人诱导性多能干细胞向间充质基质细胞分化的两种代表性方法的比较

摘要

本方案描述并比较了两种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质基质细胞（MSCs）的代表性方法。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的优点；拟胚体（EBs）法的特点是耗时较短。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）是一类成体多能干细胞，已广泛应用于再生医学领域。由于来源于体组织的MSCs受限于供体来源有限、质量差异以及生物安全性等问题，过去十年中，利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成MSCs的研究显著增加。此前及近期将hiPSCs分化为MSCs的研究主要围绕两种培养方法展开：（1）拟胚体（EBs）形成法；（2）单层培养法。本实验方案详细描述了这两种从hiPSCs获得MSCs的代表性方法。每种方法均具有各自的优势与局限性，包括所需时间、成本、细胞增殖能力、MSC标志物的表达水平及其分化潜能。 体外本方案表明，两种方法均可从人诱导多能干细胞（hiPSCs）获得成熟且具有功能的间充质干细胞（MSCs）。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的特点，而拟胚体法（EB法）则具有耗时较短的优势。

引言

间充质基质细胞（MSCs）是一类来源于中胚层的成体多能干细胞¹。MSCs 几乎存在于所有结缔组织中²。自20世纪70年代首次发现，并于1987年由 Friedenstein 等人首次从骨髓中成功分离以来^3,4,5，多种人体体细胞组织（包括胎儿和成体组织）已被用于分离 MSCs，如骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织以及支持造血的基质组织^1,2,6,7。MSCs 具有强大的增殖能力，并可分化为多种体细胞谱系，还能够迁移至受损或炎症组织^2,8,9。这些特性使 MSCs 成为再生医学的潜在候选细胞¹⁰。然而，来源于体组织的 MSCs（st-MSCs）受限于供体来源有限、细胞增殖能力不足、质量差异以及可能由供体传播病原体带来的生物安全担忧^11,12。

人诱导性多能干细胞（hiPSCs）是通过转录因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）对成体细胞进行重编程而获得的，其功能与胚胎干细胞相似^13,14。它们具有自我更新能力，并能分化为任何类型的体细胞，包括间充质干细胞（MSCs）。与组织来源的间充质干细胞（st-MSCs）相比，iPSC来源的间充质干细胞（iPSC-MSCs）具有供应无限、成本较低、纯度更高、质量控制更方便、易于规模化生产和基因改造等优势^15,16,17。

由于iPSC-MSCs具有这些优势，已有多种将iPSC诱导分化为MSC的方法被报道。这些分化方法主要围绕两种培养体系展开：（1）拟胚体（embryoid bodies, EBs）形成法；（2）单层培养法。^11,18,19,20本文表征了两种方法各自的代表性方案。此外，基于时间、成本、增殖能力、间充质干细胞生物标志物的表达以及分化能力，对这两种代表性方案进行了比较。 体外 也获取了相关数据。

方案

1. hiPSCs 的培养与维持

1. hiPSC 的解冻
   1. 从液氮中取出细胞，在 37 °C 水浴中快速解冻。将正在解冻的细胞转移至已加入 3 mL iPSC 维持培养基的 15 mL 离心管中（材料表）。轻轻混匀培养基。
   2. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用含 10 µM Y-27632 的 1 mL iPSC 维持培养基轻柔重悬细胞（用移液器吹打 2–3 次）。
   3. 将细胞悬液转移至预先包被了生长因子减少型（GFR）-细胞外基质胶（1:100）并已加入 2 mL 含 10 µM Y-27632 的 iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中（约 4 x 10⁴ 个细胞/cm²）。
   4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 5–6 天（至 80%–90% 汇合度），每天更换 iPSC 维持培养基。
2. hiPSC 的传代
   1. 从 6 孔板中移除 iPSC 维持培养基。用 DPBS 洗涤 hiPSC 一次。
   2. 加入 700–800 µL 的 0.48 mM EDTA 溶液，在室温（RT）孵育 1 分钟，然后移除消化液。继续在 37 °C 孵育 3–5 分钟。
   3. 当细胞消化成片状时（切勿将细胞消化为单细胞状态），加入 1 mL 含 10 µM Y-27632 的 iPSC 维持培养基以终止消化。小心地用移液器吹打细胞 2–3 次。
   4. 将细胞悬液转移至预先包被了生长因子减少型（GFR）-细胞外基质胶（1:100）并已加入 2 mL 含 10 µM Y-27632 的 iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中。
      注：传代比例范围为 1:6 至 1:20（约 4 x 10⁴ 个细胞/cm²），平均细胞聚集体大小约为 50–200 µm。
   5. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养至 80%–90% 汇合度（5–6 天），每天更换 iPSC 维持培养基。

