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将重组RCAS(A)逆转录病毒微量注射至鸡胚晶状体

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DOI：

10.3791/65727

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2023年9月1日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

本文内容

摘要

本方案论文描述了利用RCAS(A)逆转录病毒对鸡胚晶状体进行显微注射的方法，作为一种研究工具 原位 晶状体发育过程中蛋白质的功能与表达

摘要

鸡胚胎（Gallus domesticus) 是研究晶状体发育和生理功能的成熟动物模型，因其与人类晶状体具有高度相似性。RCAS(A) 是一种具有复制能力的鸡逆转录病毒，可感染分裂中的细胞，是研究该领域的有力工具 原位 通过在发育早期阶段将野生型和突变型蛋白的表达载体显微注射至晶状体泡空腔内，使其作用局限于周围增殖的晶状体细胞，从而研究这些蛋白在晶状体发育过程中的表达与功能。与其他方法（如转基因模型）相比， 离体 培养物中，使用复制能力型禽类逆转录病毒RCAS(A)可提供一种高效、快速且可定制的系统，用于在鸡胚中表达外源蛋白。具体而言，靶向基因转移可局限于增殖性晶状体纤维细胞，而无需使用组织特异性启动子。本文将简要概述重组逆转录病毒RCAS(A)的制备步骤，详细全面地介绍显微注射操作流程，并提供该技术的示例结果。

引言

本实验方案旨在描述将RCAS(A)（复制型禽类肉瘤/白血病A型逆转录病毒）微注射至鸡胚晶状体的方法。在鸡胚晶状体中实现高效的逆转录病毒递送已被证明是研究晶状体发育与相关疾病机制的一种有力工具。 体内 研究晶状体蛋白在正常晶状体生理、病理状态及发育过程中的分子机制与结构-功能关系。此外，该实验模型可用于鉴定治疗靶点，并筛选治疗人类先天性白内障等疾病的药物。总体而言，本方案旨在提供一系列必要步骤，以建立一个可定制的平台，用于晶状体蛋白的研究。

胚胎期小鸡（Gallus domesticus由于其晶状体结构和功能与人类晶状体相似，是研究晶状体发育和生理学的成熟动物模型1,2,3,4使用复制能力型禽类逆转录病毒RCAS(A)已被认为是在鸡胚中表达外源蛋白的一种高效、快速且可定制的系统。值得注意的是，该系统能够将目标基因的转移特异性地限制在增殖性晶状体纤维细胞中，而无需使用组织特异性启动子，其原理在于利用胚胎发育的独特时间窗口：在此期间，晶状体腔为空腔状态，允许病毒进入 原位 在限定部位进行RCAS(A)显微注射以在增殖性晶状体纤维细胞中表达外源蛋白5,6,7,8.

本文详细描述的鸡胚显微注射操作方法，最初部分基于 Fekete 等人6 的研究，并由 Jiang 等人8 进一步完善，已被用作将病毒性和非病毒性质粒导入鸡胚晶状体的有效手段1,9,10,11,12,13。总体而言，既往研究已证实该方法在研究晶状体发育、细胞分化、细胞间通讯及疾病进展方面具有重要潜力，同时也可用于白内障等晶状体病理状况的治疗靶点发现与验证。

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方案

本研究严格遵守《动物福利法》及《动物福利条例实施细则》，并遵循《实验动物照护与使用指南》中的原则进行。所有动物实验程序均经位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准。有关本实验方案的概览，请参见图1；本方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

鸡晶状体显微注射示意图；DNA克隆、转染、病毒载体流程、实验设置。
图1：实验流程示意图。1. 本实验方案的第一步是确定特定靶蛋白，鉴定其相关基因序列，并生成DNA片段。2. 将基因序列首先克隆至衔接载体，3. 再亚克隆至逆转录病毒载体。4. 利用包装细胞制备高滴度病毒颗粒，并进行收集与浓缩。5. 最后一步，也是本实验方案的重点，是将RCAS(A)病毒颗粒显微注射至鸡晶状体腔内。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 高滴度重组逆转录病毒的制备

