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斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

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DOI：

10.3791/65733

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2023年10月27日

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1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

利用光遗传学手段调控信号通路，是研究发育、再生、稳态及疾病过程中信号如何被解码的一种强有力策略。本方案提供了在早期斑马鱼胚胎中使用基于光-氧-电压感应结构域的 Nodal 和骨形态发生蛋白（BMP）信号激活剂的实用操作指南。

摘要

信号通路协调着发育、再生、稳态维持以及疾病等基本的生物学过程。为了理解信号通路在这些广泛背景下的作用机制，需要能够实验性操控信号活动的方法。分子光遗传学 工具可通过光实现对信号通路活性的可逆、可调且具有高度时空精确性的操控，已被应用于体外（in vitro）、离体（ex vivo）和体内（in vivo）研究。这些工具将光响应蛋白结构域（例如蓝光诱导同源二聚化的光-氧-电压感应（LOV）结构域）与信号效应分子相偶联，从而实现对信号通路的光依赖性实验调控。本实验方案提供了在光学通透性良好的斑马鱼早期胚胎中使用基于LOV结构域的骨形态发生蛋白（BMP）和Nodal信号激活剂bOpto-BMP与bOpto-Nodal的实用操作指南。文中描述了两个对照实验：快速表型分析用于确定合适的实验条件，免疫荧光分析用于直接评估信号通路的激活状态。这两个对照实验共同构成了在斑马鱼早期胚胎中应用光遗传学工具的有效工作流程。这些策略为研究信号通路在发育、健康和生理功能中的作用提供了强大的技术平台。

引言

信号通路使细胞能够响应其周围环境，并在组织和整个生物体水平上协调各种活动。在胚胎发育过程中至关重要的信号包括TGF-β超家族成员 骨形态发生蛋白（BMP） 和 Nodal1,2,3在胚胎发生过程中，这些信号及其他信号调控的通路通过控制基因表达和其它过程，对身体结构进行模式化，以确保各种组织和器官正常发育并正确连接。当信号传导或对信号的响应受到干扰时，可能导致包括出生缺陷和癌症在内的病理状况。4,5,6,7。尽管 对信号传导的严格研究已取得进展，但在多种背景下，信号水平和动态特性的解码机制仍有待进一步探索8,9,10,11，尤其是在发育过程中12,13,14,15,16,17,18,19.

为了理解信号传导如何被解码，理想的实验方法是以高度的空间和时间控制来操纵信号水平、时序和/或动态变化，并评估其结果。例如，已有研究提出，精确的空间信号梯度可引导发育中组织的模式形成20,21。改变信号梯度的空间分布将有助于验证这一假说22。此外，信号动态在产生多样化细胞反应中的重要性正日益明确：例如，同一条信号通路可能因信号频率的不同而指导细胞分化或增殖9,23。能够轻松操控信号动态的实验范式，对于探索动态特性与细胞命运决定之间的关系将具有重要价值8,12,13,14,15。

历史上，已有多种方法被用于在发育过程中调控信号通路，从而推动了诸多基础性发现1,2,3。阻断信号传导的方法包括使用通路功能缺失型突变体、异位表达抑制因子或拮抗剂药物。激活信号传导的方法则包括使用激动剂药物、重组配体、异位表达配体或组成型活性受体，以及通路抑制因子的功能缺失型突变体。这些方法在实验可控性方面呈现出一个连续谱系。例如，突变体和异位表达可能处于该谱系中“重锤式”干预的一端：这些方法可能导致通路活性发生剧烈且系统性的改变，从而引发早期死亡，使后续阶段的研究无法进行；或者随时间推移产生多种效应（多效性），难以解析其具体机制。此外，通常很难独立地逐项调控某一信号特征，例如信号强度或持续时间。在谱系的另一端，某些方法可提供更精确的实验控制，例如微流控装置，可对样品施加药物或重组蛋白，并实现时间上、有时还包括空间上的精确控制18,24,25；又如遗传学方法，包括热激诱导型启动子和组织特异性启动子，也可提供类似的精确调控优势16,26,27。然而，这些方法可能操作困难，缺乏可逆性，动力学过程相对较慢或分辨率不足，并且在某些模式系统中可能无法实现。

分子光遗传学方法为这一工具箱增添了强大的手段。这些方法利用对不同波长光有响应的蛋白质来操控生物学过程，包括信号转导8,12,13,14,15，并在数十年间被开发用于从细胞培养到完整动物的多种系统12,13,28。与传统方法相比，分子光遗传学通常能对生物过程实现更高程度的时空控制：光遗传系统中的控制因子是光，而对光的波长、强度、持续时间及照射频率的调控相对简单。借助共聚焦显微镜和双光子显微镜等复杂系统，可在亚细胞尺度上实现空间控制29,30,31。目前已开发并应用了多种用于光遗传操控信号通路的工具，涉及的研究系统包括 Johnson 等人22、Čapek 等人32、Krishnamurthy 等人33以及 Huang 等人34所描述的系统。例如，利用光遗传学提供的空间控制能力，该策略最近被用于改变果蝇（Drosophila）胚胎中的信号梯度，证明果蝇胚胎发育对该梯度的变化具有出乎意料的鲁棒性22。光遗传信号激活剂的可逆性以及快速的开启/关闭动力学特性，也使其成为研究信号动态解码机制的有力工具8,12,13,14,15,34,35,36。

早期斑马鱼胚胎是一种非常适合进行光遗传学研究的体内系统，因为其体外受精、组织透明、便于显微观察，并且具有良好的遗传可操作性。由于胚胎在母体外发育，光照更易于施加；光能够穿透并作用于其非不透光的组织；活体斑马鱼胚胎对成像具有良好的耐受性（此外还具备透明性）；现有的遗传学方法为基因敲低和过表达实验提供了便捷的途径，同时也便于构建有用的转基因品系37。

