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在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

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DOI：

10.3791/65740

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2024年5月17日

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

本文内容

摘要

我们已建立一种方法，用于评估基因工程小鼠中神经系统肿瘤是否能准确再现其人类对应疾病的病理特征。在此，我们将这些组织学技术、明确的病理学标准以及培养方法应用于P0-GGFβ3小鼠模型中发生的神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤。

摘要

患有常染色体显性遗传肿瘤易感综合征——1型神经纤维瘤病（NF1）的患者常出现丛状神经纤维瘤（PN），这些肿瘤随后可转化为高度侵袭性的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。若能获得可精确模拟人类NF1患者中PN向MPNST进展过程的基因工程小鼠（GEM）模型，将有助于深入理解PN转化为MPNST的机制。然而，现有的Nf1基因敲除GEM模型并不能完全重现这一过程。因此，我们开发了P0-GGFβ3小鼠模型，这是一种通过在雪旺细胞中过表达雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1（NRG1），从而高频率诱导PN形成并进展为MPNST的GEM模型。然而，为了确定P0-GGFβ3小鼠中肿瘤发生及恶性进展过程是否真实模拟了NF1患者体内的病理过程，我们必须首先证实P0-GGFβ3小鼠周围神经鞘瘤的病理特征与其人类对应肿瘤的病理特征一致。

本文介绍了利用P0-GGFβ3和P0-GGFβ3;Trp53+/-小鼠模型作为示例，在基因工程小鼠（GEM）模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专门方法。我们描述了用于诊断丛状神经纤维瘤（PNs）和恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）的组织学、免疫组织化学和组织化学方法，如何将这些肿瘤与其他病理表现相似的肿瘤类型相鉴别，以及如何对这些肿瘤进行分级。我们还讨论了从GEM来源的MPNSTs建立早期传代培养物的方法，利用免疫细胞化学对这些培养物进行表征，以及通过建立同种移植模型来验证其致瘤性。总体而言，这些技术可全面表征在GEM模型中出现的PNs和MPNSTs的病理特征，并对这些小鼠肿瘤与其人类对应物的病理学进行关键性比较。

引言

在过去三十年中，许多实验室尝试通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组，或过表达在人类癌症中过表达的基因产物，来构建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠（GEM）模型可用于多种目的，例如证实新引入的基因组修饰能够启动肿瘤发生、鉴定在肿瘤进展过程中继发发生的其他遗传或表观遗传改变，以及明确驱动肿瘤起始和进展的关键信号通路。与依赖免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同，GEM癌症模型具有完全功能的免疫系统，因此能更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而，在使用GEM癌症模型进行上述研究时，研究人员必须确认在GEM肿瘤中获得的观察结果与其对应的人类肿瘤具有相关性。这种验证应包括对GEM肿瘤病理学特征的全面评估，并确定GEM肿瘤的病理特征是否重现了相应人类肿瘤类型的病理表现。

肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）是影响人类神经系统的最常见遗传性疾病，其发生率约为每3,000至3,500名活产婴儿中1例1,2,3。NF1患者会在皮肤中（称为皮肤神经纤维瘤）以及大神经和神经丛中（称为丛状神经纤维瘤）出现多个良性的周围神经鞘瘤。尽管皮肤神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤均会因造成身体、行为和/或社交功能障碍而降低患者的生活质量，但丛状神经纤维瘤（PNs）尤其危险4,5。 这是因为PNs常转化为恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs），后者是一种侵袭性梭形细胞肿瘤，其生存率极低1,2。造成这种低生存率的主要原因是目前用于治疗MPNSTs的放疗和化疗方案效果不佳。然而，开发新的更有效的治疗方法一直面临挑战。这主要是因为尽管MPNSTs在NF1患者中较为常见，但总体上仍属于罕见肿瘤。因此，很难获得足够数量的人类肿瘤用于研究，也难以招募到足够的MPNST患者开展临床试验。为了克服这些局限性，研究人员已构建了多种基因工程小鼠（GEM）模型，旨在进一步揭示驱动神经纤维瘤发病机制及丛状神经纤维瘤向MPNST进展的异常机制，并推动候选治疗药物的临床前试验。

