杂，因此必须在单细胞分辨率下解析免疫应答背后的机制。免疫细胞起源于骨髓，其中造血前体细胞由逐步分化的细胞组成，这些细胞在分步发育过程中不断获得或丢失细胞表面标志物，最终离开骨髓迁移至外周组织。单细胞分析能够对细胞发育阶段进行精细表征，传统上可通过多参数流式细胞术实现单细胞表型分析。然而，单细胞转录组特征已被证明能更精确地鉴定前体细胞亚型，因为这些细胞在空间上呈簇状分布且存在重叠，若采用粗略的细胞表面标志物策略则容易导致误判15。越来越多的研究揭示了造血干细胞和前体细胞（HSPCs）在接触各种外界因子后可能获得的表观遗传修饰，这些修饰对免疫系统的长期应答能力产生显著影响16,17,18,19。新兴的多组学技术使得以单细胞分辨率研究这些过程成为可能。

已有多种针对脑组织11,20,21,22和骨髓样本23,24的细胞及细胞核分离方案被报道。为最大限度减少因实验变异带来的偏差，有必要对单细胞核制备方案进行优化和验证，以适用于联合单细胞转录组和表观基因组测序，从而确保单细胞多组学检测的可重复性。

本文介绍了两种用于制备细胞核的可靠方案，分别适用于（1）新鲜冷冻的脑组织和（2）新鲜骨髓造血干细胞与祖细胞（HSPC），以用于后续的单细胞多组学（Multiome）分析（图1）。

小鼠脑组织和骨髓细胞核分离流程图；展示实验方案的示意图。
图1：从新鲜冷冻的脑组织和骨髓组织中分离细胞核的实验方案示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

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实验操作均在动物实验伦理委员会（CETEA）批准的方案所规定的严格监管合规条件下进行。用于脑核团分离实验时，选用3月龄的C57BL/6小鼠；用于骨髓分离实验时，选用体重为18 g的8周龄雌性C57BL/6J小鼠。

1. 小鼠脑组织细胞核的纯化

注意：操作过程中必须始终佩戴乳胶或丁腈手套。建议由两人共同完成实验，其中一人负责执行步骤1至步骤3（即单细胞核悬液的制备），另一人同时平行执行步骤4（即分选仪的准备）。由于该实验方案对时间高度敏感，因此在单细胞核悬液制备完成的同时即准备好分选仪，以最大限度缩短样品处理时间，这是实验成功的关键。