近期，研究人员开发出光遗传学工具，可通过蓝光照射在斑马鱼胚胎中激活BMP38和Nodal39信号通路（图1）。我们将这些工具称为bOpto-BMP和bOpto-Nodal（其中b代表蓝光激活，Opto代表光遗传学）。bOpto-BMP/Nodal基于相似的信号通路激活机制。BMP或Nodal配体与其相应的受体丝氨酸-苏氨酸激酶结合后，可驱动受体激酶结构域之间的相互作用，从而导致信号效应分子的磷酸化（BMP通路中为Smad1/5/9，Nodal通路中为Smad2/3）。磷酸化的信号效应分子随后转入细胞核，调控靶基因的表达3（图1A、D）。通过将受体激酶与光响应性二聚化蛋白偶联，可使这些受体激酶的相互作用具备光响应性：在光照条件下，这些嵌合蛋白发生二聚化，促使受体激酶结构域相互作用并激活信号传导（图1B、C、E、F）。重要的是，与内源性受体不同，bOpto-BMP/Nodal不含胞外配体结合结构域，从而确保其活性不依赖于配体（图1C、F）。这种光遗传学激活策略最初在受体酪氨酸激酶中实现40，41，42，随后被应用于受体丝氨酸-苏氨酸激酶。

bOpto-BMP/Nodal 利用来自藻类 Vaucheria fridiga AUREO1 蛋白（VfLOV）的蓝光响应型（~450 nm）同源二聚化光-氧-电压感应（LOV）结构域43,44。这些构建体包含一个膜靶向的豆蔻酰化基序，其后连接 BMP 或 Nodal 受体激酶结构域，并与 LOV 结构域融合（图 1B、E）。蓝光照射可诱导 LOV 结构域同源二聚化，从而引起受体激酶结构域相互作用，导致相应的 Smad 磷酸化及信号通路激活（图 1C、F）。对于 bOpto-BMP，使用 Acvr1l（又称 Alk8）和 BMPR1aa（又称 Alk3）的 I 型受体激酶结构域，以及 BMPR2a 的 II 型受体激酶结构域的组合构建体可实现信号激活的最优化38（Addgene #207614、#207615 和 #207616）。对于 bOpto-Nodal，则采用 Acvr1ba 的 I 型受体激酶结构域与 Acvr2ba 的 II 型受体激酶结构域的组合构建体39。

通过在单细胞阶段向斑马鱼早期胚胎注射 mRNA，已将 bOpto-BMP/Nodal 引入其中，并用于研究信号持续时间在 Nodal 信号解读中的作用39，探究斑马鱼为何会失去对 Nodal 信号的响应能力45，以及分析 BMP 靶基因如何响应不同水平的 BMP 信号38。这些工具很可能将在未来多种研究中继续发挥重要作用。然而，光遗传学信号激活工具的优势也正是其局限性所在：对光敏感的样品必须谨慎处理，以避免意外的异位信号激活。暴露于室内光或阳光下均可能激活 bOpto-BMP/Nodal。

本方案为在早期斑马鱼胚胎中使用mRNA编码的基于LOV的BMP和Nodal激活剂提供了实用建议。首先详细介绍了一种构建光照箱的策略，用于控制均匀的光照和温度（图2，补充文件1，补充文件2，补充文件3，补充文件4，补充文件5，补充文件6，补充文件7，补充文件8）。随后描述了两个关键的对照实验，用于确定光遗传学信号激活剂是否按预期发挥作用，即仅在光照下激活通路活性（图3）。第一个对照实验涉及在受精后一天观察光照组与未光照组胚胎的表型（图3A）。经mRNA注射并接受光照的胚胎应表现出类似BMP或Nodal过表达的表型，而未接受光照的胚胎则不应出现此类表型（图4A、B；尤其在此时间点，BMP相关表型具有明显可辨性46）。该实验可快速评估激活活性。第二个对照实验旨在确认表型是否由BMP或Nodal信号通路过量引起，并直接观察信号水平的变化：在囊胚晚期/原肠胚早期阶段进行约20分钟光照后，采用免疫荧光染色检测磷酸化的信号效应分子（分别为pSmad1/5/9或pSmad2/3），该时期的信号活性已有充分描述12,16,17,47,48,49,50（图3B和 图4C）。需要注意的是，尽管已有研究证明bOpto-BMP38和bOpto-Nodal39均可实现空间局域性激活，但本方案仅描述均匀光照及信号激活策略。建议在将bOpto-BMP/Nodal应用于具体科研问题之前，先完成上述对照实验，以确定适合本地实验条件的最佳参数。

方案

斑马鱼研究方案经美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）动物护理与使用委员会审查并批准（ASP 21-008）。所有斑马鱼研究均依照《实验动物护理与使用指南》的规定实施。