NF1 患者在 NF1 基因的一个拷贝中存在失活性突变。当施万细胞谱系中的某个细胞在另一个原本功能正常的 NF1 基因上发生失活性突变时，会触发神经纤维瘤的发生。然而令人意外的是，当构建携带生殖系 Nf1 失活性突变的小鼠时，这些小鼠并未出现神经纤维瘤6,7。随后的研究表明，当小鼠的施万细胞中 Nf1 基因完全缺失，同时其他所有细胞类型中 Nf1 呈单倍剂量不足（即 Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠）时，可发展出丛状神经纤维瘤，这提示在其他多种细胞类型中 Nf1 基因剂量的降低是神经纤维瘤发生所必需的8。即便如此，Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠中的丛状神经纤维瘤仍未能进展为恶性周围神经鞘瘤（MPNST），因此仅部分模拟了人类对应疾病的生物学特征。当 Nf1 突变与其他肿瘤抑制基因（如 Trp539 或 Cdkn2a10）的突变共同存在时，才可引发 MPNST 的发生；但在这些基因工程小鼠（GEM）模型中，MPNST 多为 de novo 发生，或起源于生物学潜能未明的非典型神经纤维瘤样肿瘤（ANNUBPs）11,12，而非由已存在的良性丛状神经纤维瘤转化而来（参见文献13,14 对这些模型的详尽综述，以及引入其他与 MPNST 相关的功能缺失突变（如 Suz12 和 Pten 基因）的其他模型15）。

这些小鼠模型对于确定NF1、TP53和CDKN2A等基因在NF1相关周围神经系统肿瘤发病机制中的作用，以及用于候选治疗药物的临床前试验具有不可估量的价值。然而，我们对丛状神经纤维瘤如何进展为生物学潜能不确定的非典型神经纤维瘤性肿瘤（ANNUBPs16），进而发展为恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的过程仍缺乏完整认识。近期有报道指出，Nf1和Arf基因缺失的小鼠可发展出ANNUBPs并进一步进展为MPNSTs，这在理解该过程方面取得了一些进展11。然而，目前尚无基于Nf1突变的小鼠模型能够完全模拟人类中所见的丛状神经纤维瘤向MPNSTs进展的全过程。此外，是否存在着多条不同的通路导致MPNSTs的发生尚不明确。因此，上述基因工程小鼠（GEMs）可能仅模拟了导致神经纤维瘤向MPNSTs进展及MPNST发病的多种不同通路中的某一部分。这一点由以下事实进一步强调：MPNSTs也可散发发生，且部分散发性MPNSTs显然并不携带NF1突变17,18。

尽管 Magollon-Lorenz 等人最近提出，至少部分缺乏 NF1 突变的散发性恶性周围神经鞘瘤（MPNST）实际上是黑色素瘤或另一种类型的肉瘤19，但我们近期报道了一例散发性 MPNST 及其来源的细胞系（2XSB 细胞），该肿瘤为 NF1 野生型20。在对原发肿瘤及 2XSB 细胞系进行特征分析过程中，我们系统性地排除了其他可能的诊断，包括黑色素瘤以及在散发性恶性周围神经鞘瘤鉴别诊断中常规需考虑的多种其他肉瘤类型20。此外，我们注意到 Magollon-Lorenz 等人承认，他们在所研究的三株散发性 MPNST 细胞系中的发现并不能推广至所有被鉴定为散发性 MPNST 的肿瘤，即不能据此推断所有此类肿瘤均非 MPNST。