  1. 试剂和材料的准备
    1. 使用高压灭菌器（121 °C，20 分钟）对解剖工具进行严格灭菌，并在使用前用 70% 乙醇清洗。每个样本准备一个培养皿，加入 2–3 mL 冰冷的 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）。
    2. 将微量离心机预冷至 4 °C，准备一桶冰，并将玻璃Dounce匀浆器置于冰上。
    3. 通过加入皂苷（digitonin）配制细胞核裂解缓冲液，终浓度为 0.01%，每样本 10 mL。
    4. 通过向细胞染色缓冲液中加入RNase抑制剂配制染色缓冲液，终浓度为 0.2 U/µL，每样本 20 mL。
    5. 通过向 DPBS 0.04% BSA 中加入RNase抑制剂配制缓冲液，终浓度为 0.2 U/µL，每样本 2 mL。
    6. 根据Multiome方案25配制 1 mL 稀释的细胞核缓冲液。
    7. 将所有试剂和样本保持在冰上。
  2. 组织解剖
    1. 按照机构批准的方案处死小鼠。在本方案中，小鼠在过量使用氯胺酮/赛拉嗪后被断头处死。
    2. 用剪刀剪开小鼠头部，并按照Meyerhoff等26所述方法从颅骨中取出脑组织。立即将脑组织转移至预先盛有冰冻 1× DPBS 的培养皿中，并在发光二极管（LED）照明的体视显微镜下操作。
    3. 使用手术刀切割脑组织，分离感兴趣的脑区（例如内嗅皮层、海马、前额叶皮层），并将每个区域分别转移至含有冰冻 1× DPBS 的独立培养皿中。保持在冰上。
    4. 使用手术刀将组织切成 <0.5 cm 的小块，以利于下一步的匀浆处理。
    5. 使用 P1000 移液器将切碎的组织和 1× DPBS 从培养皿转移至 1.5 mL 离心管中。确保使用低蛋白吸附塑料制成的离心管。让组织碎片依靠重力自然沉降。使用 P1000 移液器小心吸除多余的 1× DPBS。
      注意：此步骤后，可通过将低蛋白吸附管转移至干冰上进行速冻，随后在 -80 °C 保存，直至进行细胞核分离。
  3. 细胞核分离
    1. 向玻璃Dounce匀浆器中加入 2 mL 冰冷的含 0.01% 皂苷的细胞核裂解缓冲液。将组织碎片加入Dounce匀浆器中。
      注意：若使用新鲜冷冻组织，直接将切碎的冷冻组织加入含 0.01% 皂苷的细胞核裂解缓冲液中；切勿在之前让组织解冻。
    2. 使用玻璃Dounce组织匀浆器，先用A型杵头匀浆 25 次，再用B型杵头匀浆 25 次。将匀浆液转移至 15 mL 离心管中。
    3. 额外加入 2 mL 冰冷的含 0.01% 皂苷的细胞核裂解缓冲液，在冰上孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。
    4. 使用移液器吸除上清液，加入 4 mL 冰冷的含 0.01% 皂苷的细胞核裂解缓冲液。在冰上孵育 5 分钟，然后通过 40 µm 细胞滤网过滤。
    5. 在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，使用移液器吸除上清液。
    6. 加入 4 mL 染色缓冲液洗涤细胞核，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。使用移液器吸除上清液，并将沉淀重悬于 4 mL 染色缓冲液中。
    7. 通过 40 µm 细胞滤网过滤，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 1 mL 含 0.04% BSA 的 PBS 中。
    8. 计数细胞核，以确保不同样本间组织/细胞核制备的一致性。预期从相同脑区获得相近的细胞核数量：
      1. 向一个空的 0.5 mL 管中加入 10 µL 0.4% 台盼蓝。加入 10 µL 细胞核悬液，通过移液混合 5 次。
      2. 按照供应商推荐的方法使用自动细胞计数仪计数细胞核。将细胞核保持在冰上。
    9. 准备细胞核用于分选。
      注意：提取的细胞核会掺入 7-AAD，该染色用于通过荧光激活细胞分选仪（FACS）进行纯化。
      1. 将 100 µL 细胞核转移至 FACS 管中作为未染色对照。向剩余细胞核中加入 10 µL 7-AAD，在 4 °C 孵育 5 分钟。
      2. 通过 FACS 分选至少 0.5 × 106 个细胞核，以去除双联体和碎片。
  4. 使用 FACS 进行细胞核分选
    注意：虽然细胞核分选可在多种细胞分选仪上进行，但此处描述的是使用 BD FACSAria Fusion 或 BD FACSAria III 仪器的操作流程。强烈建议在有经验的操作人员监督下或由其完成细胞分选仪的校准和设置。为减少样本处理时间，必须在单细胞核悬液制备完成后立即准备好分选仪。
    1. FACS 仪器的校准
      1. 打开细胞分选仪和计算机。待软件与仪器连接后，启动流体启动程序。在主菜单中选择 Cytometer > Fluidic start-up 并完成四个步骤。每完成一步后点击 Done 。
      2. 插入 70 µm 喷嘴，开启液流，并让液流稳定 15 分钟。调节振幅以获得液滴形成，并点击 Sweet Spot。
