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薯蓣皂苷通过抑制B细胞活化缓解IgA肾病 在体实验 并减少半乳糖缺陷型IgA1的产生 体外

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DOI：

10.3791/65719

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2023年10月13日

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1Department of Nephrology, Guanganmen Hospital, 2Department of Nephrology, 906 Hospital of Joint Logistic Support Force of People's Liberation Army (PLA), 3Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提供了使用薯蓣皂苷（Dioscin, DIO）治疗免疫球蛋白A肾病（IgAN）的实验数据，DIO是某些植物中的活性成分 穿山龙 丹参根茎（DNR），以及研究中药作用及其潜在机制的范式 体内 和 体外.

摘要

循环半乳糖缺乏型IgA1（Gd-IgA1）水平升高是由黏膜免疫应答过程中IgA阳性分泌细胞过度活化所致，这是IgA肾病（IgAN）发病机制中的关键环节。派伊尔集合淋巴结（Peyer's patch）是B淋巴细胞转化为IgA分泌型浆细胞的主要部位，也是IgA的主要来源。此外，IgAN患者中核心1β-1,3-半乳糖基转移酶（C1GalT1）及其分子伴侣C1GalT1特异性分子伴侣（Cosmc）表达降低，与IgA1的异常糖基化密切相关。我们的临床经验表明，穿山龙（Dioscoreae Nipponicae Rhizoma, DNR）中药可减轻IgAN患者的蛋白尿和血尿，并改善肾功能。薯蓣皂苷元（Dioscin, DIO）是DNR的主要活性成分之一，具有多种药理活性。本研究旨在探讨DIO治疗IgAN的可能机制。采用黏膜免疫诱导法建立IgAN小鼠模型，将小鼠分为对照组、模型组和DIO灌胃组。通过免疫荧光和免疫组化检测小鼠肾小球IgA沉积、肾脏病理改变以及派伊尔集合淋巴结中B细胞标志物CD20和CXCR5的表达。在脂多糖（LPS）刺激下，采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、实时荧光定量聚合酶链反应（QRT-PCR）和蛋白质印迹法（WB）检测DIO对DAKIKI细胞增殖、IgA和Gd-IgA1分泌以及C1GalT1和Cosmc表达的影响。在 体内 研究显示，在IgAN模型小鼠中，DIO可缓解IgA沉积伴随的肾小球系膜增生，以及派尔集合淋巴结中CD20和CXCR5表达的升高. 体外 研究显示，0.25 µg/mL 至 1.0 µg/mL 的 DIO 可抑制 LPS 诱导的 DAKIKI 细胞增殖、IgA 和 Gd-IgA1 的分泌，并上调 C1GalT1 和 Cosmc 的 mRNA 及蛋白表达。本研究表明，DIO 可能通过抑制 IgA 分泌细胞的过度活化以及上调 C1GALT1/Cosmc 表达，从而减少 Gd-IgA1 的生成。

引言

IgA肾病（IgAN）是最常见的原发性肾小球肾炎类型，目前尚无特异性治疗方法，仍是终末期肾病的重要病因1尽管IgAN的发病机制尚未完全阐明，但 "多击假说" 被广泛接受，并得到大量临床和实验研究证据的支持2IgAN 的发病机制涉及激活 B 细胞并产生半乳糖缺乏的 IgA1（Gd-IgA1）3由于黏膜免疫反应过程中分泌IgA的细胞过度增殖和活化，导致循环中Gd-IgA1水平升高，这是IgA肾病发病机制中的关键环节。4,5,6作为B淋巴细胞增殖、活化及表型转化为IgA分泌细胞的主要场所，派伊尔集合淋巴结是IgA分泌的主要来源，与IgA肾病的发生和发展密切相关7,8此外，IgA1分泌细胞的增殖以及核心1β-1,3-半乳糖基转移酶（C1GalT1）和C1GalT1特异性分子伴侣（Cosmc）的表达，与IgA1的异常糖基化相关，从而导致IgA肾病患者产生半乳糖缺陷型IgA1（GD-IgA1）6,9.