为了构建一种神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）发病机制不一定依赖于特定肿瘤抑制基因突变的GEM模型，我们构建了转基因小鼠模型，其中在施万细胞特异性髓鞘蛋白零（P0）启动子驱动下，强效施万细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1（NRG1）发生过表达。0）启动子（P0-GGFβ3 小鼠)21我们先前已证实，人类神经纤维瘤、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）以及MPNST细胞系均表达多种NRG1异构体，同时表达介导NRG1信号传导的erbB受体酪氨酸激酶（erbB2、erbB3和erbB4），且这些erbB受体处于持续活化状态。22我们还证明了erbB激酶的药理学抑制剂能有效抑制恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的增殖22生存23和迁移24. 与我们在人类中的观察结果一致，P0-GGFβ3 小鼠可形成丛状神经纤维瘤25 高频率进展为恶性周围神经鞘瘤21,25我们已证明 P0-GGFβ3 MPNSTs 与其人类对应物相似，通常会发生突变 Trp53 和 Cdkn2a以及可能促进肿瘤发生的众多其他基因组异常25. 发生于P的恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）0-GGFβ3 小鼠不具有失活的 Nf1 突变。然而，通过遗传互补实验，我们证明了 NRG1 能够促进 P 中的肿瘤发生0-GGFβ3 小鼠主要通过与之发生改变的相同信号级联途径 Nf1 损失26；这一结论基于我们的发现，即用 NRG1 过表达替代 Nf1 存在时的损失 Trp53 单倍剂量不足 (P0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠）可产生发生恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的动物模型 从头合成，如顺式结构中所见Nf1+/-;Trp53+/- 小鼠27.

为了获得上述及其他相关信息，以证明 P0-GGFβ3 小鼠能够准确模拟 NF1 患者中观察到的神经纤维瘤发病过程以及神经纤维瘤向恶性周围神经鞘瘤（MPNST）进展的过程，我们已开发出一系列专门的方法，用于处理这些动物的组织样本，准确诊断其肿瘤，对这些小鼠中出现的 MPNST 进行分级，并建立和表征早期传代的 P0-GGFβ3 及 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 细胞培养体系，同时系统性地比较 P0-GGFβ3 PN 和 MPNST 以及 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 与相应人类肿瘤的病理特征。这些方法中的许多可推广应用于其他神经系统肿瘤的基因工程小鼠（GEM）模型。此外，其中部分方法还可更广泛地适用于肿瘤发生于其他器官部位的 GEM 模型。因此，本文将详细描述这些方法学流程。

方案

本文所述操作程序已获得南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，并由经过适当培训的人员根据《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》及南卡罗来纳医科大学机构动物护理指南执行。

1. 确定P0-GGFβ3小鼠的肿瘤发生率和存活率，并鉴定这些动物中的肿瘤以进行进一步表征

  1. 生成用于评估肿瘤发生的实验小鼠群体。所需小鼠数量取决于肿瘤表型的外显率。为弥补此类损耗，初始群体数量应比预期最终所需动物数多出10%–15%。
    注意：我们确定了P中的肿瘤外显率0-在最初的50只GGFβ3小鼠队列中进行实证研究（其中6只因与肿瘤无关的原因死亡（如打斗））25.
  2. 每周评估动物健康状况三次，每次检查时记录体况评分，包括体重及行为变化。对于荷瘤或濒死小鼠（见下文注释），采用二氧化碳安乐死后进行颈椎脱位处死。记录死亡时的日龄。若肿瘤体表可见，记录肿瘤尺寸（长、宽、高）。
    注意：必须确保动物的肿瘤大小不得超过IACUC批准的最大允许尺寸和/或人道终点。
  3. 利用死亡年龄绘制Kaplan-Meier生存曲线，以确定平均死亡年龄和生存时间范围。
    注意：P0-GGFβ3 小鼠的平均死亡年龄为 261.5 天，范围为 74 至 533 天；本队列中 91% 的小鼠具有多个神经纤维瘤，71% 具有恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）21.
  4. 确定是否存在肉眼可见的肿瘤；如果存在，在无菌条件下解剖以判断肿瘤是否与外周神经相关，随后切除肿瘤。在 P0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠的周围神经鞘瘤最常出现在三叉神经和坐骨神经。即使在肉眼观察下未发现这些神经有明显肿瘤，也应按照下述方法对这些神经进行固定和包埋，以便检测是否存在微小肿瘤。微小肿瘤通常发生于与这些神经相关的神经节内。
  5. 将肉眼可见的肿瘤切成三块（图1A）。将组织块1用于组织学分析（石蜡切片、免疫组织化学和组织化学染色）。将组织块2用于建立低代次培养物。将组织块3使用液氮速冻，以备将来可能的实验（如免疫印迹、RNA和DNA提取）。
  6. 将样品1置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）中，4℃过夜固定 oC. 将动物其余身体部分浸入4%多聚甲醛中，于4 °C过夜固定。