      3. 安装中性密度（N.D）滤光片 1.0，并打开细胞仪设置与追踪（CST）界面。
      4. 每日质量控制：将 CST 微球稀释于 FACS 培养基中（参见供应商推荐），并执行 CST 控制。完成后，将 N.D 1.0 更换为 N.D 2.0。
      5. 将 Accudrops 稀释于 FACS 培养基中（参见供应商推荐），并按照第 6 至 10 步所述进行液滴延迟校准。
      6. 在实验模板中选择 Accudrop Drop Delay 实验，并打开试管的 Sorting Layout 。
      7. 在下方摄像窗口中，点击 Voltage，然后点击 Optical Filter，以启用偏转板上的电荷并使用摄像机前的特定光学滤光片。确保右侧象限显示为 100。如有必要，调节红色激光螺丝以优化激光冲击。
      8. 调节流速，使事件速率达到每秒 1,000 至 3,000 个。
      9. 点击 Sort 和 Cancel。确保左侧象限等于 100，右侧象限为 0。若左侧象限低于 95，执行 Auto Delay。
      10. 点击 Voltage，然后点击 Test Sort。检查侧流在收集管中的沉积质量。如有需要，通过移动滑块调节侧流位置。
    2. 为细胞核分选设置 FACS 仪器。
      1. 开始采集未染色细胞核。这些用于定义前向散射和侧向散射，以及 7-AAD 参数的检测器电压。设置参数，使未染色样本的 7-AAD 信号落在点图对数刻度的第一十进区间内。
      2. 开始采集 7-AAD 染色细胞核管，并基于以下门控策略定义细胞核群体：（1）FSC-A/SSC-A 和 FSC-H/SSC-H 用于大小和颗粒度，（2）FSC-H/FSC-A 用于双联体区分，（3）SSC-A/7-AAD 用于 7-AAD 阳性细胞核（见 图 2A）。
      3. 确保液流和偏转稳定。
      4. 在侧流摄像界面中，开启测试分选，电压设为 ON，并确认在左侧安装的 1.5 mL 管中准确进行液滴分选。
      5. 在 Sorting Layout 窗口中，选择如上第 2 步所定义的目标细胞群。在 Target Events 中，选择 Continuous 模式下的阈值，以每样本获得至少 0.5 × 106 个细胞核。在 Precision 下选择 4-Way Purity。
      6. 准备就绪后，点击 Sort 和 OK 开始细胞核分选。
  5. 纯化细胞核的质量控制与计数
    注意：此步骤仅在优化样本制备流程的预实验中进行，目的是测试将要加载到 10X chromium 芯片上的分选细胞核的纯度。一旦方案完全优化，在后续实验中不建议执行此质量控制步骤，以避免不必要的细胞核浪费，尤其是在细胞核数量有限的情况下。
    1. 通过流式细胞术进行纯度控制
      1. 将 10 µL 分选后的细胞核转移至含有 90 µL 含 2% 热灭活胎牛血清（HI-FBS）的 DPBS 的新 FACS 管中。
      2. 采集并记录分选后数据，以验证分选纯度和活性。确保至少 98% 的细胞核落在如 4.2 所定义的目标门控区域内 （见 图 2B）。
    2. 计数纯化后的细胞核
      1. 将分选后的细胞核在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，并使用移液器小心彻底吸除上清液。将沉淀重悬于 100 µL 稀释的细胞核缓冲液中。
      2. 向一个空的 0.5 mL 管中加入 10 µL 0.4% 台盼蓝。加入 10 µL 分选后的细胞核，通过移液混合 5 次。
      3. 按照供应商推荐的方法使用自动细胞计数仪计数细胞核。将细胞核浓度调整至 3.5 × 106/mL，即每 5 µL 含 16,000 个细胞核。
    3. 通过显微镜进行纯化细胞核的质量控制
      注意：此步骤仅在优化样本制备流程的预实验中进行，目的是测试将要加载到 10X chromium 芯片上的细胞核质量。一旦方案完全优化，在后续实验中不建议执行此质量控制步骤，以避免不必要的细胞核浪费，尤其是在细胞核数量有限的情况下。
      1. 确保载玻片和盖玻片清洁无尘。如有需要，用无水乙醇清洗并冲洗盖玻片，并用无绒布擦干。
      2. 在将要使用的载玻片孔中加入 25 µL 多聚赖氨酸（poly-l-lysine），在室温（RT）下孵育 10 分钟，并防尘保护。
      3. 吸除多余的多聚赖氨酸，加入 10 µL 纯化的细胞核悬液。在室温下孵育 5 分钟，并防尘保护。
      4. 向每个孔中加入一滴封片剂，避免产生气泡。
      5. 将盖玻片盖在接种的孔上。用纸巾覆盖并用力按压盖玻片以去除多余的封片剂。注意不要移动盖玻片，也不要清理多余的封片剂。
      6. 使用倒置显微镜在明场光下拍摄多张图像，放大倍数至少为 40×。
  6. 进行多组学检测。
    1. 立即参照 Chromium Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达用户指南（CG000338 - Rev F）25进行操作。