近年来，中药治疗IgA肾病（IgAN）的临床研究取得了进展。益气清解方是中国中医科学院广安门医院肾病科治疗IgAN的核心方剂。本课题组前期研究发现，IgAN患者经益气清解方治疗后，血清中半乳糖缺陷型IgA1（Gd-IgA1）水平下降。穿山龙（Dioscoreae Nipponicae Rhizoma, DNR）是益气清解方中最常用的药材之一，为穿龙薯蓣（Dioscorea Nipponica Makino）的干燥根茎，具有调节免疫、抑制炎症、止咳平喘等多种药理作用10,11。多位学者应用穿山龙治疗IgAN并取得了良好疗效12,13,14。薯蓣皂苷元（Dioscin, DIO）是穿山龙的主要活性成分15，具有降低尿酸、抑制纤维化、抑制炎症反应及抗氧化应激等作用16,17。因此，DIO可能通过抑制细胞过度分泌Gd-IgA1，发挥特异性的肾脏保护作用，但目前尚未见关于DIO治疗IgAN作用机制的研究报道。

为探究DIO对IgAN的潜在治疗机制，并为IgAN的治疗提供新方法，我们开展了DIO对IgAN治疗作用的实验研究 体内 和 体外.

方案

广安门医院伦理委员会批准了本实验（动物实验伦理批准编号：IACUC-GAMH-2023-003）。

1. 实验操作前小鼠的准备

  1. 在医院/研究中心的动物实验设施中饲养22只SPF级雄性Balb/c小鼠（6-7周龄，体重20-25 g），采用随机数字表法将动物分为对照组（n = 8）和模型组（n = 14）。
  2. 在实验室笼具中适应性饲养1周后，根据Zou等人的建模方案18，给予模型组（IgAN组）含6 mmol/L HCl的酸化水中添加0.1%牛γ球蛋白（BGG）的溶液，连续饮用9周。
  3. 在继续饮用BGG溶液的同时，连续3天每天经尾静脉注射0.1 mL生理盐水中含0.1% BGG的溶液，以建立IgA肾病实验小鼠模型18。
  4. 对照组小鼠自由饮用不含BGG的6 mmol/L HCl酸化水，持续9周；同时连续3天经尾静脉注射等体积的生理盐水。
    注：对照组与模型组均饲喂相同质量的常规饲料。
  5. 尾静脉注射结束后，随机选取对照组和模型组各2只小鼠，检测蛋白尿，并进行光镜检查和免疫荧光分析，以确认建模是否成功。
    注：实验期间不禁食，但不禁水；需记录尿量。
  6. 使用代谢笼收集24小时尿液，以400 × g 离心5分钟，弃去尿沉渣；上清液稀释10倍后，采用尿蛋白检测试剂盒测定尿蛋白浓度，再乘以稀释倍数和尿液体积，计算24小时总尿蛋白量。
    注：光镜和免疫荧光检测方法分别见第3和第4节。
  7. 建模成功后，将模型组中12只小鼠采用随机数字表法均分为两组，每组6只，分别为模型组（IgAN组）和DIO灌胃组（DIO组）。
  8. 对照组继续饮用不含BGG的6 mmol/L HCl酸化水，模型组继续饮用含0.1% BGG的6 mmol/L HCl酸化水。根据药理学实验方法中的剂量换算公式（按70 kg人体重换算）19，计算DIO组灌胃给药剂量，每日一次，给予DIO片剂0.06 g/kg，连续灌胃8周。
  9. 灌胃8周后，采用0.4%戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，通过足趾夹捏法确认麻醉效果后，分离肾脏和派伊尔集合淋巴结（Peyer's patch），用于后续光镜和免疫组织化学分析。
    注：体内模型实验方案见补充 图1。