1. 构建光源箱

  1. 为了控制光照和温度，构建一个使用发光二极管（LED）微孔板照明器作为光源的光箱（图2A, 材料表, 补充文件 1，补充文件 2）。这种可定制的照明器可对多个波长进行动态、可编程的控制。
    注意：搭建光源箱有多种可能的策略，其他方法可能更为合适（例如，参见 Gerhardt 等人的研究）。51，Bugaj 等人52，Kumar 和 Khammash53，以及更多内容 https://www.optobase.org/materials/)
  2. 在光箱中包含以下特征：温度控制（斑马鱼胚胎的理想温度为 28 °C）、排除非目标光源（如室内光和阳光）、均匀递送覆盖目标区域（如 6 孔板）的蓝光，以及对光强和照射动态的控制。
    注意：bOpto-BMP/Nodal 由蓝光激活，但某些光遗传学工具响应其他波长的光。请根据所使用的光遗传学工具选择合适的波长。
  3. 在培养箱顶部钻一个孔（图2B略宽于LED输出透镜的
    1. 确保培养箱顶部没有会被钻孔损坏的电气部件材料表可通过联系培养箱制造商并直接询问来确定这一点。
    2. 如果培养箱顶板上已有孔洞，使用阶梯钻头将孔径扩大至1.25英寸；否则，使用带轴心的1.25英寸开孔锯。
    3. 如果存在遮挡光源的内部面板，请钻出合适尺寸的孔，以确保光锥不被遮挡（图2A）。面板通常由薄金属板制成，因此应使用低速和金属钻头以防止损坏（推荐使用钴钻头）。
  4. 构建一个LED支架，用于将LED微孔板照明器固定在培养箱顶部（图2C，补充文件3，补充文件4，补充文件5，补充文件6，补充文件7，补充文件8).
    1. 使用M3螺丝将四个M3方柱铜柱安装到垂直支架上。
    2. 将两个侧支架安装到垂直支架的立方间隔柱的左侧和右侧。在侧支架剩余的孔位上再安装一个立方间隔柱。
    3. 将垂直支架部件安装到LED微孔板照明器组件上（材料表使用M6螺丝固定。将LED镜头垫圈置于LED系统镜头上方。
    4. 将组装好的部件安装到培养箱的面板安装座上，然后固定到垂直和侧向支架上的 M3 铜柱。将培养箱密封圈放置在培养箱顶部的钻孔上方。
    5. 将培养箱面板安装在培养箱密封圈上方，确保密封圈和面板的开孔与培养箱上的孔同心。使用8号螺钉将面板固定在培养箱顶部。确保该密封处避光。
  5. 将6孔板放置于培养箱的顶层架子上。确定光束是否均匀覆盖整个培养板图2A）。使用一张纸来可视化光照覆盖范围。
  6. 如果光束未覆盖整个培养板，可通过下移搁板来增加LED与培养板之间的距离。对于本系统，LED与搁板之间约14英寸的距离已足够。
  7. 使用光度计测定辐照度水平和空间均匀性（材料表).
  8. 为避免意外的阳光和室内光线照射，使用密封条确保培养箱门完全避光（图2A).
  9. 斑马鱼胚胎在 28 °C 下发育良好54使用记忆卡温度计确保光箱温度维持在 28 °C。

2. 制备用于注射的 mRNA

注：pCS2+ 是 bOpto-BMP 构建体38 和 bOpto-Nodal 构建体39 的载体骨架。该载体具有氨苄青霉素抗性。bOpto-BMP 由三个构建体组成（图 1B）：BMPR1aa-LOV（Addgene # 207614）：I 型 BMPR1aa 受体（亦称 Alk3）的假定激酶区与 LOV 融合；Acvr1l-LOV（Addgene # 207615）：I 型 Acvr1l 受体（亦称 Alk8）的假定激酶区与 LOV 融合；BMPR2a-LOV（Addgene # 207616）：II 型 BMPR2a 受体的假定激酶区及其后续的 C 末端结构域与 LOV 融合。bOpto-Nodal 由两个构建体组成（图 1E）：Acvr1ba-LOV：I 型 Acvr1ba 受体（亦称 Acvr1b）的假定激酶区与 LOV 融合；Acvr2ba-LOV：II 型 Acvr2ba 受体（亦称 Acvr2b）的假定激酶区与 LOV 融合。

  1. 用 NotI 限制性内切酶在 37 °C 下消化 2–5 µg 质粒 DNA 1–3 小时，以实现质粒的线性化（材料表).
    注意：也可以使用质粒作为PCR模板来制备线性化DNA。
  2. 使用标准的柱式纯化试剂盒纯化 DNA（材料表).
  3. 使用一个 体外 SP6 转录试剂盒，例如 mMessage mMachine 试剂盒，用于从线性化模板转录 RNA材料清单）。根据制造商的建议设置两个反应，以确保更高的产量。
  4. 使用标准的基于离心柱的RNA纯化试剂盒纯化RNA（材料清单也可通过沉淀法进行纯化。

