本文介绍了大规模人工饲养巴西黄蝎（Tityus serrulatus Lutz 和 Mello，1922）的成功维持与毒液提取方案，旨在为后续抗蛇毒血清的生产提供毒液，以满足巴西卫生系统的需求。
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摘要
摘要
蝎子蜇伤是多个热带和亚热带国家面临的公共卫生问题。Tityus serrulatus Lutz 和 Mello，1922（巴西黄蝎）每年在巴西造成约15万例中毒病例，其中10%需要抗蛇毒血清治疗以逆转危及生命的毒液效应。因此，数千只T. serrulatus个体在受控的人工饲养条件下被维持，用于毒液采集，随后用于全国蝎毒抗毒血清的生产。布坦坦研究所是巴西主要的抗毒血清生产实验室，每年为巴西卫生系统提供约7万瓶蝎毒抗毒血清。因此，饲养管理规范和毒液采集方法是实现大规模、标准化毒液生产成功的关键环节。本文旨在描述T. serrulatus的人工饲养规范，涵盖日常饲养管理和毒液采集操作流程，遵循良好生产规范，并保障动物福利。这些实践使得最多可维持2万只蝎子的人工饲养，根据抗毒血清生产需求，每月常规采集3,000至5,000只蝎子的毒液，平均采毒成功率达到90%。
引言
蝎子是节肢动物门蛛形纲蝎目下的物种，该目包含约2,621个物种1,2这些动物具有广泛的地理分布，除南极洲外，各大洲均有分布。1蝎子蜇伤每年在全球范围内导致数千人患病或死亡3据估计，2019年因这些动物导致的事故超过120万起，每年死亡人数达3,500人。在巴西，相关病例数量呈指数级增长，自2017年以来每年已超过10万例。4,5,6过去几十年中，巴西在缺乏 adequate 污水处理以及 regular 垃圾收集与处置的情况下出现了无序的城市化，加之环境退化和气候变化，为入侵性 scorpion（如）的大量繁殖提供了条件 T. serrulatus 增加与人类的接触，从而导致有害事故4,7,8巴西约有178种蝎子，但具有医学重要性的蜇伤主要由属级分类单元 Tityus 四个物种（T. serrulatus，T. bahiensis, T. stigmurus 和 T. obscurus)具有医学重要性，与 Tityus serrulatus 导致最严重病例和死亡7,9.
布坦坦研究所是巴西主要的抗蛇毒血清生产实验室，每年为巴西卫生系统提供约 70,000 瓶蝎子抗毒血清。简而言之，抗毒血清的生产步骤包括将来源于毒液的抗原接种到马体内，收集并纯化富含抗体的血浆，最终制成每瓶 5 mL 的蝎子抗毒血清。每瓶抗毒血清至少能够中和 1 mg 的蝎毒，即每毫升抗毒血清可中和 1 mg 蝎毒。节肢动物饲养中心是该工业中心的重要组成部分，负责为蝎子抗毒血清的生产提供原料来源。
位于布坦坦研究所的节肢动物养殖中心最初名为节肢动物实验室，成立于1967年。然而，直到1995年，该实验室才迁入专用于饲养有毒节肢动物的独立设施10,11。当时，蝎子被饲养在一个面积为12 m2的房间内，无温度控制，分布在约13个饲养箱中，每个饲养箱最多容纳300只动物10。由于多年来对毒液的需求不断增加，导致需要扩大动物饲养数量，同时毒液提取工艺也得到改进，因此在2016年发生了一次重大变革：实验室被整合进布坦坦研究所的工业中心，并更名为节肢动物养殖中心。此外，2016年养殖中心迁至新建的专用设施。新的蝎子饲养室面积达24 m2，设有约48个聚丙烯材质的饲养箱，每个饲养箱最多可容纳300只动物，如图1所示。因此，在受控的人工饲养条件下，全年维持饲养的个体总数在10,000至20,000只之间，数量随季节有所波动。这些蝎子在严格的饲养管理规程下进行精心管理，以保障其福利，同时满足高产量需求，并遵循动物护理的良好实践和伦理标准。为进行毒液提取，专门设计并建造了一个独立房间，内设两个气流柜，如图2A所示。这些气流柜作为安全措施，可防止技术人员在提取过程中吸入毒液颗粒。技术人员必须佩戴个人防护装备（PPE），包括合成围裙和FFP2口罩，以避免任何污染并确保其安全。