2. 组织学分析

  1. 肾脏和派尔集合淋巴结的石蜡切片
    1. 用4%多聚甲醛固定3 mm厚的肾组织或1个派尔集合淋巴结，持续24 h，随后用梯度乙醇和二甲苯进行脱水。浸蜡2 h，封片后冷冻保存。
    2. 切取2 µm厚的肾组织切片和4 µm厚的派尔集合淋巴结切片，并将其展于温水中。用洁净的载玻片捞起展开的切片，在40 °C恒温烘箱中烘烤1 h。标本预处理完成后开始染色。
      注意：取肾门部冠状面组织，组织块厚度为3 mm。
  2. 在室温（RT）下用过碘酸溶液对石蜡切片进行脱蜡并染色10 min，避光操作。用蒸馏水冲洗后，用希夫（Schiff）染色液染色20–30 min，避光。再用蒸馏水冲洗，直至显微镜下观察切片呈红色为止。
  3. 将切片置于苏木精染色液中，染核3 min（若细胞核着色过深，可用盐酸乙醇分化），然后用流水冲洗至载玻片无色。
  4. 依次使用梯度乙醇和二甲苯进行常规脱水，用中性树胶封片，显微镜下观察。PAS阳性呈红色，细胞核呈蓝色。

3. Peyer斑的免疫组织化学分析

  1. 按照步骤 2.1 所述制备派伊尔集合淋巴结的石蜡切片。
    注意：免疫组织化学及后续免疫荧光所用切片的厚度为 4 µm。
  2. 脱蜡石蜡切片：
    1. 将切片依次放入二甲苯 I 中 5 分钟、二甲苯 II 中 5 分钟、二甲苯 III 中 5 分钟。
    2. 随后将切片在无水乙醇 I 中冲洗 5 分钟、无水乙醇 II 中冲洗 5 分钟、85% 酒精中冲洗 5 分钟、75% 酒精中冲洗 5 分钟，然后用蒸馏水冲洗切片。
  3. 抗原修复：
    1. 配制 50 倍浓缩的柠檬酸钠溶液，并用蒸馏水稀释至 1 倍使用浓度。在高压灭菌器中加热 2 分钟，然后将切片放入高压灭菌器中，确保液面高于切片水平。
    2. 高温加热 5 分钟后，让切片自然冷却。用 PBS 溶液清洗切片三次，每次 5 分钟。
  4. 内源性过氧化物酶封闭：使用免疫组织化学笔在组织周围画出圆形边界。在室温下用 3% 过氧化氢溶液孵育切片 15 分钟，避光操作，然后用 PBS 溶液清洗切片三次，每次 5 分钟。
  5. 血清封闭：在已标记的组织切片上滴加 10% 山羊血清，在室温下封闭 30 分钟。确保切片被染色液均匀覆盖。
  6. 一抗孵育：轻轻甩去封闭液，向切片上加入适量已配制的一抗（CD20 [1:800]；CXCR5 [1:800]）。将切片平放于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育。
    注意：在湿盒中加入少量水，以防止抗体蒸发。
  7. 二抗孵育：用 PBS 溶液清洗切片三次，每次 5 分钟。甩去 PBS，使切片干燥后，在组织上滴加一滴对应一抗物种的二抗（HRP 标记），室温孵育 50 分钟。
  8. 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色：用 PBS 溶液清洗切片三次，每次 5 分钟。甩干切片后，滴加新鲜配制的 DAB 显色液。在显微镜下观察显色时间，阳性信号呈棕黄色。用自来水冲洗以终止显色反应。
  9. 细胞核染色：用苏木精复染约 1 分钟，用自来水冲洗，再用自来水冲洗 10 分钟以返蓝。
  10. 脱水与封片：
    1. 将切片依次放入 75% 酒精中 5 分钟、85% 酒精中 5 分钟；再放入无水乙醇 I 中 5 分钟、无水乙醇 II 中 5 分钟、无水乙醇 III 中 5 分钟。
    2. 将切片在二甲苯 I 中洗涤 5 分钟，取出稍晾干后用中性树胶封片。
  11. 图像采集：通过显微镜检查采集图像，并使用 Halo 软件进行组织全视野图像分析。
    注意：苏木精染色的细胞核呈蓝色，DAB 阳性表达呈棕黄色。