  1. 聚合酶链式反应（PCR）以制备目标蛋白的DNA片段
    注意：本步骤旨在扩增与目标晶状体蛋白相对应的DNA序列。更多细节请参见7,8。
    1. 根据感兴趣蛋白设计PCR引物，以制备其羧基末端与FLAG表位序列（5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'）同框或不含该序列的DNA片段，并包含终止密码子及位于CLa12NCO载体多克隆位点区域内的限制性内切酶识别位点（例如 EcoRI），具体设计应遵循已发表文献中的说明，并确保引物序列包含适当的限制性内切酶识别序列1,7,8,10,11。
    2. 进行PCR反应10。将100 pmol的正向与反向设计引物与0.5 µg连接蛋白cDNA（如Cx50、Cx43或嵌合体Cx50*43L组合）加入所选的PCR反应缓冲液中。进行30个循环，每个循环包括94 °C变性1分钟、58 °C退火1分钟、72 °C延伸1分钟，最后在72 °C下进行10分钟的终末延伸。
    3. 使用凝胶纯化试剂盒分离并纯化PCR产物。
    4. 根据制造商说明书，使用所选的限制性内切酶对纯化的PCR产物进行酶切消化。
  2. 将DNA插入片段克隆至衔接质粒
    注意：将DNA片段插入衔接载体可避免使用辅助细胞/病毒以提高RCAS(A)载体的稳定性14。更多细节请参见7,8。
    1. 通过黏性末端连接反应将DNA片段亚克隆至衔接质粒Cla12NCO中。将PCR片段与限制性内切酶处理后的Cla12NCO以2-5:1的比例混合，进行连接反应，并将连接产物转化至感受态细胞中。
    2. 使用DNA提取试剂盒提取质粒DNA。
    3. 对DNA进行测序以确认序列准确性。
  3. 将DNA克隆至RCAS(A)病毒载体
    注意：将DNA片段插入载体（RCAS(A)逆转录病毒）中，用于在发育中的鸡胚细胞中稳定转导目标基因14,15。更多细节请参见7,8,15。
    1. 使用ClaI（每1 µg DNA使用1单位酶）对含有目标Cla12NCO-DNA片段的载体进行酶切，并通过凝胶电泳分离回收目标片段。
    2. 将DNA片段亚克隆至经ClaI线性化的RCAS(A)质粒中。使用限制性内切酶SalI以区分RCAS(A)质粒上的ClaI位点。
    3. 通过ClaI和SalI双酶切消化，确认插入片段在重组质粒中的正确方向。
    4. 使用DNA提取试剂盒提取质粒DNA。
    5. 测定DNA浓度。
  4. 鸡胚成纤维细胞（CEF）的转染及RCAS(A)病毒收获
    注意：使用病毒包装细胞（即CEF细胞）以获得/收集含有病毒颗粒的细胞培养上清液15,16。更多细节请参见7,8,15。
    1. 根据制造商说明书，使用转染试剂将重组逆转录病毒DNA构建体转染至CEF细胞中。
    2. 对转染后的细胞进行Western印迹分析，检测目标蛋白的表达情况。
    3. 当转染细胞达到汇合状态时，开始收集上清液，适当处理/过滤（使用0.22 µm滤膜去除细胞碎片），并于-80 °C保存，待浓缩使用。
  5. 病毒储备液的浓缩与滴度测定
    注意：含有病毒颗粒的细胞培养上清液及沉淀需进行过滤处理。此外，必须进行病毒滴度测定，以确定病毒对宿主细胞的感染能力。更多细节请参见6,7,8,15。
    1. 解冻含有病毒颗粒的培养上清液。
    2. 在4 °C条件下，以72,000 × g离心2小时。
    3. 弃去上清液，用残留液体（约50 µL）重悬病毒沉淀，并分装为约10 µL的病毒储备液，于-80 °C保存备用。
    4. 进行滴度测定时，使用QT-6细胞或CEF细胞，以系列稀释的病毒储备液进行细胞转染。
    5. 细胞达到汇合状态后，使用4%甲醛固定细胞。
    6. 通过免疫染色检测病毒gag蛋白，或进行碱性磷酸酶组织化学染色，以获得病毒滴度，定义为每毫升中的集落形成单位（CFU/mL）。