2. 大体可见肿瘤的石蜡包埋及苏木精和伊红染色切片的制备用于初步诊断评估

  1. 大体可见肿瘤的石蜡包埋
    1. 将肿瘤组织块1在4%多聚甲醛中固定过夜后，用至少为组织体积10倍以上的PBS冲洗组织，每次15分钟；后续所有冲洗步骤均使用相同体积的PBS。重复此PBS冲洗两次，每次均使用新鲜PBS。
    2. 将肿瘤组织块1转移至70%乙醇中，在4 °C下于70%乙醇中孵育24小时。如需长期保存，可在上述条件下储存组织。
      注意：步骤 2.1.1 至 2.1.7 适用于无法使用商用组织处理仪的研究人员。若研究人员可使用组织处理仪，则应按照仪器预设程序，通过梯度乙醇和二甲苯对组织进行处理。
    3. 将肿瘤组织块转移至80%乙醇中，室温孵育30分钟。更换新鲜80%乙醇，再次孵育30分钟。
    4. 将肿瘤组织块1转移至95%乙醇中，室温孵育75分钟。重复孵育两次，每次均在新鲜的95%乙醇中继续孵育75分钟。
    5. 将肿瘤组织块转移至100%乙醇中，室温孵育60分钟。重复此60分钟孵育步骤两次，每次均使用新鲜的100%乙醇。
    6. 将肿瘤组织块1转移至基于d-柠檬烯的溶剂中，在室温下孵育30–60分钟。将肿瘤组织块1转移至新鲜的d-柠檬烯基溶剂中，继续在室温下孵育30–60分钟。
    7. 将肿瘤组织块1转移至1:1石蜡/柠檬烯基溶剂中，60℃孵育1小时 oC. 弃去1:1石蜡/d-柠檬烯基溶剂，将肿瘤组织块1转移至60 oC 石蜡，60°C 下孵育 20 分钟 oC. 在新鲜的 60 体积中重复孵育 oC 石蜡再次处理 20 分钟。将肿瘤组织块 1 在 60 °C 下浸入石蜡中过夜孵育 oC.
    8. 将石蜡基底倒入钢制组织学模具中，使其凝固。将肿瘤组织块1转移至石蜡基底表面，定位后立即用60 o将组织包埋盒放置于熔融的石蜡上，使其与石蜡充分接触。将模具转移至包埋机的冷凝侧，静置固化10–15分钟。
    9. 从模具中取出带有附着组织盒的石蜡块。在切片过程中，使用附着的组织盒将石蜡块固定在切片机上。
      注意：石蜡包埋块现在可于室温下长期保存。
  2. 制备肉眼可见肿瘤的苏木精和伊红染色切片。
    1. 使用切片机对肿瘤组织进行4-5 µm厚度切片，并将切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。
    2. 要进行苏木精和伊红（H&E) 染色时，将切片在基于d-柠檬烯的溶剂中室温孵育10分钟以脱蜡。更换新鲜的基于d-柠檬烯的溶剂，再次孵育10分钟。
    3. 将载玻片转移至100%乙醇中，室温孵育5分钟。将载玻片转移至新鲜的100%乙醇中，再次室温孵育5分钟。
    4. 将载玻片转移至95%乙醇中，室温孵育5分钟。将载玻片转移至新鲜的95%乙醇中，再次室温孵育5分钟。
    5. 将切片转移至70%乙醇中，室温孵育5分钟。随后转移至50%乙醇中，室温孵育5分钟。
    6. 将载玻片转移至蒸馏水中，在室温下孵育5分钟。
    7. 将切片浸入苏木精染液中，室温下染色5分钟。用流动的自来水冲洗1-2分钟。用70%乙醇中的0.5%盐酸溶液浸泡切片2-5次进行分化。在流动自来水浴中再次冲洗1-2分钟。将切片置于含0.5%冰醋酸的95%乙醇溶液中10秒。
    8. 用伊红-Y 在室温下染色 30 秒，然后将玻片转移至 100% 乙醇中 5 分钟。在基于 d-柠檬烯的溶剂中透明处理样品 5 分钟。
    9. 使用基于二甲苯的封片剂对载玻片进行封片，此时载玻片仍湿润着基于d-柠檬烯的溶剂。让封片剂过夜固化。
      注意： 不 使用水性封片介质。
  3. 准备无肉眼可见肿瘤的组织，以鉴定丛状神经纤维瘤和微小恶性周围神经鞘瘤（micro-MPNSTs）。将组织包埋于石蜡中，制备组织学切片，并用苏木精和伊红染色。
    1. 去除内脏器官，并将各器官的代表性组织部分包埋于石蜡中以制备组织切片&经染色的切片将用于显微镜下检测肿瘤的组织学证据（图 1B）。去除头部、前肢、后肢和尾部（图1C）。以检查脊髓和神经根 原位 为检测神经根肿瘤的迹象，将脊柱及相连的肋骨和软组织浸入0.3 M EDTA/4%多聚甲醛（pH 8.0）中，在4℃下脱钙48–72小时 oC；然后用1×PBS冲洗样本。脱钙结束后，尝试用针头刺穿椎体以确认脱钙是否完全。若针头可轻松刺入骨组织且无碎裂声，则表明脱钙成功。
    2. 将脱钙后的脊柱及关联结构切成适合放入组织包埋盒的小块。按照步骤2.1.2-2.1.7所述，经梯度乙醇脱水，再使用以d-柠檬烯为基础的溶剂处理。按步骤2.1.7-2.2.1所述进行石蜡包埋，并制备4–5 µm切片。进行H& 按照步骤 2.2.2–2.2.9 所述进行 E 染色；让封片剂过夜固化。