4. 肾脏IgA免疫荧光

  1. 按照步骤 2.1 所述方法制备肾脏的石蜡切片。
  2. 脱蜡石蜡切片：
    1. 将切片依次放入二甲苯 I 中 5 分钟、二甲苯 II 中 5 分钟、二甲苯 III 中 5 分钟；随后依次在无水乙醇 I、无水乙醇 II、95% 乙醇、90% 乙醇、80% 乙醇、70% 乙醇和 50% 乙醇中各处理 5 分钟，最后用蒸馏水洗涤。
  3. 蛋白酶 K 抗原修复：轻轻甩干切片，用组织化学笔在组织周围画圈，然后滴加蛋白酶 K 工作液（储存液与 PBS 按 1:9 比例配制），覆盖组织，37 °C 孵育 30 分钟。随后用 PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。
  4. 细胞膜通透处理：轻轻甩干切片，滴加 0.1% Triton 覆盖切片，室温孵育 20 分钟，再用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 封闭：滴加 10% 山羊血清，均匀覆盖组织，室温封闭 30 分钟。
  6. 一抗孵育：滴加适量山羊抗小鼠 AF488 标记的 IgA 抗体（1:500），均匀覆盖组织，4 °C 过夜孵育。
  7. 细胞核染色：用 PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。吸去 PBS 后，滴加 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液，室温避光孵育 15 分钟。
  8. 洗涤与封片：用 PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟，然后用抗荧光淬灭封片剂封片。
  9. 显微镜观察与拍照：在荧光显微镜下观察切片并采集图像。
    注：DAPI 的激发波长为 330–380 nm，发射波长为 420 nm，呈蓝光；异硫氰酸荧光素（FITC）的激发波长为 465–495 nm，发射波长为 515–555 nm，呈绿光。

5. 细胞培养

  1. 从美国 ATCC 获取人 B 淋巴细胞系 DAKIKI。使用添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI-1640 培养基培养 DAKIKI 细胞。
  2. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养，每 2–3 天传代一次。所有实验均使用处于对数生长期的细胞。
  3. 当细胞融合度达到 70%–80% 时，用无菌移液管收集细胞，在 140 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞，24 小时后使所有细胞进入静止期，以用于后续处理。

6. 用于筛选DIO在正常DAKIKI细胞中安全浓度的LDH细胞毒性检测

  1. 将DAKIKI细胞以4×105个细胞/孔的密度接种于96孔板中，设置低对照组、高对照组以及不同浓度的DIO（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 µg/mL）。根据分组方法进行相应处理后，在5% CO2、37 °C培养箱中孵育24小时。
  2. 按照细胞毒性检测试剂盒说明书操作，向高对照组每孔加入5 µL裂解液，然后将培养板置于5% CO2、37 °C培养箱中孵育15分钟。
  3. 取出培养板，向每孔加入100 µL反应混合液，在室温避光孵育10分钟，随后加入50 µL终止液。尽快在酶标仪上测定490 nm处的OD值。
  4. 根据公式计算不同浓度DIO的LDH释放率，并将≤10%作为最大给药剂量：LDH释放率 =（实验孔LDH - 低对照孔LDH）/（高对照孔LDH - 低对照孔LDH）× 100%。

7. 使用CCK-8法检测DIO对DAKIKI细胞增殖的影响

  1. 根据我们先前实验的结果20，使用40 µg/mL的LPS诱导DAKIKI细胞，建立IgAN模型。
  2. 然后将4×105个细胞/孔接种于96孔板中，并分为对照组、模型组以及DIO低、中、高浓度组（0.25 µg/mL、0.5 µg/mL和1.0 µg/mL）。将培养板置于5% CO2、37 °C培养箱中孵育24小时。
  3. 随后向每孔加入20 µL CCK-8试剂，将培养板重新放入培养箱（5% CO2、37 °C）中孵育2小时。孵育结束后，尽快在酶标仪上检测450 nm波长处的吸光度（OD值）。

