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方法文章

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）诱导三元复合物形成的生物物理检测方法的开发与应用

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DOI：

10.3791/65718

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2024年1月12日

 , 
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

本文内容

摘要

本文描述了靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs）诱导形成三元复合物的生物物理表征方案，其中涉及泛素连接酶Von Hippel-Lindau E3连接酶（VHL）和Cereblon（CRBN）。本文所展示的生物物理方法包括表面等离子共振（SPR）、生物膜干涉技术（BLI）以及等温滴定 calorimetry（ITC）。

摘要

E3 连接酶与靶向降解的蛋白质可通过异双功能分子在多步过程中被诱导形成复合物。所涉及相互作用的动力学和热力学特性会影响泛素化效率及靶蛋白的最终降解效果。表面等离子共振（SPR）、生物膜干涉技术（BLI）和等温滴定 calorimetry（ITC）等生物物理技术可提供有价值的信息，用于优化这些相互作用。本研究利用两个模型系统，建立了一套生物物理检测工具包，用于理解三元复合物形成的协同性以及“钩状效应”对结合动力学的影响。在第一个案例中，评估了一种诱导 Brd4BD2 与 VHL 之间形成三元复合物的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）分子。该异双功能分子 MZ1 对 Brd4BD2 蛋白（SPR KD = 1 nM，ITC KD = 4 nM）和 VHL 复合物（SPR KD = 29 nM，ITC KD = 66 nM）均具有纳摩尔（nM）级亲和力。针对该系统，开发了稳健的 SPR、BLI 和 ITC 检测方法，成功重现了已发表的结果，证实了三元复合物形成的协同效应。在第二个案例中，研究了一种可诱导 46.0 kDa 蛋白 PPM1D 与 cereblon [CRBN (319-442)] 形成三元复合物的分子。该异双功能分子 BRD-5110 对 PPM1D 的 SPR KD 为 1 nM，但对截短型 CRBN (319-442) 复合物的结合弱得多（SPR KD ≈ 3 µM）。在此情况下，SPR 检测中 CRBN 的结合未达到饱和，出现了"钩状效应"。本研究还评估了 SPR、BLI 和 ITC 在通量和试剂消耗方面的需求，并为这些技术在 PROTAC 项目中的应用提供了通用建议。

引言

细胞内蛋白质的多聚泛素化是一个受到严密调控的过程，涉及泛素连接酶家族的多种酶1,2。该通路中的终末酶是E3泛素连接酶，可将泛素分子共价连接至其蛋白质结合伴侣3。这些蛋白质结合伴侣的多聚泛素化修饰使其被蛋白酶体识别并进行蛋白水解降解4。该系统属于蛋白质稳态调控机制的一部分，目前已在治疗上被用于诱导与疾病相关蛋白的降解5。其中，能够诱导E3泛素连接酶（如Von Hippel-Lindau E3连接酶（VHL）或cereblon（CRBN））与靶蛋白相互作用的小分子，通常由一个结合E3泛素连接酶的弹头基团，通过柔性连接链与另一个结合靶蛋白的弹头基团相连构成。这类异源双功能分子通常被称为蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras），即PROTACs6。

PROTAC 分子的开发涉及评估其在细胞中诱导蛋白质降解的能力。目前已开发出多种细胞检测系统，用于监测在 PROTAC 分子处理细胞后，目标蛋白与 E3 连接酶组分（如 VHL 或 CRBN）之间诱导形成的相互作用。其中一种细胞检测方法是纳米荧光素酶-HaloTag 系统7，该系统包含与 HaloTag 受体融合的 E3 连接酶，以及带有纳米荧光素酶供体标记的目标蛋白。三元复合物的形成使纳米荧光素酶供体与 HaloTag 受体相互靠近，从而实现能量从供体向受体的转移，并产生发光信号。该系统的多种变体可用于评估 PROTAC 分子的细胞通透性8，或目标蛋白泛素化水平的相对变化9。尽管这些细胞系统对于推动 PROTAC 的优化至关重要，但 E3 连接酶与待降解蛋白之间的复合物形成是一个多步骤过程10,11。其中涉及的二元和三元相互作用的动力学与热力学特性，共同影响着蛋白质泛素化的效率及其最终的降解效果12,13,14。