静态平衡设备示意图：A）力学测试仪装置；B）储存柜；C）用于材料分析的显微镜及测试工作站。
图 2：鸡胚晶状体显微注射所用仪器与装置。（A）P-30 手动垂直式微电极/微量移液器拉制仪。图中（1）为放大图，显示正在被拉制的玻璃微量移液器。（B）（2）卵孵化箱。将鸡卵置于 37 °C 孵化箱中孵育约 65–68 小时，以达到第 18 发育阶段（具有封闭且中空的中央腔），用于逆转录病毒感染注射。（C）显微注射装置。（3）照明设备，（4）Pico-Injector 微注射仪，（5）解剖显微镜，（6）Drummond 微操纵器，（7）用于成像的计算机/摄像头。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 鸡晶状体显微注射

  1. 准备实验用品
    1. 显微注射用玻璃微量移液管的制备17
      ​注意：使用玻璃毛细管制作显微注射用玻璃微量移液管，其尖端开口外径（OD）约为 11 µm。装置示意图见图 2A。
      1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管固定在手动垂直拉针仪的橡胶缓冲夹中。
      2. 设定加热温度（HEAT 1）为 950 °C，进行预拉制，以获得更细更软的玻璃毛细管。
      3. 设定加热温度（HEAT 2）为 790 °C，进行二次拉制，形成最终的微量移液管。
      4. 使用微量移液管研磨仪将尖端开口研磨至外径（OD）约为 11 µm。
      5. 为后续实验使用，将玻璃微量移液管保存在玻璃瓶内的海绵夹片中。
    2. 受精卵孵化至发育阶段 18
      注意：在晶状体发育过程中，约胚胎发育 65–68 小时时，晶状体从外胚层分离并形成一个具有中央腔隙的封闭性囊泡；向此空腔注射可使外源基因特异性表达于增殖态晶状体细胞7,8,18。
      1. 将受精鸡胚在 37 °C 恒温振荡培养箱中孵育约 65–68 小时（图 2B）。
  2. 打开鸡胚蛋壳
    注意：本步骤描述了用于显微注射的胚胎定位与暴露方法。更多细节参见7,8。
    1. 用 70% 乙醇彻底擦拭工作区域。
    2. 从培养箱中取出鸡蛋，大量喷洒 70% 乙醇，并静置晾干。
    3. 将鸡蛋大头朝上放置于蛋托中。
    4. 使用尖齿镊子小心敲击蛋壳大端，去除碎片，形成直径约 2 cm 的开口（图 3A）。
    5. 在解剖显微镜下定位胚胎。
    6. 确定胚胎及鸡胚晶状体位置后，使用解剖显微镜配合精细解剖镊和剪刀，剪除覆盖在胚胎顶部的羊膜（图 3B）。
      注意：剪除范围不宜过大（仅需暴露约 0.5 cm × 0.5 cm 的区域），否则胚胎可能陷入卵黄团中；应尽量避免触碰血管。
    7. 用一个 60 mm 培养皿覆盖蛋壳开口，为下一步操作做准备。
  3. 浓缩病毒原液的显微注射
    注意：含有目标蛋白 DNA 片段的病毒颗粒被导入晶状体腔内的细胞中。实验装置见图 2C。更多细节参见6,7,8。
    1. 将病毒原液置于冰上解冻。
    2. 为便于注射过程中观察病毒原液，将 1 µL 的 10x 快绿（Fast green）加入含 10 µL 病毒原液的离心管中进行稀释。
    3. 为避免未溶解的大颗粒堵塞玻璃微量移液管，将溶液在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 秒，沉淀“大颗粒”，并将上清液转移至新管中，全程保持样本在冰上。
    4. 在 35 mm × 10 mm 培养皿中铺一张拉伸的实验室用 Parafilm 膜，并在其表面加入 1 µL 无菌生理盐水（PBS）（非无菌操作，以覆盖面视为“洁净面”）。
    5. 将制备好的玻璃微量移液管连接至自动皮升注射仪。
    6. 按下填充模式，将无菌生理盐水（PBS）吸入玻璃微量移液管，然后使用注射模式测试分配的 1 µL 液体。
    7. 在新的 35 mm × 10 mm 细胞培养皿表面再铺一张拉伸的实验室用 Parafilm 膜，并在其上加入 1 µL 快绿染色的病毒原液。
    8. 将微量移液管尖端插入病毒原液中，按下填充模式，使约 1 µL 病毒原液进入玻璃微量移液管。
      注意：为防止干燥，在操作暂停时应将已填充的移液管尖端浸入无菌生理盐水（PBS）中。
    9. 在解剖显微镜辅助下，将连接自动注射仪的已填充玻璃微量移液管插入胚胎晶状体腔的目标区域。
    10. 调节光源，确保清晰观察晶状体囊泡的轮廓。
      注意：通常选择右侧晶状体（朝上）进行注射，左侧（朝下）保持完整作为对侧对照。
    11. 确认微量移液管已准确插入晶状体腔内后，注入 5–40 nL 病毒原液（图 3C）。
      注意：熟练操作对实现最佳注射位置至关重要。
    12. 等待约 45 秒后，轻柔地撤出玻璃微量移液管。
    13. 通过解剖显微镜观察快绿染料是否保留在晶状体空腔内且无泄漏，以判断显微注射是否成功。
    14. 注射完成后，用透明胶带密封蛋壳开口。
    15. 将胚胎放回 37 °C 恒温湿润培养箱中继续培养，避免旋转，直至达到晶状体解剖所需的胚胎发育阶段。