8. ELISA 法检测 DIO 对 DAKIKI 细胞分泌 IgA 及 Gd-IgA1 的影响

  1. 以每孔6×106个细胞的密度将DAKIKI细胞接种于6孔板中，按照步骤7.2分组并处理细胞。培养24小时后，在4 °C条件下以850 × g离心10分钟，收集上清液。
  2. 根据试剂盒说明书检测IgA和Gd-IgA1的浓度。

9. 通过qRT-PCR检测DIO对DAKIKI细胞中C1GALT1和Cosmc mRNA水平的影响

  1. 将DAKIKI细胞以6×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中，分组并按照7.2步骤中CCK8所述方法处理细胞，于37°C孵育24小时。根据总RNA提取试剂盒说明书提取DAKIKI细胞的总RNA。
  2. 取各组样品提取的RNA 1 µL，测定其浓度后，按照试剂盒说明书将每份样品中的1 µg总RNA进行逆转录合成cDNA。
  3. 随后进行RT-PCR扩增以检测各基因的表达水平（95 °C预变性15 min，95 °C变性10 s，60 °C退火延伸30 s）。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算各基因的相对表达水平。
    注意：引物序列如下：
    C1GALT1：5'-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3'，5'-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3'；
    Cosmc：5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3'，5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3'；
    β-actin：5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3'，5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'。

10. 蛋白质印迹法检测DIO对DAKIKI细胞中C1GALT1和Cosmc蛋白表达的影响

  1. 将DAKIKI细胞以6×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中。按照步骤7.2所述分组并进行处理。孵育24小时后，收集各组细胞。
  2. 加入适量细胞裂解液（PMSF : 磷酸酶抑制剂 : RIPA裂解液 = 1:1:100），冰上孵育30分钟。然后在4 °C下以13,500 × g 离心10分钟，收集上清液。
  3. 使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。
  4. 按4:1的比例将蛋白样品与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合，涡旋混匀后于100 °C加热5分钟以使蛋白变性。
  5. 为检测不同分子量的蛋白，将蛋白Marker（5 µL/孔）和样品（20 µg/孔）分别加入12% SDS-PAGE凝胶的不同泳道，进行SDS-PAGE电泳，随后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。
  6. 用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜2小时，然后加入相应的一抗（C1GALT1 [1:1000]，Cosmc [1:2000]）孵育24小时。以β-actin抗体（1:100000）作为内参对照。
  7. 用1×Tris-缓冲盐水含0.1% Tween 20（TBST）洗涤聚偏二氟乙烯（PVDF）膜3次，每次10分钟，随后在室温下加入相应的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（1:10000）孵育2小时。
  8. 再次用TBST洗涤膜（每次10分钟，共3次），然后加入适量增强型化学发光（ECL）工作液（按制造商说明配制），用于蛋白条带检测。
  9. 使用化学发光成像系统采集图像，并利用Image J图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行半定量分析。

11. 统计分析

  1. 使用适当的软件应用程序分析数据。所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示，并通过单因素方差分析（one-way ANOVA）对多组样本进行比较。
    注意：统计分析采用 SPSS 26.0 统计软件。当方差齐时，组间两两比较采用 LSD 法；当方差不齐时，组间两两比较采用 Dunnett T3 法。P<0.05 被认为具有统计学显著性差异。

结果

DIO对IgAN小鼠模型肾组织的影响

与对照组相比，黏膜免疫诱导的IgAN小鼠模型（模型组）的蛋白尿显著增加（补充材料 图2)，IgA 沉积可见于系膜区，荧光在整个系膜区呈均匀的团块状分布 (图1A)，肾组织PAS染色显示系膜细胞增生和间质增殖 (图1B)，而在DIO灌胃组（DIO组）中有所降低。

饮食诱导肥胖对派伊尔集合淋巴结中B淋巴细胞的影响

派伊尔集合淋巴结是B淋巴细胞转化为分泌IgA细胞的主要部位。本研究以派伊尔集合淋巴结为研究对象，通过检测B细胞标志物CD20和CXCR5的表达，观察DIO对B淋巴细胞的影响。免疫组化结果显示，与对照组相比，模型组中CD20和CXCR5的表达显著升高。DIO可抑制上述分子标志物的表达（图2A，B）。