本文描述了可用于通过表面等离子共振（SPR）、生物膜层干涉技术（BLI）和等温滴定 calorimetry（ITC）对 PROTAC 诱导的三元复合物形成的生物物理特性进行表征的实验方案。其中包括针对 MZ1 PROTAC 分子的 SPR 和 ITC 实验方案，该分子可诱导 Brd4 之间的三元复合物形成BD2 以及来自文献报道的VHL13,15 并在此描述的研究能够通过对接实验方案进行部分修改，重现已报道的结果，相关修改内容将在下文讨论。以下描述了一种生物发光成像（BLI）检测方法，用于评估 MZI、Brd4 之间三元复合物的形成BD2，且本报告中包含了VHL。BLI测得的亲和力数据与SPR和ITC实验中观察到的结果一致。此前已发表的一项协议中，开发了SPR检测方法用于评估PROTAC诱导的PPM1D（一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其表达受p53依赖性机制调控）与VHL之间的三元复合物形成16，同时对CRBN也有描述。在此情况下，该PROTAC分子对PPM1D具有纳摩尔级亲和力，而对CRBN仅具有微摩尔级亲和力。因此，PROTAC分子与CRBN的结合无法达到饱和，导致通常观察到的现象 "钩状效应"钩端效应是三元体系的一种特性，其中两种组分在同时与一个桥接分子结合时，可形成异源三聚体复合物。图1)17钩效应在桥接物种相对于另外两种物种浓度过高时被观察到。此时，二元相互作用会胜过三元相互作用。出现钩效应的系统需要在本报告中讨论的特定实验设计考量。本文提供了利用生物物理检测评估PROTAC诱导的三元复合物形成的通用概念及试剂要求。

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方案

所有蛋白质均在E.coli中高效表达，产量和纯度良好（>80%），具体操作参照文献方法18。生物素化反应采用BirA催化的反应完成18。所有小分子均用100% DMSO配制成1 mM的储备液。本文所述操作无需特殊实验室安全设备或特殊防护措施，仅需使用标准的实验室个人防护装备（PPE）（即实验服、护目镜和手套）。

本研究中使用的蛋白质如下所列：
VHL：在ElonginB的C末端带有Avi标签的生物素化VHL(53-213)/ElonginB(1-104)/ElonginC(17-112)复合物。
Brd4BD2：无标签的Brd4BD2(333-460)
CRBN：在N末端带有Avi标签的生物素化CRBN(319-442)
PPM1D：N末端无标签或双His8标签的PPM1D(1-420)

本研究中使用的小分子如下所列：
MZ1（分子量 = 1002.6 Da）：可结合 VHL 和 Brd4BD2 的 PROTAC
BRD-2512（分子量 = 841.4 Da）：CRBN 的 KD 值约为 3 µM，不与 PPM1D 结合
BRD-5110（分子量 = 872.0 Da）：CRBN 的 KD 值约为 3 µM，PPM1D 的 KD 值为 1–2 nM
BRD-4761（分子量 = 476.6 Da）：不与 CRBN 结合，PPM1D 的 KD 值为 1–2 nM