3. 注射 mRNA

  1. 注射前至少一天，制备注射用培养皿和琼脂糖包被的6孔板。
    1. 准备200 mL含1%琼脂糖的斑马鱼胚胎培养基，微波加热至琼脂糖完全溶解。任何标准的斑马鱼胚胎培养基均可使用；但应避免在胚胎培养基中添加亚甲蓝，因为它可能影响其他应用中的下游成像。
    2. 小心将熔化的琼脂糖倒入100 mm × 15 mm的塑料培养皿中，填充至培养皿一半高度。
    3. 用胚胎培养基冲洗注射模具，然后轻轻放置于熔化的琼脂糖上，确保模具与琼脂糖之间无气泡残留。可用胶带在模具背面制作一个标签，以便于放置和取出。
    4. 模具应漂浮在熔化的琼脂糖中。若模具下沉，请小心将其从琼脂糖中取出，并重复步骤3.1.3。
    5. 待琼脂糖凝固后，利用标签轻轻取出模具。可通过将培养皿置于4 °C来加速凝固过程。
    6. 若进行免疫荧光实验时使用去壳胚胎，需制备琼脂糖包被的6孔板。
    7. 使用一次性10 mL塑料移液管，将足量熔化的琼脂糖转移至6孔板的每个孔中，以覆盖孔底。
    8. 将注射用培养皿和6孔板储存于4 °C。可立即使用，或保存至琼脂糖干燥或污染为止（通常为2–3周）。
    9. 若进行免疫荧光实验时使用去壳胚胎，需准备火焰抛光的玻璃移液管尖端。
    10. 将玻璃移液管末端插入本生灯火焰中并持续旋转，直至边缘光滑。去壳胚胎必须能顺利通过移液管末端。切勿使开口缩小至小于 胚胎直径。
    11. 可购买或自行拉制显微注射针（材料表）。建议在注射当天准备额外的注射针，以防需要更换。
  2. 注射前一天，根据机构的标准操作程序（SOP）设置斑马鱼繁殖对，并将雄鱼与雌鱼分开饲养。
    1. 开启光源箱温控装置，维持温度为28 °C。为确保光源箱温度稳定在28 °C，需使用带存储卡的温度计（材料表）监测温度。
    2. 配制mRNA注射混合液。每种构建体应注射等摩尔量。具体注射量需通过实验经验确定。
    3. bOpto-BMP转录本大小如下：
      Acvr1l-LOV = 2007个核苷酸（nt）
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. 为实现等摩尔注射，Acvr1l构建体的注射量应为BMPR1aa的1.01倍；BMPR2a构建体的注射量应为BMPR1aa的1.72倍。
    5. bOpto-Nodal转录本大小如下：
      ​Acvr1ba-LOV和Acvr2ba-LOV均为1962 nt。
    6. 为实现等摩尔注射，每种构建体注射相同量即可。
    7. 配制等摩尔注射混合液，将靶向同一信号通路的所有mRNA合并为一种注射混合液。可根据需要加入酚红作为注射示踪剂。如图4所示数据，每种bOpto-Nodal构建体（Acvr1ba-LOV和Acvr2ba-LOV）使用15 pg；bOpto-BMP实验中，Acvr1l-LOV和BMPR1aa-LOV各使用7.8 pg，BMPR2a-LOV使用13.4 pg。
    8. 将注射混合液储存于-20 °C。一旦确定最佳注射浓度，可分装为5–10 µL的 aliquot，并储存于-20 °C或-80 °C。
  3. 注射当天
    1. 若进行表型分析实验（图3A），应按照实验室SOP，在单细胞阶段通过卵膜直接将物质注射至细胞中央。卵膜可保护胚胎免受环境应激因素影响，并限制破裂胚胎的扩散，这在评分时有助于准确量化破裂胚胎数量（图4A,B）。
    2. 若进行免疫荧光实验（图3B），胚胎最终需去壳以便成像（图4C）。因此，应在单细胞阶段直接将物质注射至去壳胚胎的细胞中央（参见Rogers等人的文献55中的去壳方案）。或者，也可在固定后手动去壳，但相比使用蛋白酶K去壳更为繁琐。
    3. 使用火焰抛光的玻璃移液管操作去壳胚胎（见步骤3.1.10）。注意避免去壳胚胎接触空气或塑料表面，以免导致胚胎破裂。操作时应轻柔处理去壳胚胎。
    4. 额外准备一皿未注射胚胎，作为评估发育阶段进展的对照（见步骤4.3.5）。确保这些对照胚胎与实验组胚胎来自同一批受精卵，即由同一对亲鱼同时受精产生。此对照在发育阶段相关的免疫荧光实验中有用，但在表型分析实验中非必需。
    5. 对表型分析和免疫荧光实验均采用以下实验条件：1）未注射、未光照；2）未注射、光照；3）注射、未光照；4）注射、光照。每种条件至少选择30枚胚胎。为保证胚胎健康，每个6孔板孔中培养的胚胎数量不应超过30枚。
    6. 注射后，将胚胎转移至标记好的培养皿或琼脂糖包被的6孔板（适用于去壳胚胎），并在28 °C下孵育。此时胚胎尚不具光敏感性。自受精后1.5小时（hpf）起，应将注射胚胎视为具有光敏感性进行处理。

4. 光照实验

注意：使用辐照度为 45 W/m2 的 ~450 nm 光照射可有效激活 bOpto-BMP/Nodal，且无明显光毒性（有关光度计信息，请参见材料表）。通过改变辐照度值可调节光遗传学激活信号的水平38。然而，在更高辐照度下需评估光毒性。