2. 通过拟胚体形成实现hiPSCs向MSCs的分化

注意：该方法源自以往文献^21,22,23,24。图1展示了该方法的总体流程。表1总结了该方法的特点。

1. 培养基的制备
   1. 通过在α-MEM中添加1%（v/v）GlutaMAX、10%（v/v）FBS、10 ng/mL FGF2和5 ng/mL TGFβ，制备MSC分化培养基。
   2. 通过在α-MEM中添加1%（v/v）GlutMAX、10%（v/v）FBS和1 ng/mL FGF2，制备MSC维持培养基。
2. hiPSCs 的制备
   1. 将hiPSC细胞系（解冻后至少传代2-3次）接种于经生长因子减少型（GFR）-细胞外基质凝胶（1:100稀释）包被的6孔组织培养板中，使用iPSC维持培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 直至细胞融合度达到80%–90%。
3. 第0天：EB形成
   1. 从6孔板中移除iPSC维持培养基，用DPBS清洗hiPSC细胞一次。
   2. 加入700–800 µL的0.48 mM EDTA溶液，在室温下孵育1分钟，然后去除消化液。继续在37 °C下孵育3–5分钟。
   3. 当细胞被消化成细胞片层时（不要将细胞消化成单细胞），加入2 mL iPSC维持培养基（含10 µM Rock抑制剂和1:100 GFR-细胞外基质凝胶）以终止消化。
   4. 将细胞转移至6孔低吸附培养板中。按2孔普通组织培养板对应1孔低吸附培养板的比例接种细胞。于37 °C、5% CO₂条件下，在摇床（60 rpm/min）中培养细胞。₂ 培养24小时以形成球形胚体。
4. 第1天至第7天：EB分化
   1. 用巴斯德吸管将EBs转移至离心管中（避免破坏EBs），在室温下静置5-10分钟，使其自然沉降，随后吸除上清液。
   2. 将拟胚体转移至含2 mL间充质干细胞分化培养基的6孔低吸附板中。将拟胚体置于摇床中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 培养7天，期间换液一次。
5. 第8天至第17天：EB接种
   1. 用巴斯德吸管将拟胚体转移至离心管中（避免破坏拟胚体），静置5–10分钟使拟胚体自然沉降，随后吸除上清液。
   2. 将拟胚体转移至含2 mL间充质干细胞维持培养基的GFR-细胞外基质凝胶包被的6孔板中。细胞贴壁后定期更换培养基，培养至90%融合度（约10天）。
6. 第18天至第27天：MSCs的成熟与扩增
   1. 将EB来源的培养物用解离溶液在37 °C处理5–10分钟（消化时间因细胞类型不同而有所差异）。
   2. 当部分细胞消化成单细胞时，加入2 mL间充质干细胞维持培养基终止消化，并将细胞悬液转移至离心管中。用DPBS洗涤残留未消化的细胞一次，再次进行消化。重复数次，直至所有细胞均消化成单细胞。将细胞悬液在250 x g 5 分钟后，弃去上清液。
   3. 将细胞接种于明胶包被的培养皿中（约 2 x 10⁵ 细胞/厘米²²培养至90%融合度，期间定期更换间充质干细胞维持培养基。此时将该代细胞记为第0代（P0）。
   4. 为了获得纯化的MSC 并保持成熟状态，每约6天以1:3的传代比例连续传代两次。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）。

3. 通过单层培养法将hiPSCs分化为MSCs

注意：该方法源自先前的文献^25,26,27,28。图1展示了该方法的总体流程。表1总结了该方法的特点。

1. 培养基的制备
   1. 通过在α-MEM中添加1%（v/v）GlutMAX、10%（v/v）FBS和1 ng/mL FGF2，制备MSC维持培养基。
2. hiPSCs 的制备
   1. 将hiPSC细胞系（解冻后至少传代2-3次）接种于经生长因子减少型（GFR）-细胞外基质凝胶（1:100稀释）包被的6孔组织培养板中，使用iPSC维持培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 直至细胞融合度达到50%–60%。
3. 第0天至第13天：通过直接单层培养法进行分化
   1. 从6孔板中移除iPSC维持培养基。
   2. 直接加入2 mL MSC维持培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养14天_2, 每天更换培养基。
4. 第14天至第35天：通过反复传代实现间充质干细胞成熟
   1. 在37 °C下用解离溶液处理单层培养物5-10分钟（消化时间因细胞类型不同而有所差异）。
   2. 当细胞消化为单细胞时，加入2 mL间充质干细胞维持培养基以终止消化，并将细胞悬液转移至离心管中。用DPBS洗涤残留未消化的细胞一次，再次进行消化。重复数次，直至所有细胞均消化为单细胞。将细胞悬液在250 x g 5 分钟后，弃去上清液。
   3. 将细胞接种于明胶包被的培养皿中（约 2 x 10⁵ 细胞/厘米²²培养至90%融合度，期间定期更换间充质干细胞维持培养基。此时将该代细胞记为第0代（P0）。
   4. 为了获得纯化的MSC 并使其成熟，在约18天内以1:3的传代比例连续传代6次。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）。