1. 方法一：ITC（等温滴定 calorimetry）

注意：滴定使用带有自动注射功能的微量热量计进行。

  1. 缓冲液配制：配制 3 L 含 20 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM TCEP、pH 7.5 的缓冲液。
  2. 透析：将 VHL 和 Brd4BD2（各约 500 µL，浓度为 150 µM）在步骤 1.1 配制的缓冲液中于 4 ˚C 下透析 3 次，时间分别为 4 h、2 h 和约 16 h。最后一次透析后的缓冲液保留，用于后续步骤。
  3. 在带塑料盖的 96 孔板中准备样品。
    1. 每次滴定需准备 400 µL 样品池溶液、125 µL 注射器溶液和 400 µL 清洗缓冲液。将样品加入板中连续的三个孔。由于化合物储备液为 1 mM 浓度、溶于 100% DMSO，需在蛋白溶液中加入相同百分比的 DMSO，以确保样品池和注射器中的缓冲液条件一致。最终溶液中 DMSO 浓度为 2%。
      1. VHL 滴定至 MZ1 的样品：样品池溶液包含 392 µL 缓冲液、4 µL 1 mM MZ1（终浓度 10 µM）和 4 µL 100% DMSO；注射器溶液包含 122.5 µL 85.7 µM VHL 和 2.5 µL 100% DMSO（终浓度 84 µM）。
      2. VHL 滴定至缓冲液的样品（用于校正样品 1.3.1.1 数据的背景信号）：样品池溶液包含 392 µL 缓冲液和 8 µL 100% DMSO；注射器溶液包含 122.5 µL 85.7 µM VHL（终浓度 84 µM）和 2.5 µL 100% DMSO。
      3. VHL 滴定至 MZ1 和 Brd4BD2 的样品：样品池溶液包含 392 µL 17.1 µM Brd4BD2（终浓度 16.8 µM）、3.36 µL 1 mM MZ1（终浓度 8.4 µM）和 4.64 µL 100% DMSO；注射器溶液包含 122.5 µL 85.7 µM VHL（终浓度 84 µM）和 2.5 µL 100% DMSO。
      4. VHL 滴定至 Brd4BD2 的样品（用于 1.3.1.3 的背景校正）：样品池溶液包含 392 µL 17.1 µM Brd4BD2（终浓度 16.8 µM）和 8 µL 100% DMSO；注射器溶液包含 122.5 µL 85.7 µM VHL（终浓度 84 µM）和 2.5 µL 100% DMSO。
  4. 在微量热量计上运行全部四组滴定实验。每组实验包含 19 次注射，每次注入 2 µL 注射器溶液，速率为 2 µL/s，间隔时间为 120 s。首次注射蛋白（0.4 µL）在数据分析时舍弃。所有实验在 25 ˚C 下进行，搅拌速度为 600 rpm。
  5. 数据分析：使用仪器制造商提供的分析软件，将数据拟合为单结合位点模型，获得化学计量比（n）、解离常数（KD）和结合焓变（ΔH）（图 2）。

2. 方法2：BLI（生物层干涉测量法）

  1. 在室温（RT）下使用链霉亲和素（SA）包被的传感器进行BLI实验，数据采集速率为5 Hz。在自动化的BLI实验过程中，确保传感器在单个列内保持静止。 在最大孔体积为 392 µL 的 96 孔平底黑色板中，于不同列之间移动，并向实验所用板的每孔中加入 200 µL 溶液。
    注意：BLI 仅适用于检测蛋白质-蛋白质相互作用（即三元复合物的形成），其灵敏度不足以检测蛋白质与小分子之间的相互作用。
    1. 缓冲液配制：配制100 mL含有20 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM TCEP、0.05% P20、pH 7.5的缓冲液。
    2. 固定步骤的优化：按照制造商建议，将测试传感器的负载量控制在1-3 nm。本方案中采用约1.0 nm的负载量。为达到此目标，将传感器浸入含1.5 µg/mL VHL的溶液中，孵育80 s。
    3. 使用以下步骤，通过应用七个SA传感器进行BLI动力学测量：
      1. 在第一个基线阶段，将样品浸入缓冲液中60秒。
      2. 固定相步骤：将样品浸入浓度为1.5 µg/mL的VHL溶液中，持续80秒。
      3. 对于第二个基线阶段，浸入 缓冲液处理 60 秒。
      4. 结合相中，浸入固定浓度的 Brd4 溶液BD2 在2 µM BRD4 BD2、2% DMSO（固定浓度）以及MZ1浓度分别为100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.3 nM、3.1 nM和0 nM（参照传感器）的条件下，孵育300秒。
      5. 对于解离阶段，浸入 缓冲600秒。
    4. 使用制造商提供的软件进行数据分析。 k开启, k关闭，以及 KD 用于数据拟合的报告（图3).