图 1：节肢动物饲养室中蝎子饲养区的总体布局。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：工作区域。（A）节肢动物饲养室毒液提取房间的总体视图。（B）气流柜工作台面。所有材料和设备均已准备并放置在气流柜工作台面上。黑色箭头指示电刺激仪装置，红色箭头指示镊子。请点击此处查看该图的放大版本。
节肢动物饲养室中约90%的T. serrulatus蝎子来自不同采集地点，由市政卫生人员作为此类动物监测与控制项目的一部分在城市地区捕获后，送至布坦坦研究所合作项目。T. serrulatus蝎子为孤雌生殖，即后代由未受精卵发育而来，无需异性个体参与12。由于这种繁殖方式，部分个体在本机构人工饲养条件下出生，并按照如下所述相似的饲养方案培育至成虫阶段。一旦达到成虫期，即纳入毒液采集常规流程。蝎子到达后需进行初步筛选，健康状况良好的个体按来源地分别置于集体饲养箱中，每个饲养箱最多容纳350只。每个饲养箱每日填写一份管理记录表，记录投喂日期及提供的猎物种类（蟋蟀或蟑螂）、供水情况、清洁操作、死亡个体数量以及箱内现存活体数量。
按照预先设定的计划，对动物施加电刺激，随后将数百只个体产生的毒液进行冻干处理，得到多批冻干毒液。通过该工艺获得的标准化毒液，将用于马匹免疫，作为生产过程的一部分，同时也为活性成分及终产品的质量控制提供参比物质。
全球仅有极少数机构能够在符合良好生产规范和动物伦理使用的前提下，饲养如此大量蝎子并进行大规模的毒液采集，如同布坦坦研究所节肢动物饲养中心（Arthropods Bioterium）所做的那样。因此，我们的目标是描述在T. serrulatus人工饲养过程中所采用的蝎子饲养管理方案及毒液采集操作流程，这些方法已成功提供制备蝎子抗蛇毒血清所需的足够毒液量。
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方案
涉及无脊椎动物的实验方案免于接受巴西布坦坦研究所动物使用与护理委员会的审批。然而，本文所述的蝎子饲养过程遵循伦理准则，并根据该物种的需求尊重动物福利。
1. 饲养
- 将蝎子饲养在聚丙烯材质的群居容器中作为养殖单元（高 35 cm，宽 35.5 cm，长 72 cm），每个容器最多容纳 350 只动物。
- 动物饲养室需维持在 24 °C（±0.5 °C）的受控温度下，光照周期为光照 10 小时，黑暗 14 小时。
- 在每个容器的底部（地面）铺设牛皮纸，并用美纹纸胶带在四周固定边缘，防止动物钻入纸下（图 3A）。
- 在容器一侧垂直堆叠四个纸板托盘（蛋托），每层托盘之间插入一块硬纸板作为分隔（图 3B，C）。
- 在容器的另一侧放置一个浅的聚丙烯托盘（饮水盘），内含浸水棉球作为动物的水源（图 3B）。
- 容器不加盖以增强空气流通。在容器内壁顶部及上部角落处粘贴约 10 cm 宽的自粘塑料胶带条，使壁面足够光滑，防止动物逃逸（图 3A）。
图 3：饲养环境与围栏的准备。（A）箭头指示底部的牛皮纸，边缘处用美纹纸胶带固定；虚线表示贴在围栏内表面顶部的自粘塑料胶带。（B）垂直基质（蛋盒堆叠在容器一侧）以及对侧放置的浅层聚丙烯托盘（水盘）。（C）垂直基质细节：在两个蛋盒之间插入硬纸板片堆叠而成。（D）纸板片与蛋盒分层放置，模拟 T. serrulatus 天然的阴暗潮湿生境。（E）动物已安置于基质中。请点击此处查看该图的高清版本。
2. 卫生常规
注意：卫生管理程序分为两种维护操作：完全维护和部分维护。完全维护在动物喂食后2天进行，或在选择饲养箱进行毒液提取时进行；部分维护则在未给动物喂食时进行。