  1. 对时间敏感的步骤。在受精后约1.5小时（hpf）的4-至16细胞阶段，移除未受精和发育异常的胚胎。如有必要，重新分配胚胎，确保每孔中胚胎数量相同（不超过30个）。
    注意：此步骤应在4-至16细胞阶段左右进行，因为随着注射的mRNA被翻译为蛋白质，胚胎将对光敏感。我们未观察到在1.5 hpf之前胚胎具有显著的光敏感性。若需在1.5 hpf之后评估胚胎以避免意外的光激活，请使用红光照明，或用可阻隔LOV二聚化所需蓝光波长的红色滤光纸覆盖所有光源（包括显微镜载物台）（材料表）。
    1. 应一致地评估胚胎，以确保不同实验条件和重复之间分布无偏倚。
  2. 进行表型分析实验时，从1.5 hpf开始采用以下为期1天的光照处理方案（图3A）。
    1. 用铝箔包裹未接受光照的对照组培养板。该培养板应同时包含未注射和已注射的胚胎。确保铝箔完全覆盖培养板，并注意避免撕裂。将该培养板置于28 °C光照箱的下层搁板上（图2A）。
    2. 将接受光照的培养板置于28 °C光照箱的上层搁板上（图2A）。确保培养皿盖已盖好，以防止胚胎培养基蒸发。打开蓝光光源（45 W/m2的辐照度可有效激活信号通路）。
    3. 关闭光照箱门，以避免环境光意外照射。如需要，可在关闭箱门前将记忆卡式温度计放入光照箱内。在受精后1天（dpf；见步骤5.1）进行表型评分前，不得打开箱门。
  3. 进行免疫荧光染色实验时，从约40%上胚层形成阶段（56，约6 hpf）开始对胚胎进行20分钟蓝光照射，并在光照结束后立即与未照射对照组一同固定（图3B）。在40%上胚层形成阶段进行20分钟蓝光照射可稳定激活信号通路。
    1. 约1.5 hpf时，分别用铝箔包裹接受光照和未接受光照的培养皿。确保培养皿被完全覆盖，并注意避免铝箔破损。留出一个作为参照的培养皿不包裹。将包裹好的培养皿和未包裹的参照培养皿一同放入28 °C光照箱中（图2A）。此时暂不开启LED光源。
    2. 若测试多种mRNA注射剂量，对于未接受光照的条件，应将不同注射剂量的胚胎分别分选至不同的琼脂糖包被的6孔板中，以减少后续固定过程中意外的光照暴露。
    3. 关闭光照箱门，以避免环境光意外照射。
    4. 将甲醛储备液用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至4%，并分装1 mL至预先标记的2 mL圆底微量离心管中，每种实验条件对应一管。4 °C保存备用。
    5. 约5 hpf时，取出含有未注射胚胎的参照培养皿，使用体视显微镜评估其发育阶段。参照胚胎的发育阶段应能反映包裹培养皿中光敏感胚胎的发育状态。
    6. 同时取出包裹的培养皿，使所有培养皿处于相同温度环境。重复此操作，直至参照胚胎达到40%上胚层形成阶段（约6 hpf）。胚胎发育进程对温度敏感54；因此，培养皿在培养箱外停留时间越长，胚胎达到40%上胚层形成阶段所需时间也越长。
    7. 当参照胚胎达到40%上胚层形成阶段后，打开接受光照组培养皿的铝箔，将其置于光照箱上层搁板上（图2A）。未接受光照的培养皿保持铝箔包裹状态，并置于下层搁板。立即开启蓝光光源，关闭箱门，并设定20分钟计时器（45 W/m2的辐照度可有效激活信号通路）。
    8. 为固定做准备，应尽可能减少环境光（关闭窗帘、关闭顶灯、关闭屏幕等）。确保含甲醛的离心管已正确标记。在固定前立即从4 °C取出含甲醛的离心管，并放置在光照箱旁备用。
    9. 对时间和光敏感的步骤。在20分钟光照结束时应迅速操作。20分钟后，打开光照箱门，取出未接受光照的培养皿。
    10. 使用火焰抛光的玻璃移液枪头，快速而轻柔地将光敏感胚胎转移至已准备好的含4%甲醛的对应离心管中。
    11. 尽量缩短光敏感胚胎的转移时间（<45 s），以避免意外的光照暴露。确保移液枪头内无气泡。空气暴露会导致去壳胚胎死亡。
    12. 将胚胎排入甲醛时，将玻璃移液枪头浸入甲醛溶液中，让胚胎自然沉入液体。通过将胚胎保持在枪头末端，尽量减少随胚胎带入甲醛中的培养基量。
    13. 胚胎转移完成后，将移液枪头放回原孔中，反复吹打以清除可能残留的胚胎。此举可防止多个实验条件的胚胎意外混入同一离心管中。
    14. 立即对未接受光照的未注射胚胎重复步骤4.3.11–4.3.13，随后对接受光照的胚胎（包括注射和未注射的）进行相同操作。
    15. 将固定的胚胎于4 °C过夜保存。

5. 实验评估

  1. 表型评分与成像
    1. 在受精后1天（dpf），理想时间为24–32小时（hpf）之间，将胚胎从光源箱中取出，使用解剖显微镜评估表型，并建立评分标准。此时为实验终点，无需再担心意外光激活问题。
    2. 为方便起见，可在胚胎仍处于卵膜内时进行评分。使用移液器或探针移动胚胎，以便从多个角度观察。
      1. 经历BMP信号过度激活的胚胎将出现不同程度的腹侧化表型，具体特征详见Kishimoto et al. 199746（图4A，左图）。经历Nodal信号过度激活的胚胎则会出现与中内胚层过度发育相关的一系列发育缺陷（图4A，右图）1,3,47,57,58,59,60。此类胚胎常在1 dpf时已发生裂解。
    3. 对所有实验条件下的每个胚胎进行评分（图4B）。获取每孔中所有胚胎的概览图像。如需要，可去除卵膜，并在甲基纤维素中对具有代表性的单个胚胎进行成像（图4A）。
  2. 免疫荧光染色与成像
    1. 将胚胎在4%多聚甲醛中于4 °C过夜孵育后，去除多聚甲醛，并用含Tween20的1×磷酸盐缓冲液（PBST）清洗3–5次。去除PBST后加入100%甲醇。
    2. 盖紧管盖，轻轻颠倒混匀，使残留的PBST与甲醇充分混合。用甲醇清洗2次，随后于-20 °C保存，可保存至少2小时至数年。
    3. pSmad1/5/9（BMP）免疫荧光染色方案参见Rogers et al.38；pSmad2/3（Nodal）免疫荧光染色方案参见van Boxtel et al.17 和 Rogers et al.47。
    4. 使用具备光学切片能力的显微镜（如共聚焦显微镜或光片显微镜）对免疫荧光染色后的胚胎进行成像。避免信号饱和，并确保使用同一抗体染色的所有样品保持一致的成像条件。
    5. 建议在完成免疫荧光染色后的5天内完成成像，因荧光信号可能随时间逐渐减弱。

结果

此处所述的两个对照实验的目的是确定 bOpto-BMP/Nodal 在蓝光照射下是否能够按预期激活各自通路，而在无光照条件下不影响信号传导。请在将 bOpto-BMP/Nodal 应用于您感兴趣的研究问题之前，使用这些对照实验在您的实验室中建立适当的实验流程。

表型分析实验仅需2天即可完成，可有效指示信号通路活性及光毒性（图3A）。注射后经蓝光照射的胚胎应表现出BMP信号过度激活的表型（腹侧化46；图4A，左图）或Nodal信号过度激活的表型（与中胚层和内胚层过度发育相关的发育异常1,3,47,57,58,59,60（图4A，右图））。若注射后经光照的胚胎未出现预期表型，应检测mRNA质量，尝试增加注射量，并仔细检查光照方案，确保持续暴露于强光下（波长约为450 nm、辐照度为45 W/m2的光照应能显著激活信号通路）。相反，注射但未接受光照的胚胎应与未注射的同胞胚胎外观一致。若注射但未光照的胚胎出现表型，应减少mRNA注射量，并重新评估实验设置，确保未光照组胚胎完全避光。如图4B所示，在使用适当mRNA剂量和光照条件的典型表型实验中，注射并接受光照的胚胎表现出明显的信号激活，而仅少数注射但未光照的胚胎出现表型。