4. 通过流式细胞术分析hiPSC诱导的MSCs的表面抗原

注意：与骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的表面抗原类似，由人诱导多能干细胞（hiPSCs）诱导而来的间充质干细胞表达CD105、CD73和CD90，但不表达CD45和CD34²⁹。此外，hiPSCs可作为阴性对照细胞。通过流式细胞术对hiPSC诱导的间充质干细胞及hiPSCs进行的表面抗原分析结果见图2。

1. 用解离液在37 °C下处理驱动hiPSC的MSCs，持续2-3分钟。用0.48 mM EDTA解离试剂处理hiPSCs，在室温下孵育1分钟，然后去除解离试剂。继续在37 °C下孵育3-5分钟。
2. 当细胞消化为单细胞时，加入培养基（间充质干细胞用MSC维持培养基，诱导多能干细胞用iPSC维持培养基）以终止消化。
3. 将细胞悬液在350 x g 5 分钟后，弃去上清液。
4. 用预冷的DPBS洗涤细胞一次，350 x g离心 g 5 分钟后，移除上清液。
5. 计数并将细胞在冰冷的10% FBS-DPBS（v/v）溶液中重悬，浓度为10 × 10⁶⁶ 细胞/mL，并将100 µL细胞悬液（1 × 10⁶ 细胞/管）分装至各管⁶ 细胞/管）加入1.5 mL离心管中。
6. 向100 µL细胞悬液中加入5 µL人Fc受体阻断液，在室温下孵育5–10分钟，以进行非特异性阻断。
7. 350 x g 离心 g 5 分钟后移除上清液。用预冷的 2% FBS-DPBS（v/v）溶液洗涤细胞两次。
8. 用预冷的100 µL含2% FBS的DPBS（v/v）溶液重悬细胞。
9. 加入 5 µL（1 次检测）抗 CD34-FITC 和 5 µL（1 次检测）抗 CD45-APC 至 100 µL 细胞中
   悬浮。向另一个含有100 µL细胞悬液的管中加入5 µL（1次检测）抗-CD73-APC、5 µL（1次检测）抗-CD90-FITC和5 µL（1次检测）抗-CD105-PE。向第三个含有100 µL细胞悬液的管中加入5 µL人IgG1同型对照FITC、人IgG1同型对照PE和人IgG1同型对照APC。冰上避光孵育15–20分钟。同时，准备单染微球。
10. 用预冷的2% FBS-DPBS（v/v）溶液洗涤细胞两次。
11. 加入300 µL预冷的2% FBS-DPBS（v/v）溶液重悬细胞，经200目筛网过滤。
12. 使用流式细胞术分析样品。先分析经同型对照抗体染色的细胞悬液并设门，然后分析经目标抗体染色的细胞悬液。

5. 由 hiPSC 诱导的 MSCs 的成骨分化

注意：驱动 hiPSC 的 MSCs 具有成骨分化潜能（图 3A、B）。以下为成骨分化的实验方案。

1. 通过在α-MEM中添加10% FBS、100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和100 µM抗坏血酸，制备成骨诱导培养基。
2. 将1 × 10⁵个MSC接种至明胶包被的48孔板中，培养至细胞融合度达到60%–70%。
3. 吸除培养基，加入0.3 mL成骨诱导培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养14天，每3天更换一次培养基。
4. 吸除培养基，用DPBS洗涤一次。
5. 加入0.3 mL 4%多聚甲醛，室温孵育30分钟。
6. 去除多聚甲醛，用0.3 mL DPBS在室温下洗涤细胞10分钟，重复3次。
7. 吸除DPBS，加入0.2 mL茜素红染色液，室温孵育30分钟。
8. 去除染色液，用0.3 mL DPBS在室温下洗涤细胞10分钟，重复3次。
9. 在光学显微镜下观察钙沉积的染色情况。