- 完全维护
- 按照第1节所述，准备一个带有新垫材（鸡蛋托、纸板和牛皮纸）和清洁水盘的干净饲养箱。
- 使用长柄镊子将水盘从饲养箱中取出。如果水盘上有任何蝎子，将其移出并放入干净的饲养箱中。
- 对所有鸡蛋托和纸板片重复步骤2.1.2中所述的相同操作，移出所有蝎子并将其放入干净的饲养箱中。
- 移出托盘后，将饲养箱底部残留的所有蝎子移出并放入干净的饲养箱中。务必清点任何尸体并妥善丢弃。收集所有剩余的活体猎物（昆虫）并从饲养箱中移除。
- 将所有一次性垫材（鸡蛋托、纸板片和牛皮纸）从饲养箱中移除并妥善丢弃。将可重复使用的物品（水盘和聚丙烯容器）送至消毒处理。
注意：可重复使用物品的消毒使用0.5%次氯酸盐结合中性洗涤剂进行。使用任何消毒产品或溶液后，必须用流动水对材料进行彻底且充分的冲洗。
- 部分维护
注意：部分维护包括检查所有垫材（鸡蛋托和牛皮纸），以移除死亡蝎子的尸体和其他不需要的杂物，但不丢弃垫材或更换饲养箱。- 使用长柄镊子进行检查，轻轻抬起每个鸡蛋托并清除废弃物。
- 如有需要，用干净的鸡蛋托替换一个或多个脏的鸡蛋托。
- 使用长柄镊子将水盘完全更换为清洁的水盘。将水盘上的任何蝎子转移到饲养箱其他位置的鸡蛋托上。
3. 喂养
- 根据取毒时间表每15天喂养动物一次。在取毒前7天和取毒后7天内，对将要取毒的动物进行喂食。
- 喂食时，交替提供蜚蠊（Phoetalia pallida）和蟋蟀（Gryllus sp.）。
- 根据动物的能量摄入量计算食物数量；每个饲养容器中每3至5只蝎子提供1只猎物。
- 统计计算好的猎物数量，并将其活体放入饲养容器内，在完成全部维护操作（第2.1节）前放置2天。
- 投喂蜚蠊时，需在饲养容器顶部周围涂抹含酒精的碳酸钙溶液。该溶液可使蜚蠊打滑，无法攀爬容器侧面，从而防止昆虫逃逸。
4. 蛇毒提取
注意：用于毒液提取的动物为成年或亚成年个体。由于难以确定巴西黄蝎（成年阶段）的完全性成熟状态，因此规定体长为 5 至 7 cm 的个体可进行该操作。
- 每 2-3 个月对每只动物进行一次取毒。
- 在取毒当天，清点饲养箱内所有存活的动物，并使用长镊将其转移至玻璃容器中（图 4）。
- 将所有待用的材料和设备准备并摆放于生物安全柜工作台面上。将电刺激仪电源线插入电源插座，并打开电刺激仪和生物安全柜（图 2B）。
- 使用以下电刺激参数设置：电位（电极间电位差）：540 mV，脉冲时长（电脉冲持续时间）：2 ms，作用模式（调节输出强度的间歇模式，可减少尾刺有机组织的发热）：70%，周期（调节循环重复频率）：1 s，电流强度（流经动物肌肉的电流）：0.75 mA。
- 手动固定每只动物，使其尾刺保持静止，操作步骤如下：
- 用直镊夹住动物的后体部（metassoma）（图 5A）。
- 用弯镊固定尾刺（图 5B）。
- 用手固定尾刺（图 5C、D）。
- 固定后，将尾刺直接接触电刺激仪的导电电极，无需使用导电溶液。电刺激会引起毒腺肌肉的非自主性收缩，从而导致毒液排出。
- 将排出的毒液液滴直接收集至靠近电刺激仪电极的塑料微量离心管中（图 6）。
- 随后将动物放回玻璃容器中，操作步骤如下：
- 将动物的尾刺从手部转移至弯镊上。
- 轻柔地将动物放置于玻璃容器底部。
- 对玻璃容器中的每只动物重复执行步骤 4.4–4.7。
- 当玻璃容器中所有动物完成取毒后，将其重新放回饲养箱中。
- 将收集的毒液在 -20 °C 下保存，直至进行冻干处理。