表型分析实验还提供了评估光毒性的机会。如果光毒性可忽略不计，未注射且经光照的胚胎应表现为野生型，与未注射且未受光照的胚胎相似。如果未注射但经光照的胚胎出现缺陷，而未注射且未受光照的胚胎则无此现象，则应考虑降低光照强度。45 W/m2 的光照强度能够有效激活信号通路，同时无明显光毒性。如图4B所示的数据表明，未注射且经光照的胚胎与未注射且未受光照的胚胎之间无显著差异，说明光毒性可忽略不计。

尽管免疫荧光检测相比表型分析（2天）需要更多的时间和工作量（约1周），但免疫荧光染色能够直接反映信号通路的活性，并可能揭示出那些在整体形态上无法体现的细微信号变化。免疫荧光检测对于评估bOpto-Nodal的响应尤为重要，因为过量的Nodal信号通常会导致胚胎在1 dpf时发生裂解——这一现象可能由多种原因引起——而相比之下，过量BMP信号的特征性表现则是特异性的腹侧化表型46（图4A）。与未注射但接受蓝光照射的胚胎相比，注射后并暴露于蓝光的胚胎应表现出Smad1/5/9或Smad2/3磷酸化水平的均匀升高。如果磷酸化水平未升高或仅轻微升高，应检测mRNA的质量，考虑增加注射量，并仔细检查光照处理方案。在约40%包被期时，以约45 W/m2的辐照度进行20分钟的蓝光照射，应能显著激活信号通路。如果pSmad染色分布不均，可尝试将mRNA注射至细胞中心（而非卵黄部分），这可能有助于实现更均匀的mRNA分布。

注射后未暴露于光的胚胎，其pSmad水平应与未注射的胚胎相当。据观察，使用bOpto-Nodal时Smad磷酸化泄漏现象比bOpto-BMP更明显。若注射后未暴露于光的胚胎中pSmad水平升高，应减少注射的mRNA用量。此外，需重新评估实验设置，以确保：1）未暴露组胚胎未意外接触光照；2）固定过程中的光照暴露最小化。在固定步骤中，从光照箱中取出胚胎至浸入甲醛之间的间隔时间不得超过45秒。同时，在此步骤中应通过关闭窗帘、关闭白光光源、使用红光照明，或用蓝色光阻断凝胶滤光纸覆盖白光光源，以尽量减少环境光和日光的暴露（材料表）。

图4C中的数据显示了在适当的mRNA量和光照条件下进行的典型免疫荧光染色实验结果：未注射且未曝光胚胎中的pSmad水平相似，而注射后并接受光照的胚胎则表现出更高的Smad磷酸化水平。

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图1：bOpto-BMP 和 bOpto-Nodal 信号激活策略。（A）内源性 BMP 信号通路通过 BMP 配体结合而被激活，导致 I 型/II 型受体复合物的形成、Smad1/5/9 的磷酸化以及 BMP 靶基因的表达。I 型受体 BMPR1aa 和 Acvr1l 分别也称为 Alk3 和 Alk8。BMPR2a 是一种 II 型受体。（B）bOpto-BMP 构建体38。来自 BMPR1aa 和 Acvr1l 的假定激酶结构域与 LOV 融合；BMPR2a-LOV 融合蛋白包含假定激酶结构域和受体 C 末端结构域（CTD）。所有融合蛋白均通过肉豆蔻酰化基序（Myr）靶向定位于细胞膜。结构域之间由甘氨酸-丝氨酸（GS）连接子分隔。构建体在 CTD 末端带有 HA 表位标签。这三种构建体的组合被发现可最有效地激活 BMP 信号。（C）bOpto-BMP 介导的 BMP 信号激活。在蓝光照射下，LOV 结构域发生二聚化，被认为可触发复合物形成并激活信号传导。（D）内源性 Nodal 信号通路通过 Nodal 配体结合而被激活，导致 I 型/II 型受体复合物的形成、Smad2/3 的磷酸化以及 Nodal 靶基因的表达。I 型受体 Acvr1ba 和 II 型受体 Acvr2ba 分别也称为 Acvr1b 和 Acvr2b。（E）bOpto-Nodal 构建体39。来自 Acvr1ba 和 Acvr2ba 的假定激酶结构域与 LOV 融合。所有融合蛋白均通过肉豆蔻酰化基序（Myr）靶向定位于细胞膜。结构域之间由 GS 连接子分隔。构建体在 CTD 末端带有 HA 表位标签。（F）bOpto-Nodal 介导的 Nodal 信号激活。在蓝光照射下，LOV 结构域发生二聚化，被认为可触发复合物形成并激活信号传导。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：用于光遗传学实验的温控光照箱。（A）使用定制的LED支架将LED微孔板照射仪安装在培养箱顶部。第一层架子上的6孔板中的斑马鱼胚胎通过在培养箱顶部钻出的孔洞接受光照。下层架子上放置另一组未受光照的对照组胚胎，置于用铝箔包裹的6孔板中。培养箱门内侧加装密封条，以防止室内光线或阳光意外照射。（B）使用阶梯钻在培养箱上钻孔的操作细节。此处使用的培养箱型号具有内层挡板，因此需要再钻一个更大尺寸的孔（见材料表）。（C）为三波长照明系统设计的定制LED支架细节。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：bOpto-BMP/Nodal 实验流程。 通过表型分析和 pSmad 免疫荧光染色检测 bOpto-BMP/Nodal 的活性。在单细胞阶段向胚胎注射 mRNA，并于受精后 1.5 小时（hpf）内将其转移至光照箱中。(A) 表型分析。将注射与未注射的同胞胚胎分别在黑暗环境中培养，或从 1.5 hpf 开始接受均匀蓝光照射，直至受精后 1 天（dpf）。通过评估胚胎是否出现与通路过度激活一致的表型，来判断光遗传信号活性。(B) pSmad 免疫荧光染色。将注射与未注射的胚胎在黑暗中培养至 40% 包被期（约 6 hpf）。随后，将一半注射胚胎和一半未注射胚胎暴露于均匀蓝光下 20 分钟。光照结束后，所有胚胎均进行固定，并进行 pSmad 免疫荧光染色。pSmad1/5/9 或 pSmad2/3 水平升高分别反映 BMP 或 Nodal 信号通路的光遗传学激活。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图 4：在斑马鱼胚胎中评估光激活的信号响应。 在单细胞阶段向斑马鱼胚胎注射编码 bOpto-BMP/Nodal 的 mRNA。(A) 胚胎在黑暗中培养，或从受精后 1.5 小时（hpf）开始暴露于均匀的蓝光下。在受精后 1 天（dpf）对表型进行评分。图中显示代表性表型。BMP 信号过强导致腹侧化（左图），而 Nodal 信号过强则引起与额外中胚层-内胚层相关的发育缺陷（右图）。比例尺 = 500 µm。(B) 表型定量分析。将注射过 mRNA 的胚胎与其未注射的同胞胚胎均从 1.5 hpf 开始在黑暗中培养（黑色灯泡）。其中一半注射胚胎和一半未注射胚胎暴露于均匀蓝光（蓝色灯泡）。(C) 注射胚胎与其未注射的同胞胚胎均从 1.5 hpf 开始在黑暗中培养（黑色灯泡）。在 40% 上包期（约 6 hpf）时，将一半注射胚胎和一半未注射胚胎暴露于均匀蓝光（蓝色灯泡）。20 分钟后，固定所有胚胎，并对磷酸化 Smad1/5/9 或 Smad2/3 进行免疫荧光染色。较高的 pSmad 信号强度分别表示 BMP/Nodal 信号增强。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：光源箱完整组装 3D PDF 文件，展示光源箱完整组装的三维视图。请点击此处下载该文件