DIO 对 DAKIKI 细胞的安全浓度范围

乳酸脱氢酶（LDH）是质膜完整性的标志物，也是细胞死亡的指标，LDH释放率越高，表明细胞损伤越严重。采用LDH释放实验确定DIO的安全浓度范围，以LDH释放率低于10%作为判定DIO最大安全浓度的标准。结果（图3）显示，DIO在0.25至1.0 µg/mL浓度范围内未引起显著的细胞毒性。因此，后续研究选用0.25、0.5和1.0 µg/mL的DIO作为给药剂量。

DIO对DAKIKI细胞增殖的影响

实验结果（图4）显示，与模型组（LPS刺激组）相比，DIO以浓度依赖的方式抑制LPS诱导的DAKIKI细胞增殖。在0.5和1.0 µg/mL浓度下，DIO显著抑制了LPS诱导的DAKIKI细胞增殖（P < 0.01）。

DIO对DAKIKI细胞分泌功能的影响

Gd-IgA1 水平与 IgAN 的病理过程密切相关，同时检测总 IgA 作为细胞分泌功能的指标。采用 ELISA 法检测 DAKIKI 细胞培养上清液中 IgA 和 Gd-IgA1 的含量。结果显示（图 5A、B），与对照组相比，经 LPS 刺激的 DAKIKI 细胞分泌的 IgA 显著增多（P < 0.01）。相比之下，DIO 以浓度依赖的方式显著抑制 DAKIKI 细胞分泌 IgA（P < 0.01）。与对照组相比，经 LPS 刺激的 DAKIKI 细胞分泌的 Gd-IgA1 呈上升趋势，具有统计学上的倾向性（P < 0.10）；而 DIO 以浓度依赖的方式抑制 LPS 刺激的 DAKIKI 细胞分泌 Gd-IgA1（P < 0.05 和 P < 0.01），其中 1.0 µg/mL 的 DIO 对 Gd-IgA1 分泌的抑制率可达 25%，抑制作用显著。

DIO 抑制 DAKIKI 细胞分泌 Gd-IgA1 的机制

为进一步探究DIO抑制DAKIKI细胞过度分泌Gd-IgA1的可能机制，采用qRT-PCR检测DAKIKI细胞中糖基转移酶C1GALT1及其分子伴侣蛋白Cosmc mRNA的表达水平。结果显示（图6A，B），与对照组相比，模型组DAKIKI细胞中C1GALT1和Cosmc的相对mRNA表达水平显著下调（P < 0.01）。与模型组相比，DIO以不同幅度上调了C1GALT1和Cosmc的相对mRNA表达水平，其中1.0 µg/mL DIO显著上调了C1GALT1和Cosmc的相对mRNA表达（P < 0.05）。

同时，采用WB方法检测DIO对DAKIKI细胞中C1GALT1和Cosmc蛋白表达的影响。与对照组相比，模型组DAKIKI细胞中C1GALT1和Cosmc的蛋白表达明显降低（P < 0.05）。与模型组相比，经DIO干预后，C1GALT1和Cosmc的蛋白表达上调。当DIO浓度为1.0 µg/mL时，C1GALT1和Cosmc的蛋白表达显著上调（P < 0.05）（图7A-C）。


图1：肾脏的组织病理学分析。（A）免疫荧光显微镜图像。各组小鼠肾脏切片使用抗IgA抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色。上方图像比例尺 = 200 μm，下方图像比例尺 = 50 μm。每组 n = 6。（B）对照组、模型组和DIO组小鼠肾脏组织PAS染色的代表性图像。比例尺 = 30 μm。向下的箭头指示系膜细胞，向上的箭头指示间质。比例尺 = 30 μm。每组 n = 6。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学切片比较；对照组、模型组、DIO；显微照片；组织结构分析。
图2：DIO对B淋巴细胞标志物的影响。（A）派伊尔集合淋巴结中CD20的表达。比例尺 = 200 μm。每组n = 6。（B）派伊尔集合淋巴结中CXCR5的表达。比例尺位于图像右下角。比例尺 = 200 μm。每组n = 6。请点击此处查看该图的放大版本。