图 4：玻璃容器中的蝎子。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：毒液采集时的固定操作流程。（A）用直头镊子夹住尾部（黑箭头所示）。（B）用弯头镊子固定毒针（黑箭头所示）。（C）将被镊子夹住的毒针转移至手中固定。（D）用手固定毒针。建议徒手操作，因为佩戴手套时，蝎子可能用其螯肢抓住手套材料，导致操作结束后难以释放，并显著增加意外发生的风险。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：毒液提取。 一个塑料微量离心管（白色箭头）放置在电刺激器（黄色箭头）附近。毒液液滴直接收集到在操作过程中保持室温的离心管中。 请点击此处查看此图的放大版本。
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结果
为确保技术人员操作的可重复性以及符合质量参数要求，每项操作均制定了三十项标准操作程序（SOP）。提取操作后的平均死亡率约为12%，考虑到电刺激常规操作及圈养环境，该数值可视为较低，因为通过实施这些程序已成功降低了应激因素。
为了保持动物的健康，将一个覆盖有棉花并加水的托盘放置在箱体的一端，而在另一侧则分层放置纸板片和鸡蛋托盘，以模拟T. serrulatus天然的阴暗潮湿生境（图3D、E）。上述基质已被证明在有限空间内饲养大量动物方面效果良好，能够提供充足的遮蔽和活动空间，从而保障其福利。
每年，T. serrulatus 的毒液产量超过80克液态毒液，相当于超过13克的冻干毒液。我们一直在收集生产指标，例如每只动物平均采毒量、动物数量以及每月获得的毒液量，这些数据在表1、图7、
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讨论
采用所述方法可使我们长期饲养大量T. serrulatus个体，并能稳定预测每年毒液生产所需的蝎子数量。通过这种方式，我们能够提前提供足量的毒液批次，以满足抗蛇毒血清的生产需求。同时，制定固定的饲养、喂食和取毒时间表是日常工作的关键环节，有助于严格遵循既定的操作规程。因此，建立规范化的工作流程对于维持持续生产至关重要。
据作者所知，目前尚无科学描述的关于以毒液生产为目的的蝎子人工饲养方案。因此，本文所述方法的开发与应用旨在提供一种高效且成功的方案，以实现较高的生产数量，如本文所述。本文所提出的毒液提取方案与其他先前描述的方法有所不同，其开发目标是尽可能简化操作流程，以满足获取大量毒液的需求。因此，该方法可在短时间内对大量动物进行提取，从而获得抗蛇毒血清生产所必需的可观毒液量。需要强调的是，参与毒液提取过程中动物操作的技术人员均经过严格培训。
图示展示了表1中的数据，表明从2012年到2022年，由于年份与每只动物提取的冻干毒液、每月提取的冻干毒液以及每月采集的蝎子数量之间存在...
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披露
作者声明无利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纸板片 | NA | NA | |
| 蛋托 | NA | NA | 36格纸质蛋托 |
| 电刺激装置 | Instituto Butantan | ART-FV-01 | 内部设计用于毒液提取 |
| 牛皮纸 | NA | NA | 普通牛皮纸 |
| 美纹纸胶带 | NA | NA | 白色美纹纸胶带（24 mm × 50 m） |
| 聚丙烯容器 | NA | NA | 70 L 聚丙烯箱（高 – 35 cm，宽 – 35.5 cm，长 - 72 cm） |
| 聚丙烯托盘 | NA | NA | 聚丙烯托盘（高 – 3.0 cm，宽 – 18.5 cm，长 - 30 cm） |
| 自粘性塑料膜 | NA | NA |
参考文献
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