3. 鉴别潜在的丛状神经纤维瘤并进行特殊染色以确认诊断

注意：我们强烈建议在评估基因工程小鼠肿瘤组织的苏木精与伊红（H&E）染色及特殊染色时，纳入具有经验的人类或兽医病理学家参与。

  1. 检查 H&使用明场显微镜观察上述方法制备的苏木精-伊红（H&E）染色切片，以识别潜在的周围神经鞘肿瘤。由于神经纤维瘤和恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）起源于周围神经，因此确定显微镜下肿瘤是否与周围神经相关至关重要。应识别出含有潜在周围神经鞘肿瘤的组织块，以便进行免疫组织化学染色及其他特殊染色，从而证实或排除诊断。
  2. 根据亮视野下观察到的组织学特征，区分潜在的PNs与MPNSTs/其他高级别肿瘤&E染色切片。人类PNs是一种轻度细胞增多的肿瘤，主要由具有细长且常呈波浪状核的细胞组成。在许多区域，细胞排列疏松，可能被黏液样细胞外物质分隔；PN中的PNs0-GGFβ3 小鼠具有相似的表型。通常不存在有丝分裂象；如果出现有丝分裂且肿瘤细胞中度至高度密集，则应诊断为恶性外周神经鞘瘤（MPNST）或其他类型的高级别肿瘤（见下文）。
  3. PNs 由肿瘤性施万细胞和肥大细胞等非肿瘤性细胞类型混合组成。为确认 PN 的身份，应对 H&E 染色中识别出的疑似 PN 组织块切片进行免疫染色，检测施万细胞标志物 S100β 和 Sox10 以及肥大细胞标志物 CD117（c-Kit）&E 染色（替代性肥大细胞标志物染色方案参见第 3.4 节）。进行 Ki67 免疫染色以确认低增殖率。
    注意： 表1 列出了用于常规鉴定GEM丛状神经纤维瘤的抗原标志物（S100β、Sox10、CD117、Ki67）、恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的诊断，以及对神经纤维瘤中其他共存细胞类型的全面评估；仅在首次描述新的GEM模型时，才会对上述后者抗原进行染色。请查阅抗体生产商提供的产品说明书以获取推荐的实验条件。注意抗体说明书是否建议进行抗原修复；并非所有抗原均需抗原修复步骤即可被检测到。
    1. 从选定的石蜡包埋块制备4-5 μm厚的切片，并将其贴附于带正电荷的载玻片上。按照步骤2.2.2–2.2.6中所述方法进行脱蜡处理。
    2. 用1×PBS冲洗切片3-5分钟。
    3. 如果抗体生产商建议进行抗原修复，则配制柠檬酸缓冲液。取9 mL柠檬酸溶液（10.5 g柠檬酸溶于500 mL蒸馏水中）与41 mL柠檬酸钠溶液（14.7 g柠檬酸钠溶于500 mL蒸馏水中）混合。
    4. 将切片放入柠檬酸盐缓冲液中，于加热的电饭煲内孵育20分钟以进行抗原修复。
    5. 将切片转移至3%过氧化氢/1x PBS中孵育10分钟，以消除组织中的过氧化物酶活性。
      注意：每次均需新鲜配制此溶液，若过氧化氢的储存液已存放超过3-4个月，则不得使用。
    6. 用1×PBS冲洗切片。
    7. 使用封闭缓冲液（含2% BSA、0.1% Triton X-100的1×PBS）封闭切片，室温孵育1小时。用1×PBS短暂漂洗载玻片。