LDH释放率（%）柱状图，显示DIO浓度从0.25到8.0 µg/mL的剂量依赖性效应。
图3。DIO对DAKIKI细胞安全浓度的筛选。 统计值表示为三次独立实验的均值±标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示LPS+DIO处理在450 nm处OD值的柱状图，表明显著的数据比较。
图4。不同浓度的DIO对DAKIKI细胞增殖的影响。 数据以均值±标准差表示。与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；所有实验结果均重复三次。 请点击此处查看该图的放大版本。

比较上清液中IgA和GD-βA1浓度的柱状图；LPS+DIO剂量反应分析。
图5。DIO抑制DAKIKI细胞分泌IgA和Gd-IgA1。 （A）ELISA法检测各组IgA的表达水平。（B）ELISA法检测各组Gd-IgA1的表达水平。数据以均值±标准差表示。与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；所有实验结果均重复三次。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示LPS和DIO处理下C1GALT1、Gosr2的mRNA表达量的柱状图；统计结果。
图6。DIO抑制DAKIKI细胞过度分泌Gd-IgA1的作用机制。（A）qRT-PCR检测C1GALT1的mRNA表达水平。（B）qRT-PCR检测Cosmc的mRNA表达水平。数据以均值±标准差表示。与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；所有实验结果均重复三次。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质表达分析；Western blot 和柱状图；C1GALT1、Cosmc 蛋白；相对表达量。
图7。DIO 影响 DAKIKI 细胞中 C1GALT1 和 Cosmc 的蛋白质表达。（A）WB 验证了 DIO 对 C1GALT1 和 Cosmc 蛋白表达的上调作用。（B）使用 Image J 对 C1GALT1 表达进行半定量分析。（C）使用 Image J 对 Cosmc 表达进行半定量分析。数据以均值 ± 标准差表示。与对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；所有实验结果均重复三次。请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料 图1示意图如图所示 体内 模型 请点击此处下载该图片。

补充 图2．蛋白尿的变化。 数据以均值 ± 标准差表示；每组 n = 6。请点击此处下载该图。

讨论

IgAN 的典型病理特征是含有 IgA1 和 GD-IgA1 的免疫复合物在肾小球系膜区沉积21,22减少免疫复合物的形成可减轻肾损伤，并缓解IgAN的临床症状。在一项 体内 实验中，我们研究了DIO对IgA肾病（IgAN）的治疗作用，发现DIO可减少IgAN模型小鼠肾脏中的IgA沉积。结果表明，肾脏中IgA分泌细胞的积聚与IgAN的发病机制相关23作为B淋巴细胞增殖和活化的重要部位，派伊尔集合淋巴结是分泌IgA细胞的重要来源。因此，我们检测了派伊尔集合淋巴结中B淋巴细胞标志物（CD20、CXCR5）的表达，发现DIO可抑制IgAN小鼠模型派伊尔集合淋巴结中B淋巴细胞的表达。这些实验结果为将DIO应用于IgAN的治疗提供了依据。

我们进行了以下实验 体外 为进一步研究DIO对IgA肾病的作用机制，首先已证实DAKIKI是一种EB病毒永生化的B细胞系，可分泌IgA1，其中部分为糖基化缺陷型IgA1（GD-IgA1）24，是理想的 体外 研究该药物在IgAN中作用机制。我们选择DAKIKI细胞来探究DIO治疗IgAN的分子机制。此外，黏膜炎症免疫反应在IgAN的发病机制中起着关键作用。如上所述，我们使用LPS刺激DAKIKI细胞，可使其释放促炎因子并介导炎症反应，从而更好地模拟IgAN中黏膜免疫反应的机制。 体外 细胞模型可能有助于探究其他药物治疗IgA肾病的可能性及作用机制。结果显示，DIO以浓度依赖的方式抑制脂多糖（LPS）刺激的DAKIKI细胞增殖。DIO可抑制LPS刺激所致的DAKIKI细胞IgA和半乳糖缺陷型IgA1（Gd-IgA1）的分泌，并上调DAKIKI细胞中C1GalT1及其分子伴侣Cosmc的mRNA和蛋白表达水平，提示DIO可通过上调C1GALT1/Cosmc的表达，减少Gd-IgA1的分泌，从而抑制DAKIKI细胞的过度活化。