补充文件 2：光源箱爆炸图。 3D PDF 文件，展示光源箱组件的三维爆炸视图。请点击此处下载该文件。

补充文件 3：大型光源垫圈。 用于通过激光切割机制作 LED 固定座的大型光源垫圈的 CAD 绘图文件（.DWG 格式）。请点击此处下载该文件。

补充文件 4：小型导光垫片。 用于通过激光切割机制作 LED 固定座小型导光垫片的 CAD 绘图文件（.DWG 格式）。请点击此处下载该文件。

补充文件 5：亚克力平台底座。 用于通过激光切割机制作 LED 支架亚克力平台底座的 CAD 绘图文件（.DWG 格式）。请点击此处下载该文件。

补充文件 6：亚克力垂直平台。 用于通过激光切割机制备 LED 支架亚克力垂直平台的 CAD 绘图文件（.DWG 格式）。请点击此处下载该文件。

补充文件 7：左侧亚克力支撑架。 用于通过激光切割机制作 LED 固定座左侧亚克力支撑架的 CAD 绘图文件（.DWG 格式）。请点击此处下载该文件。

补充文件 8：亚克力右侧支撑件。 用于通过激光切割机制作 LED 固定座亚克力右侧支撑件的 CAD 绘图文件（.DWG 格式）。请点击此处下载该文件。

讨论

目前将bOpto-BMP/Nodal递送至斑马鱼胚胎的策略是mRNA注射法。该方法存在若干缺点。首先，不同实验室所使用的mRNA用量存在差异。所用mRNA的量应足以在光照条件下 robust 地激活信号通路，同时避免在无光条件下发生非预期的激活。建议测试多个不同剂量以确定最佳mRNA浓度，一旦确定后，可制备主混合液的分装样品，以确保每次实验中mRNA用量的一致性。其次，注射的mRNA分布不均可能导致信号激活不均匀。将mRNA注射至细胞中心（而非卵黄部分）被认为有助于实现更均匀的mRNA分布。最后，由于注射的mRNA会随时间降解，该方法可能不适用于较晚期胚胎的实验。未来可通过构建稳定表达bOpto-BMP/Nodal的转基因斑马鱼品系来解决上述问题，例如使用母源性或药物诱导型启动子实现广泛表达。尽管在此背景下操作可能对光敏感的成年斑马鱼会带来一定挑战，但已有成功构建表达光遗传学工具的斑马鱼61,62以及Drosophila22,34,35,63转基因模型的先例。

避免意外的光激活是光遗传学工具应用中的一个普遍挑战。为简便起见，应将注射后发育超过1.5 hpf的胚胎视为对光敏感。通常只需用铝箔包裹培养板或培养皿，即可避免不必要的光照。然而，对于需要对发育超过1.5 hpf的活体胚胎进行视觉观察的实验，可以使用红光光源，或在白光光源上覆盖廉价的凝胶滤光纸，以阻隔能够诱导LOV结构域二聚化的波长（材料表）。