3. 方法3：SPR（表面等离子体共振）

注意：所有 SPR 实验均使用链霉亲和素（SA）包被的传感器芯片在室温下进行。尽管 NTA 芯片可用于检测蛋白质与小分子之间的相互作用，但在应用于三元复合物检测时需谨慎，因为与 SA 芯片相比，NTA 芯片背景信号显著升高，可能是由于带电荷的芯片表面与分析物中的蛋白质之间存在静电相互作用所致。

  1. SPR 法检测 VHL-MZ1 相互作用
    1. 缓冲液的配制
      1. 配制1 L含有20 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM TCEP、0.005% P20、pH 7.5的缓冲液，并通过0.2 µm滤器过滤。
      2. 取出20 mL缓冲液留作后续使用（无DMSO缓冲液），并补充20 mL DMSO（最终运行缓冲液中DMSO浓度为2%）。在下述所有样品中（步骤3.1和3.2）保持DMSO浓度为2%
    2. 按照制造商的说明书激活SA芯片，并将VHL固定至约2000 RU（以5 µL/min流速注入5 µg/mL的蛋白质溶液）。
    3. 在384孔、锥底、半透明聚丙烯板（最大体积130 µL）上，用3倍稀释法进行8个浓度点的系列稀释，MZ1最高浓度为10 µM。使用与聚丙烯微孔板兼容的自粘性透明塑料封板膜密封板孔。
      1. 使用不含DMSO的缓冲液配制最高浓度溶液，以确保最终浓度为2% DMSO。向147 µL不含DMSO的缓冲液中加入1.5 µL浓度为1 mM的MZ1储备液和1.5 µL纯DMSO。
      2. 用含有2% DMSO的运行缓冲液制备3倍系列稀释液。取100 µL运行缓冲液，加入50 µL在步骤3.1.3.1中配制的最高浓度溶液，充分混匀，以制备2nd 最高浓度
      3. 然后将步骤 3.1.3.2 中配制的溶液 50 µL 转移至下一管含 100 µL 运行缓冲液的试管中，充分混匀，以配制 3rd 最高浓度，依此类推。
    4. 采用多循环模式运行表面等离子共振（SPR）：模式：高性能；接触时间：120 秒；解离时间：300 秒；流速：50 µL/min。
    5. 使用仪器制造商提供的评估软件进行数据分析。稳态分析表明 KD = 26 (± 3) nM，达到的最大结合率（Rmax）约为 91% (± 5%)图 4A)
  2. SPR 分析 VHL:MZ1:Brd4 复合物BD2 三元复合物
    1. 按照步骤 3.1.1 中所述配制缓冲液。
    2. 按照制造商的说明书激活SA芯片，并将VHL固定至约100 RU。以5 µL/min的流速注入浓度为0.5 µg/mL的VHL蛋白溶液，接触时间为1–5分钟，直至表面密度达到约100 RU。
    3. 在96孔透明聚苯乙烯圆底板（最大体积为323 µL）中，按照步骤3.2.3.1–3.2.3.2所述，制备两组5倍稀释、5个浓度点的单循环进样样品，并用与聚苯乙烯微孔板兼容的自粘性透明塑料封板膜密封。
      1. 阴性对照：分析物含有 Brd4BD2 仅。
        1. 在运行缓冲液中配制25 µM的最高浓度溶液，体积为200 µL（#A5）
        2. 每份加入 160 µL Brd4BD2 在流动缓冲液中以 2 µM 浓度加入左侧接下来的 4 个孔（#A1-A4）
        3. 将40 µL的A5转移至A4中，充分混匀。
        4. 将40 µL的A4转移至A3，充分混匀。依此操作依次进行至A1。
      2. 三元复合物形成：分析物包含 MZ1 和 Brd4BD2.
        1. 将4 µL溶于100% DMSO的20 µM MZ1加入到含25.5 µM Brd4的196 µL溶液中，配制最高浓度溶液BD2 在无DMSO缓冲液（#B5）中，Brd4的终浓度为25 µMBD2，100 nM MZ1，以及2% DMSO。
        2. 每份加入 160 µL Brd4BD2 在流动缓冲液中以 2 µM 浓度加入左侧接下来的 4 个孔（#B1-B4）
        3. 将40 µL B5转移至B4中，充分混匀。
        4. 将40 µL的B4转移至B3，充分混匀。依此操作依次进行至B1。
    4. 使用单周期模式运行表面等离子共振（SPR）：接触时间：100 秒；解离时间：720 秒；流速：50 µL/min。每次样品检测前注射三次缓冲液，以确保基线稳定。