眼部手术示意图，包含晶状体植入和显微镜检查装置。
图3：鸡胚显微注射准备及示意图。 （A）打开鸡卵。 （B）切开羊膜。 （C）鸡胚晶状体腔显微注射示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

在确定特定靶蛋白及其相关基因序列后，整体实验流程包括将基因序列克隆至逆转录病毒RCAS(A)载体中，首先将其克隆至衔接载体，再转移至病毒载体。其次，利用包装细胞制备高滴度的病毒颗粒，并收集和浓缩病毒粒子。上述两个主要步骤此前已有详细描述，并已有代表性结果报道6,7,8,14,16。

在本方案中，主要关注的环节是显微注射步骤。必须确定该步骤的成功与否 原位 在显微注射时以及晶状体分离后，将含有目标蛋白DNA片段的RCAS(A)病毒颗粒进行显微注射。 图4 显示晶状体腔在注射染有快绿（Fast Green）的病毒载体前后的图像，用于可视化并确认病毒载体准确注入晶状体腔内。快绿是一种安全性...

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讨论

该实验模型能够在完整晶状体中表达目标蛋白，从而研究这些蛋白在晶状体结构与功能中的作用。鸡胚显微注射模型部分基于Fekete等人的研究6，并由Jiang等人进一步发展8，已被用于将病毒质粒以及激动剂、小干扰RNA（siRNA）和多肽等试剂导入鸡胚晶状体1,9,10,11,12,13。该平台适用于研究引发疾病发展的机制，同时可用于测试先天性白内障等晶状体病理状态下潜在的药物靶点。随着对晶状体病理状态认识的深入以及遗传性或获得性突变的不断发现，这一经济高效的动物模型有助于研究这些疾病发生背后的机制或突变所导致的结果，从而应对目前临床上对非手术、可靠治疗方案的...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助：RO1 EY012085（资助J.X.J）和F32DK134051（资助F.M.A），以及威尔奇基金会资助：AQ-1507（资助J.X.J.）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。部分插图使用Biorender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 滤器康宁431118用于去除培养基中的细胞碎片
35 mm × 10 mm 培养皿FisherScientific50-202-030用于显微注射时使用
离心Fisherbrand13-100-676离心溶液
载体构建GENEWIZ-用于构建体的构建
解剖显微镜AmScopeSM-4TZ-144A用于显微注射的晶状体观察
DNA PCR 引物Integrated DNA Technologies-引物的制备：