6. 由 hiPSC 诱导的 MSCs 的脂肪向分化

注意：驱动 hiPSC 的 MSCs 具有成脂分化潜能（图 3C，D）。以下为成脂分化方案。

1. 通过在α-MEM中添加10% FBS、1 µM地塞米松、1 µM IBMX、10 µg/mL胰岛素和100 µM吲哚美辛，制备成脂诱导培养基。通过在α-MEM中添加10% FBS和10 µg/mL胰岛素，制备成脂维持培养基。
2. 将1 × 10⁵个MSC接种至明胶包被的48孔板中，培养至细胞密度达到90%。
3. 吸除培养基，加入0.3 mL成脂诱导培养基。在37 °C、5% CO₂条件下，继续用成脂诱导培养基培养细胞4天。
4. 吸除培养基，加入0.3 mL成脂维持培养基。在37 °C、5% CO₂条件下，继续用成脂维持培养基培养细胞3天。
5. 重复步骤6.3和6.4共2-3次，直至完成脂肪细胞的分化与成熟。
6. 吸除培养基，用DPBS洗涤一次。
7. 加入0.3 mL 4%多聚甲醛，在室温下孵育10分钟。吸除多聚甲醛，用DPBS冲洗两次。
8. 按照生产商说明书使用油红O染色剂，并在光学显微镜下观察脂滴。

7. 由 hiPSC 诱导的 MSCs 的软骨形成分化

注意：由 hiPSC 分化而来的 MSCs 具有软骨分化潜能（图 3E、F）。以下为软骨分化方案。

1. 通过在α-MEM中添加10% FBS、100 nM地塞米松、1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、10 µM抗坏血酸、1 mM丙酮酸钠、50 µg/mL脯氨酸、0.02 nM转化生长因子β3（TGFβ3）和0.5 µg/mL骨形态发生蛋白6（BMP-6），配制软骨母细胞诱导培养基。
2. 收集2.5 × 10⁵个由hiPSC诱导的MSCs，以150 × g离心5分钟，弃去上清液。用1 mL α-MEM重悬细胞，再以150 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液，将细胞重悬于0.5 mL软骨诱导培养基中，再以150 × g离心5分钟。
4. 直接拧开管盖，在37 °C、5% CO₂条件下培养21天，每3天更换一次软骨诱导培养基。在软骨分化期间，每天轻轻弹动离心管以重悬软骨细胞团 （避免破坏软骨细胞团）。
5. 弃去上清液，用0.5 mL PBS洗涤两次。
6. 加入0.3 mL 4%多聚甲醛，固定24小时。
7. 将软骨细胞团进行石蜡包埋，切片（3 µm），然后用甲苯胺蓝（1%）染色30分钟。
8. 在光学显微镜下观察软骨细胞的细胞外基质。

结果

按照方案（图1A），通过拟胚体形成和单层培养法将hiPSCs分化为MSCs。在分化过程中，细胞表现出不同的典型形态（图1B、C）。

如图1B所示，hiPSC集落未分化时呈现典型的紧密形态，边界清晰，由紧密排列的细胞组成。hiPSC经解离并在摇床上培养24小时后，形成均匀的球形EB。在MSC分化培养基中培养的第1至第7天，EB的光滑边缘逐渐变得粗糙，体积增大。第8至第17天，将EB转移至GFR-细胞外基质凝胶包被的6孔板后，EB逐渐贴壁，周围出现大量向外伸展的贴壁单层细胞。至第18天细胞融合度达到90%时，消化细胞并接种于明胶包被的培养板上。第19天，细胞贴附并呈现多边形形态。随后，当细胞融合度达到90%时连续传代两次。所获得的MSC逐渐成熟，呈现典型的梭形形态，集落呈漩涡状生长。

如

讨论

在本方案中，研究了两种具有代表性的将hiPSCs分化为MSCs的方法^{20,21,22,23,24,25,26,27,28,30}。两种方法均能够从hiPSCs中获得MSCs。通过细胞形态（图1）、表面抗原（图2）以及分化能力（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
茜素红染色试剂盒	Beyotime Biotechnology	C0148S
抗人 CD105（PE）	Biolegend	323206
抗人 CD34（FITC）	Biolegend	343503
抗人 CD45（APC）	Biolegend	304011
抗人 CD73（APC）	Biolegend	344006
抗人 CD90（FITC）	Biolegend	328108
抗坏血酸	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
二氧化碳恒温摇床	Crystal	CO-06UC6
补偿微珠	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
地塞米松	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12 培养基	Servicebio	G4610
胎牛血清	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
明胶	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
人 IgG1 同型对照 APC	BioLegend	403505
人 IgG1 同型对照 FITC	BioLegend	403507
人 IgG1 同型对照 PE	BioLegend	403503
人 TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
吲哚美辛	Solarbio	SI9020
胰岛素	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC 维持培养基	STEMCELL Technology	85850
ITS 培养基添加剂	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel（生长因子减少型）	BD Corning	354230
油红 O 染色试剂盒	Beyotime Biotechnology	C0158S
脯氨酸	Solarbio	P0011
丙酮酸钠	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
甲苯胺蓝染色试剂盒	Solarbio	G2543
TrypLE Express 酶（1x）	Gibco	12604013
超低吸附 6 孔板	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-甘油磷酸钠	Solarbio	G8100