    5. 数据分析：以缓冲液的第三次注射作为背景进行扣除。阴性对照中，当不存在MZ1时，VHL与Brd4之间的表面等离子共振（SPR）响应BD2 可忽略。当存在MZ1时，动力学拟合表明VHL与MZ1-Brd4之间存在相互作用BD2 复合物具有 k开启 = 7.9 (± 1.5) *107 /毫西门子， k关闭 = 0.014 s-1，以及 KD = 1 nM。图4B)
  3. SPR 法检测 CRBN 与小分子的相互作用
    1. 缓冲液的配制
      1. 配制1 L含有50 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM MgCl的缓冲液2，0.5 mM TCEP，0.005% P20，pH 7.5，并通过0.2 µm滤器过滤。
      2. 移除20 mL缓冲液，并补充20 mL 100% DMSO（最终运行缓冲液中DMSO浓度为2%）。在下述所有样品中（步骤3.3、3.4和3.5），保持DMSO浓度为2%至关重要。
    2. 按照制造商的说明书激活SA芯片，并将CRBN固定至约800 RU。
    3. 在384孔板中，按照3.1.3节所述方法，将化合物进行3倍、6个浓度点的系列稀释，最高浓度为30 µM。
    4. 使用多循环模式进行 SPR 实验：模式：高性能， 接触时间：60 秒，解离时间：90 秒；流速：50 µL/min。对于该系统，三次缓冲液进样足以获得稳定的基线背景。对于其他检测系统，可能需要进行额外的缓冲液进样。
    5. 使用制造商提供的软件进行数据分析。
      注意：稳态分析表明 KD BRD-2512 和 BRD-5110 的结合率均约为 3 µM，但结合水平仅达到约 70% R最大 在最高浓度下发生结合。结合亲和力较弱以及传感器图谱的形状均表明，化合物在高浓度下可能发生不溶。因此，实际的KD 可能高于 3 µM。未结合 CRBN 的 BRD-4761 被用作阴性对照。
  4. SPR 法检测 PPM1D 与小分子的相互作用
    1. 按照步骤 3.3.1 所述配制缓冲液。使用亚氨基二乙酸（NTA）传感器芯片。
    2. 应用单个循环，因为PPM1D弹头具有较慢的反应动力学 k开启 和 k关闭使用制造商默认设置再生NTA芯片，并在每次化合物注射后固定PPM1D至约1000 RU（以5 µL/min流速注射5 µg/mL蛋白溶液）。
    3. 按照3.1.3节所述，将化合物配制成3倍、5个浓度点的系列稀释液，最高浓度为400 nM。
    4. 采用单循环模式运行表面等离子共振（SPR）：模式：高性能；接触时间：90 s；解离时间：600 s；流速：50 µL/min。每次化合物注射前均注入三次缓冲液，以确保基线稳定。
    5. 数据分析。将缓冲液的第三次注射作为背景进行扣除。以BRD-2512作为阴性对照，其不与PPM1D结合。BRD-4761和BRD-5110的动力学拟合结果显示，两者的KD值均为1–2 nM。
  5. SPR 法检测 CRBN:PROTAC:PPM1D 三元复合物
    1. 按照步骤 3.3.1 中所述配制缓冲液。
    2. 按照制造商的说明书激活SA芯片，并将CRBN固定至约35 RU（以5 µL/min流速注入0.5 µg/mL的蛋白质溶液）。
    3. 采用3.2.3步骤中所述方法，配制三种化合物的3倍、6个浓度点的系列稀释液，最高浓度为30 µM，所有样品（包括空白孔）中[PPM1D]浓度均保持为1 µM。
    4. 采用多循环模式运行表面等离子体共振（SPR）：模式：高性能；接触时间：60 秒；解离时间：90 秒；流速：50 µL/min。
    5. 使用制造商提供的软件进行数据分析。
      注意：尽管 BRD-2512 和 BRD-4761 无反应或反应可忽略，BRD-5110 则明显显示出响应 "钩状效应" 在具有快速结合/解离动力学的稳态下（图 5A- C）。BRD-5110 的实验结合响应图5C) 介于模拟预测响应之间，该预测基于假设 KD （CRBN，cpd）为 3 或 10 µM（图 5E)，表明该三元KD 和二元 KD 非常相似。PPM1D: BRD-5110: CRBN 复合物的形成未表现出明显的协同性。