细胞内环（IL）缺失的 Cx50（残基 1–97 和 149–400）以及 Cla12NCO 载体通过以下引物对获得：正向引物，CTCCTGAGAACCTACATCCT；反向引物，CACCGCATGCCCAAAGTACAC

Cx43的ILs（残基98–150）和 Cx46（残基 98–166）是  使用以下引物对获得：正向引物，TACGTGATGAGGAAAGAAGAG；反向引物，TCCTCCACGCATCTTTACCTTG；正向引物，CACATTGTACGCATGGAAGAG；反向引物，AGCACCTCCC AT ACGGATTC。

Cla12NCO-Cx43 构建模板使用以下引物对获得：正向引物，CTGCTTCGTACTTACATCATC；反向引物，GAACACGTGCGCCAGGTAC

Cx50的ILs（残基98–148）或 Cx46（残基 98–166）使用 Cla12NCO-Cx50 和 Cla12NCO-Cx46 构建体作为模板，分别以下列引物对进行克隆：正义引物 CACCATGTCCGCATGGAGGAGA，反义引物 GGTCCCC TC CAGGCGAAAC；正义引物 CACATTGTACGCATGGAAGAG，反义引物 AGCACCTCCCATACGGATTC
德拉姆蒙德 Nanoject II 自动纳升注射仪Drummond Scientific3-000-204显微注射移液管
双颈灯显微镜照明器AmScopeLED-50WY用于观察的照明
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基（DMEM）Invitrogen用于细胞培养
蛋托--自制聚苯乙烯泡沫环，直径2英寸，高0.5英寸
孵蛋箱GQF Manufacturing Company Inc.1502受精卵孵化
快绿Fisher scientificF99-10用于病毒原液注射的可视化
受精的白来航鸡鸡蛋德克萨斯A&M大学N/A首选的显微注射动物模型（https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/）
胎牛血清（FBS）Hyclone Laboratories用于细胞培养
荧光素偶联的抗小鼠IgG杰克逊免疫研究实验室115-095-003用于抗FLAG  1:500
镊子FisherScientific22-327379用于移动物品和分离操作
玻璃毛细管Sutter InstrumentsB100-75-10用于显微注射的玻璃微量移液管（外径 1.0 mm，内径 0.75 mm，长度 10 cm）
LipofectamineInvitrogenL3000001用于转染
手动垂直显微拉针仪Sutter InstrumentsP-30要获得合适尺寸的玻璃毛细管
微量离心管FisherScientific02-682-004溶解液
显微镜KeyenceBZ-X710用于成像染色
ParafilmFisherScientific03-448-254放置溶液
青霉素/链霉素Invitrogen用于细胞培养
Pico-Injector哈佛仪器PLI-100通过施加经调节的压力，在数字设定的时间内精确输送微量液体体积
兔抗鸡 AQP0自生成-蒋JX，怀特TW，古登夫DA，保罗DL。鸡晶状体纤维连接蛋白45.6的分子克隆与功能表征。分子生物学与细胞。1994年3月；5(3):363-73。doi: 10.1091/mbc.5.3.363。
兔抗 FLAG 抗体Rockland Immunochemicals600-401-383用于FLAG染色
罗丹明偶联的抗兔IgG 杰克逊免疫研究实验室111-295-003用于抗AQP0  1:500
海绵夹钳垫Sutter InstrumentsBX10用于玻璃微量移液管的储存

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