2. 小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞（HSPCs）细胞核的纯化

注意：本方案描述了从小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞（HSPC）的三个亚群中纯化细胞核的方法：谱系-c-Kit+Sca-1+ 造血干细胞（HSC）、谱系-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- 共同髓系祖细胞（CMP）以及谱系-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ 粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）。实验过程中应始终佩戴乳胶或腈类手套。本方案改编自10X Genomics公司已验证的方案——用于单细胞多组学ATAC + GEX测序的细胞核分离方案（CG000365 - Rev C）27。在原始方案基础上进行了若干修改，以最大化细胞核回收率。强烈建议由两人共同完成本实验，其中一人负责步骤1至3（即单细胞悬液的制备），另一人并行执行步骤4（即分选仪的准备）。由于本方案对时间高度敏感，因此在单细胞悬液制备完成后立即使用已准备就绪的分选仪，以最大限度缩短样品处理时间，至关重要。

  1. 试剂与材料的准备
    1. 用冰填满一个水桶。
    2. 制备FACS缓冲液：将DPBS与2% HI-FBS溶液混合（每6个样本约需500 mL），并通过0.2 µm滤膜过滤。
    3. 制备收集液：每份样品取500 µL含10%热灭活胎牛血清的DPBS溶液，经0.2 µm滤膜过滤 过滤器
  2. 骨髓细胞的分离
    1. 采用机构批准的方案处死小鼠。本实验中，小鼠在过量使用氯胺酮/赛拉嗪后通过颈椎脱位法处死。
    2. 用70%乙醇喷洒小鼠的腹部和后肢。
    3. 使用无菌镊子和剪刀在下腹部中线处做一个小切口，并从后肢基部向横膈膜方向切开腹膜（补充图1).
    4. 在每侧后肢的打开的腹膜上做一条垂直的附加切口，然后抓住其中一条附加切口的两侧，将其拉开，将双侧后肢自踝关节以下的皮肤剥离，以暴露双侧后肢的肌肉。补充图 1A).
    5. 沿后肢髋关节处的脊柱方向放置剪刀，剪下后肢，注意不要剪断股骨补充图1B、C）。对另一条腿重复相同操作。
    6. 为分离股骨，先切除大部分肌肉组织，然后用双手分别握住股骨和胫骨，指尖置于关节处（补充图1D、E）。轻轻将腿部沿自然弯曲处折叠，使胫骨与股骨脱位（补充图1E然后用剪刀小心地剪断结缔组织，以分离股骨和胫骨。
    7. 使用剪刀以轻微扭转的动作，将股骨顶端的脊柱小段分离补充图1E).
    8. 用纸巾清洁分离出的股骨，以去除残留的肌肉和结缔组织。
    9. 置于含2 mL DMEM (1x) + GlutaMAX-I的12孔板中，保持冰上低温。
    10. 收集完所有股骨后，确保彻底去除骨骼上的肌肉和纤维组织。不要切开骨骼，以（a）保持骨髓内部无菌，以及（b）避免细胞在孔中丢失。采用以下步骤，参照 Haag 和 Murthy 的方法，从一只小鼠的两根股骨中冲洗细胞。28.
    11. 准备一个1.5 mL和一个0.5 mL离心管。向1.5 mL离心管中加入150 µL FACS缓冲液，然后用18 G针头在0.5 mL离心管底部打一个孔，将0.5 mL离心管插入1.5 mL离心管中。
    12. 使用小鼠手术剪打开每侧股骨的远端补充图1F）：将远端骨骺置于剪刀 blades 之间并固定，翻转剪刀时施加轻柔压力，以平稳分离远端骨骺，避免粗暴切割骨组织。若操作成功，此时暴露的骨骺端应可见 4 个突起（补充图1G).
    13. 将两根股骨骨髓端朝下插入已准备好的0.5 mL离心管中，该离心管置于含有FACS缓冲液的1.5 mL离心管内补充图1H).
    14. 将70 µm细胞滤网置于50 mL离心管上，并用2 mL FACS缓冲液预润湿滤网。
    15. 为冲洗骨髓，将离心管（管盖打开）在12,000 x g 直到离心机达到 12,000 x g 值，然后立即停止离心机。
    16. 确认骨髓细胞已沉淀至1.5 mL离心管底部，且股骨呈白色（细胞冲洗前为红色）补充图1I弃去装有2根股骨的0.5 mL离心管。
    17. 使用移液器弃去150 µL上清液。
    18. 用移液枪将沉淀在1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中重悬，室温下裂解红细胞1-2分钟。避免过长孵育时间，以免导致有核细胞活力下降。
    19. 通过预先润湿的70 µm细胞筛网转移至50 mL离心管中。
    20. 加入10 mL FACS缓冲液以稀释ACK裂解缓冲液，从而终止裂解反应。
    21. 400 x 离心 g 4 °C下离心5分钟。先用1 mL FACS缓冲液重悬，再加9 mL补足至10 mL，充分重悬。
    22. 按照1.3.8中的描述准备细胞以进行计数。
    23. 使用自动细胞计数器，按照供应商的推荐方法进行细胞计数。预计从2根股骨中可收集约4000万个细胞。
  3. 骨髓HSPC染色
    1. 在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，然后用移液器将细胞沉淀重悬于 FACS 缓冲液中，最终浓度为 1 × 107 cells/mL
    2. 使用 P1000 移液器将悬液转移至流式管中，通过 35 µm 细胞滤网帽过滤。
    3. 为所列每种抗体分别准备单染测试管样本 表1 设置细胞分选仪中荧光染料的补偿：
      1. 每个抗体准备一个流式管，并向管中加入200 µL PBS。
      2. 在每管荧光染料偶联抗体的FACS管中加入15 µL荧光补偿微珠。在未染色及Live/Dead单染细胞的FACS管中，不加微珠，改为加入500,000个细胞。
      3. 加入每种荧光染料偶联抗体各 1 µL（参见 表1将其加入相应的FACS管中。向Live/Dead单染FACS管中加入0.5 µL的Live/Dead染料。
      4. 置于冰上避光保存15分钟。
    4. 按照指示制备混合液1和混合液2 表2.
      注意：上述抗体用量仅作参考 表 2 适用于文中所引用抗体的 材料表它们需要针对任何新的抗体参照品或同一抗体参照品的不同批次进行优化。
    5. 向样品管中加入 300 µL 的混合液 1，重悬细胞，并在冰上避光孵育 15 分钟。
    6. 向样品管中加入 300 µL 的混合液 2，重悬后置于冰上避光孵育 20 分钟。
    7. 向单染管和混合染色样本管中各加入 3 mL FACS 缓冲液。在 400 x g 4°C 下离心 5 分钟。
    8. 使用微量移液器小心弃去上清液，并将沉淀重悬于500 µL FACS缓冲液中。
    9. 准备一个预先装有500 µL收集液的1.5 mL离心管。
      注意：Mix 1 使用 DPBS 配制，因其含有受热灭活胎牛血清（HI-FBS）显著影响的活/死细胞染料。细胞经活/死染色后，加入 Mix 2，其中含有溶解于含 HI-FBS 的 FACS 缓冲液中的荧光素偶联抗体。唯一的例外是抗 CD16/32 抗体，该抗体包含在抗体混合物 1（Antibody Mix 1）中，作为 Fc 受体阻断剂，以防止后续步骤中添加的其他抗体发生非特异性结合。