本文所述的光箱专为需要精确控制光照强度、动态变化和波长的应用而设计（图2）。该光箱的其他优势包括光照均匀、样品意外加热可忽略不计、可容纳多个6孔板的充足空间，以及寿命长、光谱特性明确的光源。然而，根据具体研究应用的不同，可能更适合采用其他光照策略。许多实验室已开发出更简单、成本更低且占用空间更小的均匀光照系统，例如在培养箱内壁安装LED灯带、将LED面板悬置于样品上方，或将LED集成于培养皿盖中32,38,39,40,64,65,66。需要特别指出的是，本实验方案中使用的光箱不允许用户独立调控各个孔（与Bugaj等52的方法不同），也无法实现光照的空间控制。利用激光在SPIM或共聚焦系统中，已分别通过bOpto-BMP38和bOpto-Nodal39实现了空间定位的光遗传学激活，并且在多种模型系统中，已有许多其他光遗传学策略实现了类似效果（详见Rogers和Müller12的综述）。某些方法甚至达到了亚细胞水平的空间分辨率29,30,31。尽管空间定位光照系统的构建不在本实验方案的范围之内，但理论上使用数字微镜装置或掩膜方法等专用设备，仍可对bOpto-BMP/Nodal进行空间激活实验。建议读者在确定光照策略前，先广泛查阅有关用于光遗传学实验的DIY光箱的文献资料（例如Gerhardt等51、Bugaj等52、Kumar和Khammash53，以及更多资源见 https://www.optobase.org/materials/）。

与传统的突变体、异位基因表达、重组蛋白和药物等方法相比，分子光遗传学策略通常能够对生物过程实现更高程度的时空控制。对光遗传学方法优势感兴趣的读者可参考斑马鱼及其他生物中已发表的其他可用工具。这些工具包括用于操控其他信号通路32,65,67,68、调控基因表达61,64,66,69,70,71、改变蛋白质定位31,72以及激活细胞凋亡62的工具。这些及其他众多工具已被系统性地收录于OptoBase——一个经过审校的分子光遗传学策略网络资源库28。对于希望开发新型光遗传学工具的研究者，该资源库还提供了已被广泛应用于多种策略中的光响应蛋白的有用信息，其中包括响应绿光、红光和近红外光波长的光响应蛋白。我们期待科学界充分发掘分子光遗传学方法的全部潜力。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本方案的资金由NICHD院内项目提供给KWR（ZIA HD009002-01）。我们感谢Jeff Farrell及其实验室提供的富有启发性的反馈，感谢Will Anderson提供的出色技术支持，感谢Leanne Iannucci对本方案进行压力测试并测量辐照度，同时感谢美国国立卫生研究院共享斑马鱼设施团队为保持斑马鱼健康所付出的辛勤努力。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
搭建一个光盒 &和 光照方案
#8 × 1" 六角自钻螺钉McMaster-Carr99663A2221.4.5
数字式光功率和能量计ThorLabsPM100D1.7
4
培养箱（142 升）Boekel Scientific1394001.3.1
孵育箱面板安装（1/4" 厚铸黑色丙烯酸板定制部件 / 皮埃蒙特塑料培养箱面板1.4.4
大号HSS螺旋槽阶梯钻头CO-ZSDB0001TA1.3.2
LED镜头垫圈，培养箱垫圈；1/32" 厚黑色硅胶McMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
LED 微孔板照射仪PrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 10毫米立方间隔柱Newark Eletronics005.60.5331.4.1
M3 × 10 mm 316SS 平头螺钉McMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 × 10 mm 316SS 平头螺钉McMaster-Carr91801A3051.4.3
存储卡温度计Fisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
显微镜载玻片功率计传感器探头（150 mW）ThorLabsS170C1.7
4
红色凝胶滤光纸 #E106罗思科 / B&H Foto &电子与电气工程110084014805-E1064.2.1
侧支架（1/4）" 厚铸黑色丙烯酸定制部件 / 皮埃蒙特塑料侧支架1.4.2
垂直支架（1/4" 厚铸黑色丙烯酸定制部件 / 皮埃蒙特塑料竖直括号1.4.1
密封条：轻型三元乙丙橡胶泡沫，1/2" wd 1/4" tkMcMaster-Carr8694K121.8
制备 mRNA
EZNA MicroElute Cycle Pure 试剂盒OmegaD6293-022.4
GeneJET 质粒小提试剂盒（250 次反应）赛默飞世尔科技K05032.2
微型样品孵育器（Hybex）SciGene1057-30-02
微型样品孵育器 1.5 ml 离心管模块（Hybex）SciGene1057-34-02
Nanodrop One 分光光度计赛默飞世尔科技ND-ONE-W2.4
NotI-HF 限制性内切酶New England Biolabs (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene2076152
pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
RNeasy Mini Kit（250 次反应）Qiagen741062.3
注射 mRNA
琼脂糖（UltraPure）Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
250 ml 玻璃烧杯FisherbrandFB1002503.3.2
6 孔板（每箱 50 个）猎鹰08 772 1B3.1.6
B-8A 球形关节NarishigeB-8A3.3
背压装置（显微注射设备组件）Applied Scientific Instrumentation (ASI)BPU3.3
脚踏开关（显微注射装置组件）Applied Scientific Instrumentation (ASI)FWS3.3
GJ-1 磁力架NarishigeGJ-13.3
玻璃毛细管（4 英寸，外径 1 mm，带丝）World Precision Instruments1B100F-43.1.11
玻璃培养皿底部（用于去壳）派热克斯08-748A3.3.2
玻璃移液管（5 3/4）" （宽头）Kimble-Chase63A53WT3.1.9
注射皿模具自适应科学工具tu13.1.3
IP 铁板Narishige免疫沉淀3.3
M-152 微操作器NarishigeM-1523.3
微移液管固定器套件（显微注射装置组件）Applied Scientific Instrumentation (ASI)MIMPH-MPIP-试剂盒3.3
微米Meiji Techno AmericaMA2853.3
MPPI-2 压力注射仪（显微注射装置组件）Applied Scientific Instrumentation (ASI)MPPI-33.3
拉针仪World Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
培养皿（100 mm × 15 mm，每箱500个）猎鹰08-757-100D3.1.2
移液器（10 ml，绿色）Bel-ArtF37898-00003.3
蛋白酶K罗氏114596430013.3.2
挤压瓶（500 ml）Nalgene / Thermo Scientific2402-05003.3

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