    8. 向组织切片中加入一抗。用稀释的封闭缓冲液配制一抗，将切片于37℃孵育2小时。 o4°C 过夜 oC.
    9. 用1×PBS清洗载玻片，每次5分钟，重复3次。
    10. 将组织与生物素标记的二抗在室温下孵育1-2小时。
    11. 根据制造商说明书配制二氨基联苯胺（DAB）溶液，将切片浸入溶液中孵育2–10分钟。用蒸馏水洗涤切片5分钟。
    12. 将切片浸入苏木精染液中染色10-15分钟进行复染。用流水冲洗至流水清澈。将载玻片快速浸入酒精中并用水冲洗。
    13. 将载玻片依次浸入梯度乙醇中脱水，每种溶液快速浸入4-5次，顺序为70%乙醇、95%乙醇，最后100%乙醇。随后将载玻片置于基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。再将载玻片转移至另一批基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。
    14. 使用二甲苯基介质封片 封片剂
    15. 使用明场显微镜观察载玻片。
    16. 进行免疫荧光时，省略步骤 3.3.10–3.3.15。改为将组织与用封闭缓冲液稀释的种属特异性二抗在室温下孵育 1–2 小时。
    17. 用1×PBS冲洗载玻片5分钟，重复3次。
    18. 使用1×PBS/甘油封片。
    19. 使用荧光显微镜观察载玻片。
  4. 染色肥大细胞的替代方法：甲苯胺蓝染色
    1. 将1 g甲苯胺蓝O溶解于100 mL 70%乙醇中，配制甲苯胺蓝储备液。
    2. 将0.5 g氯化钠（NaCl）溶解于50 mL蒸馏水中，配制1%氯化钠（NaCl）溶液。搅拌至完全溶解。用HCl调节pH至约2.0–2.5。
      注意：每次染色时，该 NaCl 溶液必须 freshly 制备。
    3. 将 5 mL 品红蓝贮存液加入 45 mL 的 1% NaCl 溶液中，配制品红蓝工作液。充分混匀，并确保 pH 值约为 2.3。
      注意：pH 高于 2.5 会导致异染性染色减弱。每次染色时均需新鲜配制该溶液。
    4. 对固定在正电荷载玻片上的4-5 μm切片进行脱蜡，操作步骤如2.2.2–2.2.6所述。将脱蜡后的切片用流水冲洗2分钟。
    5. 用甲苯胺蓝工作液染色切片 2-3 分钟，蒸馏水中洗涤 2 分钟。
    6. 将切片在95%乙醇中浸入10次进行脱水。将玻片在100%乙醇中浸入10次。再将玻片在新鲜的100%乙醇中浸入10次。
    7. 将载玻片置于基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。将载玻片置于第二批基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。
    8. 使用基于二甲苯的封片剂封片，此时载玻片仍被基于d-柠檬烯的溶剂润湿。
      注意： 不 使用水性封片介质。
    9. 使用明场显微镜观察载玻片。通过细胞质内深紫色颗粒的存在来鉴定肥大细胞。其他细胞类型被染成浅蓝色。