  4. 使用流式细胞分选仪进行细胞分选
    注意：尽管细胞分选可在多种细胞分选仪上进行，但本文所述为使用 BD FACSAria Fusion 或 BD FACSAria III 仪器的操作流程。强烈建议在仪器有经验的操作人员指导或监督下完成细胞分选仪的校准与设置。
    1. FACS 仪器的校准：参见方案 1 步骤 4.1。
    2. 细胞分选的流式细胞分选仪设置：
      1. 开始采集未染色细胞。未染色细胞用于设定前向散射和侧向散射参数，以及每种荧光染料的检测器电压。调整参数，使每种荧光染料的荧光信号位于点图对数刻度的第一 decade 范围内。
      2. 获取单色对照以手动设置补偿（阳性与阴性群体的中位值应保持一致），或使用自动计算软件（斜率测量法）。确保补偿对照与实验所用的荧光染料及检测器设置相匹配。细胞记录10,000个事件，微球记录5,000个事件。
      3. 使用样本管（即多重染色的细胞）并结合图示的设门策略来定义目标细胞群 图 3A. 按照以下步骤 4 至 6 进行操作。
      4. 为鉴定三种目标骨髓造血干细胞（HSC、CMP 和 GMP），首先根据细胞大小（FSC-A）和颗粒度（SSC-A）设门圈选白细胞，再通过 FSC-H/FSC-A 区分双联体细胞。
      5. 根据SSC-A/死细胞标记圈选活细胞。利用Lineage/c-Kit圈选Lineage阴性且c-Kit表达水平中等至高的细胞。通过c-Kit/Sca-1，圈选Lineage阴性细胞-c-Kit+ Sca-1+ （LKS+造血干细胞（HSCs），即三种目标细胞群之一。
      6. 在髓系前体细胞（谱系-c-Kit+Sca-1-）中，使用FcγR/CD34 排除 CD34-FcγR- 巨核细胞和红系祖细胞（MEP），同时包含CD34+ FcγR- CMP以及CD34+FcγR+ 待分选细胞群体中的GMP
      7. 确保流束和偏转稳定。
      8. 在侧流摄像机中，开启测试分选，打开电压，确认液滴准确分选至左侧安装的1.5 mL离心管中。
      9. 在 排序布局 窗口中，选择感兴趣的群体（即 "LKS+" 和 "CD34+ 髓系祖细胞" 如本示例所示）。在 设备，选择 2 管. 在……之下 精确度，选择 纯度在 目标事件，选择 连续的 分选160,000至200,000个LKS细胞+ 和 CD34+ 髓系祖细胞
      10. 加入500 µL FACS缓冲液至细胞悬液中，将1 mL样品通过滤网转移至新的带有35 µm细胞滤网帽的FACS管中，以确保上机前所有细胞均为单细胞悬液。此步骤可消除可能堵塞仪器的细胞团块。
      11. 准备就绪后，点击 排序 和 好的 开始分选。调节 流速 将速度维持在每秒10,000个事件以下。
        注意：LKS 的预期比例+ CD34+ 髓系祖细胞在稳态下成年（8-12周龄）雌性C57BL/6J小鼠中的比例为1:3。目标分选细胞数量通常在分选30分钟内即可达到。
  5. 分选细胞的质量控制与计数
    注意：此步骤仅在初步实验中进行，旨在优化样品制备流程，并检测用于细胞核分离的分选细胞的纯度。一旦实验方案完全优化，在后续实验中不建议执行此质量控制步骤，以避免浪费可能数量有限的起始材料用于细胞核分离。
    1. 通过流式细胞术进行纯度检测
      1. 将10 µL分选后的细胞转移至含有90 µL FACS缓冲液的新FACS管中。
      2. 获取并记录分选后数据，以验证分选纯度和细胞活力。确保至少95%的细胞位于步骤3-6中定义并图示的目标门控区域内。 图3B.
  6. 从分选的骨髓HSPC中分离细胞核
    1. 使用 "低细胞量细胞核提取" 10X Genomics 验证方案附录操作流程——单细胞多组学ATAC + GEX测序的细胞核分离（CG000365 - Rev C）27，以下修改旨在优化细胞核的回收：
      1. 裂解时间：针对本方案进行预实验，以确定用于细胞核分离的最佳裂解时间。需确保细胞完全裂解，同时保持细胞核完整。
        注意：上述 10X Genomics 方案的步骤 f27 指示进行 "在冰上孵育 [在裂解缓冲液中] 3–5 分钟"在预实验中，至少测试3分钟、4分钟和5分钟的裂解时间，并通过计数评估回收细胞核的数量，通过流式细胞术和显微成像评估其质量，以确定最佳裂解时长（详见下文对这些质量控制检测的描述）。为节约试剂，在预实验中可用含0.04% BSA的PBS替代稀释后的细胞核缓冲液。对于骨髓HSPCs，确定3分钟为最佳裂解时长。
      2. 细胞离心：所有细胞悬液离心步骤均在300 x g 7分钟（而非CG000365 - Rev C中的5分钟）27 4 °C下
      3. 细胞核离心：所有细胞核悬浮液的离心步骤均在500 x g下进行 g 根据CG000365 - Rev C，孵育5分钟27.
      4. 细胞核收集：在步骤b中，用50 µL含0.04% BSA的PBS重悬并转移至0.2 mL离心管后，向原管中加入50 µL含0.04% BSA的PBS，通过移液器吹打混匀以收集残留细胞，再转移至该0.2 mL离心管中，使总体积达到100 µL。
      5. 此后总体积将为100 µL，而非原方案中的50 µL。请相应调整后续步骤（例如，步骤d中移除90 µL而非45 µL；步骤e中加入90 µL裂解缓冲液而非45 µL）。
      6. 对于步骤 m，将细胞核沉淀重悬于 12 µL 稀释的细胞核缓冲液中，而不是 7 µL。
      7. 计数分离的细胞核。取一支空的0.5 mL离心管，加入10 µL 0.4%台盼蓝溶液和8 µL含0.04% BSA的PBS。
      8. 向离心管中加入 2 µL 细胞核，按照 1.3.8 节所述方法计数细胞核。根据供应商的建议使用自动细胞计数仪进行计数。
  7. 通过流式细胞术进行纯度检测
    注意：此步骤仅在初步实验中进行，用于优化样本制备流程，并检测将要上样至10X Chromium芯片的细胞核纯度。一旦实验方案完全优化，在后续实验中不建议执行此质量控制步骤，以避免不必要地浪费可能数量有限的收集细胞核。
    1. 完成细胞核分离后，取6 µL细胞核重悬液转移至预装有150 µL FACS缓冲液的新FACS管中。加入3 µL 7-AAD，冰上孵育5分钟。
    2. 获取并记录分选后数据，以验证分选纯度和细胞核活性。确保至少95%的细胞核位于方案1第4.2步所定义的目标门控区域内。 （参见 图4).
  8. 显微镜下对纯化细胞核的质量控制
    注意：此步骤仅在初步实验中进行，用于优化样本制备流程，以检测将要上样至10X Chromium芯片的细胞核质量。一旦实验方案完全优化，在后续实验中不建议执行此质量控制步骤，以避免不必要地浪费可能数量有限的收集到的细胞核。
    1. 按照步骤1.5.3所述进行操作。
  9. 进行多组学检测
    1. 立即前往 Chromium Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达用户指南（CG000338 - Rev F）25.