在实验过程中应注意关键步骤。DAKIKI 细胞上清液中 Gd-IgA1 的浓度超出 ELISA 试剂盒的检测范围（1.56~100 ng/mL），因此收集的上清液必须通过超滤管离心以获得浓缩的 Gd-IgA1。同时，确保每组起始的上清液体积相同，并且超滤后获得的浓缩液体积也保持一致。

在本研究中，我们同时采用了两种方法 体外 和 体内 方法可同时发挥作用，在药理效应上相互支持，为研究中药的作用及其机制提供了范例。本实验方案中仍有一些方面可以改进。首先，我们未检测小鼠DIO灌胃组的血药浓度，因此未使用与血液浓度相当的DIO浓度 体外 实验。其次，本研究仅探讨了DNR中的活性成分——DIO单体；DNR中其他组分对IgA肾病的影响仍需进一步研究。

综上所述，本研究为使用DNR的活性成分DIO治疗IgAN提供了实验依据。本研究通过模拟IgAN的黏膜免疫反应，建立了IgAN的细胞病理学模型 体外 和 体内为研究中医药防治IgA肾病提供了新思路。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81973675）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗CD20/MS4A1抗体Boster Biotechnology CompanyA03780-3
抗荧光淬灭封片剂Beyotime, Shanghai, ChinaP0128S
Balb/c小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司110322220101424000
封闭血清索莱宝，北京，中国SL038
牛γ球蛋白上海源叶生物科技有限公司S12031
C1GALT1多克隆抗体Proteintech Group, Inc,USA27569-1-AP
柠檬酸抗原修复液(50×)菲吉乐生物技术有限公司PH0422
COSMC多克隆抗体Proteintech Group, Inc,USA19254-1-AP
细胞毒性检测试剂盒罗氏公司4744926001
Dako REAL EnVision检测系统，辣根过氧化物酶/DAB+DakoK5007
DAPIInvitrogenD1306
薯蓣皂苷中国食品药品检定研究院111707-201703
DIO片剂成都第一制药有限公司H51023866
ECL工作液默克生物科技有限公司WBKLS0100 
增强型细胞计数试剂盒-8Beyotime, Shanghai, ChinaC0043
Fasking一步法基因cDNA第一链合成预混液天根，北京，中国KR118-02
糖原过碘酸雪夫（PAS）染色试剂盒 巴索生物技术有限公司BA4080A
山羊抗小鼠IgA-AF488SouthernBiotech1040-30
山羊抗兔IgG抗体（H+L），HRP标记北京博奥森生物技术有限公司BS-0295G-HRP
人Gd-IgA1 ELISA试剂盒IBL27600
人IgA ELISA试剂盒联科生物（MultiSciences）70-EK174-96
Pierce BCA蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23227
PMSF溶液Beyotime, Shanghai, ChinaST507
蛋白酶K 菲吉乐生物技术有限公司PH1521
兔抗CXCR5多克隆抗体 北京博奥森生物技术有限公司bs-23570R
RIPA裂解缓冲液Beyotime, Shanghai, ChinaP0013B
RNAsimple总RNA提取试剂盒天根，北京，中国DP419
RPMI 1640培养基索莱宝，北京，中国31800
Super-Bradford蛋白检测试剂盒康为世纪，北京，中国CW0013
吐温 X-100Beyotime, Shanghai, ChinaST795
β-肌动蛋白兔单克隆抗体Abclonal, 武汉, 中国AC026

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DAKIKI C1GalT1 Cosmc

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