4. 特殊染色以诊断恶性周围神经鞘瘤并排除其他鉴别诊断

  1. 人源恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的组织学形态具有高度变异性，多种不同类型的肿瘤在形态上与MPNST相似28。由于MPNST起源于施万细胞谱系，应通过大体检查或对苏木精-伊红（H&E）染色切片进行明场显微镜检查，判断肿瘤是否起源于外周神经或既有的良性神经鞘瘤（PN）。尽管偶有MPNST并不与外周神经或PN相关（通常是因为在解剖过程中意外与神经分离、原有PN被MPNST过度生长所破坏，或病变为转移性病变），但仍应寻找肿瘤与神经或PN的关联性，若肿瘤未与神经或PN相关，则MPNST的诊断可能性较低。
  2. 从含有疑似MPNST的石蜡包埋块中制备4–5 μm厚的切片，并按照步骤2.2.1所述方法将其贴附于带正电荷的载玻片上。随后按照步骤2.2.2–2.2.6所述方法进行脱蜡处理。
  3. 按照步骤3.3.1–3.3.15所述方法，使用表2中列出的抗体组合进行免疫组织化学染色。
  4. 通过明场显微镜观察免疫染色结果。由于MPNST表现出施万细胞样分化特征，应观察S100β、nestin和Sox10是否存在均匀或局灶性的免疫反应性。若肿瘤对这三种标志物均呈阴性，可参考表2以确立诊断。
    ​注：人和小鼠的MPNST均可表现出异源性分化。例如，部分人源MPNST可出现局灶性横纹肌样分化（此类变异型称为恶性Triton肿瘤）；尽管这些肿瘤仍可表达施万细胞标志物，但同时也表达结蛋白（desmin）、MyoD1和肌生成素（myogenin）等肌肉标志物。对后一类标志物的免疫反应性不应妨碍研究者将其诊断为MPNST。尽管已有多种条件性表达SS18-SSX融合基因的小鼠模型用于模拟滑膜肉瘤的发病机制29，但据我们所知，尚无能自发产生相应融合转录本的滑膜肉瘤模型被报道。因此，我们不对GEM肿瘤检测SS18-SSX融合转录本，而是依赖免疫组织化学谱型进行判断。

5. 恶性周围神经鞘瘤的分级

  1. 确定是否存在肿瘤坏死，这是 WHO 4 级恶性周围神经鞘膜瘤（MPNST）的特征性表现。对于 4 级 MPNST，应观察是否存在明显的细胞丰富、活跃的有丝分裂活性（每 10 个高倍视野（40x）中 ≥4 个有丝分裂相）以及细胞学异型性。
    1. 若无坏死存在，则评估肿瘤是否具有细胞丰富、活跃的有丝分裂活性和细胞学异型性。若在无坏死的情况下上述特征均存在，则将该肿瘤分级为 WHO 3 级 MPNST。
    2. WHO 2 级肿瘤的特征是细胞密度增加，但程度低于 WHO 3 级和 4 级 MPNST。WHO 2 级 MPNST 肿瘤细胞的细胞核体积增大（大于神经纤维瘤中肿瘤细胞核大小的 3 倍）并伴有深染。有丝分裂活性增加（<每 10 个高倍视野 4 个有丝分裂相）可出现在 WHO 2 级肿瘤中，但并非诊断所必需。
      注：由于高级别肿瘤通常由低级别进展而来，同一 MPNST 中可能同时存在低级别和高级别区域。在此情况下，肿瘤的分级应依据其中最高级别的区域确定。
      注：在人类病理学领域，目前对于上述 WHO 分级系统是否能预测患者预后仍存在争议，部分病理学家更倾向于仅将 MPNST 分为低级别或高级别两类。在此分类方案下，高级别 MPNST 具有显著的细胞学异型性、活跃的有丝分裂活性（>每 10 个高倍视野 5 个有丝分裂相），以及明显的细胞丰富，可伴或不伴坏死；而低级别 MPNST 缺乏坏死，但其有丝分裂活性、细胞学异型性和细胞密度介于高级别 MPNST 与具有未知生物学潜能的非典型神经纤维瘤样肿瘤（ANNUBP）之间。我们更倾向于采用上述分级系统，因为对于缺乏长期经验的研究人员而言，区分 ANNUBP 与低级别 MPNST 可能具有挑战性。