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上述两种方案详细描述了从两种不同类型的组织中分离细胞核的步骤。图1以示意图形式展示了这两种方案的差异与相似之处。

小鼠脑组织细胞核的纯化
本文所述方案中，我们提出一种温和的方法，用于从脑组织样本中制备细胞核。该方法首先在裂解缓冲液中对脑组织进行机械性解离，随后通过洗涤和滤网过滤步骤，去除悬液中残留的组织碎片。接着利用流式细胞分选（FACS）去除碎片、未裂解的细胞及小颗粒，以确保仅有纯化的细胞核被用于后续的Multiome实验流程。图2展示了分选前后细胞核的特征图谱。在过滤后、细胞核分选前，样本中含有大量碎片，其中超过99%的“单细胞”呈细胞核染料（7-AAD）阳性，表明细胞裂解效果理想（图2A）。细胞核根据7-AAD阳性门控进行分选，并采集部分分选产物以验证所制备细胞核的纯度。图2B展示了脑细胞核分选后的图谱。通过细胞核分选，细胞核纯度从初始的36%（图2A）提高至近100%（图2B）。

使用7-AAD进行流式细胞术分析，显示用于细胞活力评估的SSC-A与7-AAD点图。
图2：细胞核分选及分选后纯度检测的设门策略。 细胞核经7-AAD染色后由细胞分选仪获取。(A) 首先根据细胞核的大小和颗粒度（分别为FSC-A和SSC-A）进行设门，随后根据FSC-A/FSC-H特性及7-AAD染色情况筛选单个粒子。( B) 细胞分选后，取收集管中部分细胞核采用与A相同的设门策略进行纯度检测。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠骨髓造血干细胞前体（HSPCs）的纯化
从骨髓中分离后，根据图3A所示的设门策略，通过FACS分选最多2 × 105个HSPCs。分选效率和样品纯度通过分析进行评估（图3B）。

流式细胞术流程图，使用SSC-A和FSC-A鉴定白细胞和髓系前体细胞。
图3：骨髓HSPC分选的设门策略。（A）用于分选活的LKS+造血干细胞和CD34+髓系前体细胞以进行细胞核分离的代表性FACS设门策略。（B）用于验证分选后细胞群纯度的代表性FACS图。图中显示的是各细胞亚群相对于其亲本群体的比例。*两个已分选的细胞群。请点击此处查看该图的放大版本。

“低细胞量细胞核分离”方案可用于从最多105个细胞的样本中分离细胞核。该方案包含较少的离心步骤，从而最大限度地减少细胞/细胞核的损失。我们根据细胞输入量按比例调整了裂解缓冲液和洗涤缓冲液的体积，并延长了离心时间以实现细胞核的最大回收率。我们进行了预实验，通过计数评估回收细胞核的数量，并通过流式细胞术和显微成像评估其质量。图4显示了细胞裂解后的HSPC样本。如图5A所示，该方案获得了高质量的细胞核，且无任何可能影响后续多组学实验流程的碎片。

流式细胞术分析示意图、细胞分选过程、7-AAD染色、组织样本鉴定。
图4：分离的骨髓HSPC细胞核的纯度检测分选。细胞核经7-AAD染色后由细胞分选仪采集。首先根据细胞核的大小和颗粒度（分别为FSC-A和SSC-A）设门，以评估样本纯度。图中所示为相对于亲代群体的细胞核比例。请点击此处查看该图的放大版本。

管编号管名称染色目标染色目标用量抗体/染料 (µL)收集缓冲液 (µL)
1未染色细胞500,000不适用200
2LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色剂细胞500,0000.5
3APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR)OneComp eBeads15 µL1
4Pacific Blue anti-mouse Lineage CocktailOneComp eBeads15 µL1
5PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)OneComp eBeads15 µL1
6APC anti-mouse CD117 (c-Kit)OneComp eBeads15 µL1
7FITC anti-mouse CD34OneComp eBeads15 µL1

表1：流式细胞仪补偿设置所需的单染对照。 表中列出了所需的单染对照、应染色的细胞或微球数量以及抗体用量。

主混合液试剂终浓度稀释倍数抗体/染料 (µL)缓冲液类型缓冲液 (µL)
混合液1APC/Cyanine 7 标记抗小鼠 CD16/32 (FcγR)1/5001.2DPBS300
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂1/2502.4
混合液2Pacific Blue 标记抗小鼠 Lineage 混合抗体1/2030FACS 缓冲液300
PE 标记抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)1/2003
APC 标记抗小鼠 CD117 (c-Kit)1/2003
FITC 标记抗小鼠 CD341/5012
总染色体积600

表2：骨髓HSPC染色混合液的组成。 显示的是对一个含有4000万个细胞的样本进行染色所需的试剂体积。若需染色更多样本，将所示体积乘以所需样本数量，并额外增加半个样本体积，以确保配制的主混合液体积充足。