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结果

VHL:MZ1 二元复合物以及 VHL:MZ1:Brd4BD2 三元复合物的表征结果见图2（ITC）、图3（BLI）和图4（SPR），实验使用了非常相似的缓冲体系。从正交实验中获得的KD值具有一致性。协同性可通过KD（二元复合物）/KD（三元复合物）计算得出，结果为高度正值（ITC测得为15，SPR测得为26）。

通过表面等离子体共振（SPR）对CRBN:PROTAC:PPM1D体系进行了表征图5A-D）。为促进三元复合物形成的观察，将CRBN固定至约35 RU水平。单独PROTAC的结合产生了一个信号 <2 RU，低于噪声水平。分析物中的PPM1D在SA芯片表面产生较高的背景信号，可施...

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讨论

对PROTAC分子与其蛋白质结合伙伴之间的二元及三元相互作用进行生物物理表征，相较于广泛使用的细胞系统，可提供独特且互补的见解。了解PROTAC分子每个弹头与其相应蛋白质结合伙伴之间的亲和力，有助于指导药物化学研究，优化这些相互作用。先前发表的三元PROTAC复合物的晶体结构表明，连接链区域的原子可与一个或两个蛋白质结合伙伴形成相互作用16,20。通过实验确定三元复合物形成的协同性，可为连接链的优化提供支持。

本报告描述了三种不同的生物物理技术，这些技术可用于提供有关PROTAC分子与其蛋白质结合伴侣之间结合亲和力的信息。方法1详细介绍了针对PROTAC分子MZ1、VHL E3连接酶复合物以及Brd4的等温滴定 calorimetry（ITC）实验设置BD2 溴结构域。ITC 结果显示 KDMZ1与VHL之间的二元相互作用的解离常数为59 nM，VHL与预混合的MZ1和Brd4之间的三元相互作用的解离常数为4 nM

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披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本工作获得了麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所治疗学发展中心颁发的创新与技术发展奖的支持。作者谨此感谢高级领导团队成员和评审委员会对本工作的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔板Greiner655076平底黑色板，用于BLI实验
96孔板Nunc73520-120用于ITC样品制备的板
96孔板Greiner650101用于制备SPR实验样品的板
Auto iTC200微热量计Malvern Panalytical用于进行ITC实验的仪器。该产品已停产。
Biacore S200Cytiva29136649用于进行SPR实验的仪器
MZ1ProbeChemPC-60099可结合VHL和Brd4BD2的PROTAC
NTA传感器芯片CytivaBR100532用于涉及PPM1D的SPR实验的SPR芯片
Octet Red-384Sartorius用于进行BLI实验的仪器。该产品已停产。
板盖MalvernPQA0001Nunc 96孔板（73520-120）的盖子
板盖Cytiva28975816Greiner板（650101）的板盖
Series S SA传感器芯片CytivaBR100531用于涉及MZ1:VHL:BRD4的SPR实验的SPR芯片
链霉亲和素（SA）浸入式读取生物传感器Sartorius18-509BLI实验中使用的涂层传感器

参考文献

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