补充图1：骨髓细胞分离方案。（A）切开腹膜。白色虚线表示应沿其切割的切口线。（B）剥去后肢皮肤后，将剪刀沿髋关节处的脊柱方向贴合，完整剪下后肢，注意不要剪断股骨。（C）在去除肌肉前，从身体分离下来的后肢外观。（D）去除肌肉后的后肢外观。（E）在膝关节处分离股骨，随后在髋关节处分离，操作时注意不要切开股骨。白色弯曲箭头表示所需操作动作。白色虚线箭头指示需用剪刀轻轻夹取并分离的区域。（F）用剪刀牢固夹住软骨和远端骨骺，向后翻转，以打开股骨远端（即先前在膝关节处与胫骨相连的部分），暴露骨髓。（G）在暴露的骨骺端应可见四个突起，由黑色箭头指示。（H）将开口端朝下插入置于含150 µL FACS缓冲液的1.5 mL管内的0.5 mL预置管中，股骨的外观。（I）在12,000 xg条件下短暂离心后，骨髓细胞沉淀以及变为白色的股骨外观。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

制备高质量的细胞或细胞核悬液对于单细胞或单细胞核RNA测序以及单细胞多组学分析的成功至关重要29,30,31。本文中，我们描述了从两种组织类型——脑组织和骨髓——制备样本及分离细胞核用于多组学检测的实验方案。

本文所述的脑组织实验方案可从新鲜冷冻的脑组织中分离出高质量的细胞核。该方案包括以下步骤：冷冻组织破碎、细胞核分离、细胞核纯化以及制备样品的质量控制。脑组织由多种不同类型的细胞组成，因此组织解离和细胞核分离过程应保持初始组织中各类细胞群体的原有比例。本实验优化了裂解缓冲液的成分和孵育时间，以实现对构成组织的所有细胞群体进行彻底且温和的裂解。

骨髓HSPC实验方案略有不同，因为在实验开始时需要增加一个步骤，即从异质性细胞悬液中分离出目标细胞群体。在采集新鲜组织后，裂解红细胞，并对样本中目标细胞亚群进行富集。随后裂解目标细胞，分离细胞核，并对所制备材料的质量进行检测。

10X Genomics 提供了多种经过验证的适用于不同组织的细胞核分离方案32,33。该公司还商业化推出了一款细胞核分离试剂盒，可对已验证的组织类型提供简便的细胞核分离流程34。然而，这些方案仍需进一步优化，以适应特定样本的特性。例如，某些样本需要在低细胞投入量条件下操作。对于此类样本，最具挑战性的步骤是离心过程——必须足够严格以确保样本清洁，同时又需足够温和以避免细胞/细胞核的损失。本文所述方案对 10X Genomics 已验证方案——单细胞多组学 ATAC + GEX 测序的细胞核分离（CG000365 - Rev C）27 进行了优化，实现了上述两项要求之间的良好平衡。如从分选的 HSPC 制备细胞核的示例所示，我们在不降低样本质量的前提下显著提高了细胞核的回收率。

另一个挑战是裂解纯化细胞以分离细胞核的步骤。过于剧烈的裂解条件或过长的孵育时间可能会损伤细胞核，从而影响测序数据的质量。图5展示了骨髓样本在不同裂解缓冲液孵育时间后的代表性细胞核成像，说明了细胞裂解条件不同时细胞核状态的差异。以HSPCs为例，我们确定3分钟的裂解时间为最佳条件，此时形态健康、完整的细胞核比例最高，而受损细胞核的比例最低。对于每种新类型的样本，均应优化裂解孵育时间。

显微镜下的寄生虫生活周期阶段；显微图像比较；比例尺为 5 μm；生物学研究。
图 5：通过显微镜进行细胞核质量控制。图中显示从小鼠骨髓分离的代表性明场图像，其中（A）为完整细胞核，（B）为受损细胞核。比例尺 5 µm。图像使用倒置显微镜，配备 40x ELWD NA 0.60 物镜和 1.5x 数字变焦拍摄。 请点击此处查看该图的放大版本。

本研究中详述的两种方案均依赖于使用高通量FACS仪器对目标细胞或细胞核进行分选。这一步骤在单细胞/单细胞核制备方案中至关重要，尤其是在需要从异质性细胞悬液中分离稀有细胞亚群时。与本文所示造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分选示例类似，可能需要采用高维流式细胞术 panel，以实现对目标细胞群体的“设门”分析。该分选过程极为快速且准确，可获得纯度超过95%的分选细胞亚群。然而，该方法会使细胞悬液承受高达70 psi的压力，因此在分选脆弱细胞（例如树突状细胞、中性粒细胞）时可能受限，因为高压可能导致细胞膜破裂。在此类情况下，应选择其他细胞纯化方案，包括磁珠分选、新一代仪器（例如CellenOne、Cellenion；MACSQuant Tyto、Miltenyi）35，36，或基于液滴的系统（例如ODIN、Sensific）37。然而，这些技术的分选速度较慢，分选过程往往持续数小时而非数分钟，因此在需要处理大量细胞以制备活细胞用于Multiome及其他单细胞应用时，其应用受到显著限制。

对于从组织中分离的细胞核进行纯化，流式细胞分选（FACS）是首选方法，因其具有高通量以及可获得高纯度的分离产物。细胞核对压力不敏感，因此经过滤处理的组织样品可轻松通过细胞分选仪进行纯化。如果实验室未配备FACS仪器，也可采用其他替代方法，虽然效率略低，但效果足够良好。例如超速离心法，或使用小型设备如MARS（Applied Cell），该设备利用颗粒大小差异并通过声波实现分离；CURIOX层流清洗仪，利用细胞/细胞核悬液的疏水特性进行分离；或LEVITAS bio，该技术基于细胞的物理特性（磁悬浮）将细胞与碎片分离。

本文所述方案旨在获得高数量和高纯度的细胞核，以满足后续Multiome实验的要求。由于FACS分选和多次离心步骤会导致初始材料大量损失，因此本文所描述的脑组织细胞核制备方案要求起始材料必须足够丰富，以确保在FACS分选后至少能收集到50万个细胞核。如果无法满足该条件，则应采用其他替代方案。当处理稀有细胞群体或小块组织样本时，初始材料的数量可能成为限制因素。为解决这一问题，可通过以下方式提高细胞核回收率：（a）减少裂解液体积，（b）减少洗涤液体积，（c）仅进行一次洗涤并延长离心时间，以尝试提高回收率，具体操作可参考10X Genomics公司针对低细胞输入量细胞核分离的方案。对于低样本量的多组学分析，可考虑使用基于孔板的技术，如scNMT、SNARE-seq和Paired-seq38，这些方法对起始样本量的需求显著更低。

综上所述，我们描述了两种用于制备脑组织和骨髓造血干细胞及祖细胞（HSPCs）细胞核以进行后续Multiome分析的可靠方案。这些方案适用于任何需要从上述两种组织中获得高质量单细胞核悬液的科研项目，而不论其具体的科学问题如何。本课题组已将脑组织细胞核分离方案应用于靶向基因失活后脑发育的研究，以及神经系统疾病背景下免疫反应的研究。我们还利用骨髓细胞核分离方案来解析不同造血亚群在免疫系统建立过程中的作用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ana Jeemin Choi 获得了巴斯德研究所—巴黎大学（PPU）国际博士项目提供的津贴资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18 G × 1 ½ (1.2 mm × 38 mm) Agani 针头TerumoAN*1838S1
15 mL 离心管Falcon352097
5 mL 圆底 FACS 管，带 35 µm 细胞筛帽falcon352235
50 mL 离心管Falcon352070
7-AADBD pharmagen559925
ACK 裂解缓冲液GibcoA10492-01
APC 抗小鼠 CD117 (c-Kit)BioLegend105812克隆：2B8
APC/Cyanine 7 抗小鼠 CD16/32 (FcγR)BioLegend101328克隆：93
BD FACSAria IIIBD Biosciences不适用
BD FACSDiva 软件 v8.0.1BD Biosciences不适用
牛血清白蛋白  10% 储存液Miltenyi Biotec130-091-376
细胞染色缓冲液Biolegend420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6Nikon 不适用
CMOS 相机 Prime 95B 25 mmPhotometrix不适用
Countess II FL 全自动细胞计数仪InvitrogenAMQAF1000
Countess 细胞计数板载玻片InvitrogenC10283
盖玻片 24 mm × 24 mm 0.13–0.17 mmBrandBR470819
5% 皂苷InvitrogenBN2006
一次性手术刀片 Swann-Morton 0508
DMEM (1×) + GlutaMAX-IGibco31966-021
DPBS (10×)Gibco14200-067
DTTSigma aldrich646563
尼康 Ti2-E 倒置落射荧光显微镜Nikon 不适用
Eppendorf Safe-Lock 管 0.5 mLEppendorf30123603
70% 乙醇VWR83801.290
FITC 抗小鼠 CD34Invitrogen11-0341-85克隆：RAM34
解剖镊子FST11152-10
热灭活胎牛血清 (FBS)Gibco11533387
Dounce 匀浆器 2 mLBellco glass1984-10002研杵 “A” 大间隙：.0030–.0050″ 和研杵 “B” 小间隙：.0005–.0025″
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒InvitrogenL34957
1 M 氯化镁溶液Sigma aldrichM1028
微量离心机 Eppendorf5424R
封片剂 Fluoromount-G invitrogen00-4958-02
Nonidet P40 替代物Sigma aldrich74385
无核酸酶水ThermoFischerAM9932
20× 细胞核缓冲液 10X Genomics2000153/2000207
细胞核分离试剂盒 EZ prepSigma AldrichNUC-101
OneComp eBeads 补偿微珠Invitrogen01-1111-41
太平洋蓝抗小鼠谱系混合抗体
（包括抗小鼠 CD3、Ly-6G/Ly-6C、CD11b、CD45R/B220、TER-119）		BioLegend133310克隆（顺序与上述抗体一致）：17A2、RB6-8C5、M1/70、RA3-6B2、Ter-119
PCR 管条 0.2 mLEppendorf951010022
PE 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend122507克隆：E13-161.7
培养皿 100 mm × 20 mm OPTILUXFalcon353003
0.01% 多聚赖氨酸，无菌过滤，适用于细胞培养SigmaP4707
8 孔带编号打印载玻片，孔径 6 mmEprediaER-301B-CE24
蛋白质 LoBind 管 1.5 mLEppendorf30108116
重组 RNase 抑制剂 5000 UTakara2313A
解剖剪刀FST14090-09
5 M 氯化钠溶液Sigma aldrich59222C
注射器滤器，PES，0.2 µmFisher Scientific15206869
透明指甲油 任意品牌不适用
Trizma 盐酸溶液 pH 7.4Sigma aldrichT2194
0.4% 台盼蓝gibco15250061
Tween 20Biorad 1662404
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水Invitrogen10977-035

参考文献

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