6. 初代 P0-GGFβ3 MPNST 细胞培养物的制备

  1. 从新鲜的2号肿瘤组织块（步骤1.5，图1A）中培养早期代次P0-GGFβ3肿瘤细胞。从此步骤开始保持无菌条件。
    1. 将肿瘤组织切成小块（2–4 mm），在含有10%胎牛血清、2 µmol/L佛司可林和10 nmol/L神经调节蛋白1β（NRG1β）的DMEM10（杜氏改良伊格尔培养基）中进行机械剪碎，置于100 mm组织培养皿中。
    2. 将培养皿置于37 oC、5% CO2条件下培养，使细胞从剪碎的组织片段中迁移生长，直至细胞融合。每3–4天更换一次培养基。
    3. 传代细胞培养物。吸除100 mm培养皿中的培养基，用PBS洗涤细胞，去除并弃去残留的组织碎片。吸除PBS后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在室温下消化2–5分钟。为促进细胞脱落，可轻轻敲击培养皿，并在光学显微镜下观察脱落情况；根据需要适当延长胰蛋白酶消化时间。
    4. 加入2 mL DMEM10以中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至离心管中，在500 × g条件下离心5分钟以收集细胞。吸除上清液，向细胞沉淀中加入5 mL新鲜DMEM10。
    5. 将细胞悬液分种至2–4个含有DMEM10的100 mm培养皿中。传代次数不得超过五代（见步骤6.1.3和6.1.4），之后维持在不含佛司可林和NRG1β的DMEM中培养。请记得在第2代时冻存细胞以备后续使用。

7. 通过免疫细胞化学法验证早期传代 MPNST 细胞的身份

  1. 将无菌的18 mm #1.5圆形玻璃盖玻片放入6孔无菌组织培养板的孔中。
    1. 将聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白溶液加入孔中，体积以能够覆盖盖玻片为宜。用塑料封口膜密封培养板以减少蒸发。于4 °C孵育过夜。次日早晨，用无菌PBS洗涤盖玻片3次。
      注意：我们曾尝试将早期传代的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞接种于未包被的盖玻片上，发现细胞在缺乏聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白包被的情况下贴壁效果不佳。
    2. 通过向含有盖玻片的每个孔中轻柔加入2 mL生长培养基中的细胞悬液，接种10,000个细胞。将培养板置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中过夜孵育。
    3. 次日早晨，用PBS漂洗盖玻片，每次5分钟，共2次。
    4. 用含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定细胞18分钟。
    5. 用PBS漂洗盖玻片，每次5分钟，共3次。如需保存，可用塑料封口膜密封培养板，并在此时置于4 °C保存。
    6. 配制新鲜的含50 mM NH4Cl的PBS溶液。将盖玻片在含50 mM NH4Cl的PBS中于室温孵育10分钟，以淬灭醛基。
    7. 将盖玻片在含0.3% Triton X-100的PBS中于室温孵育15分钟以通透细胞。随后用PBS漂洗盖玻片，每次5分钟，共3次。
    8. 将盖玻片在封闭缓冲液（含1%牛血清白蛋白、0.2%脱脂奶粉和0.3% Triton X-100的1x PBS）中于室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。
    9. 移除封闭缓冲液，加入识别原发肿瘤中MPNST标志物（通常为S100β、Nestin和Sox10）的一抗，用封闭缓冲液按预先确定的最佳稀释比例稀释后加入。用塑料封口膜包裹培养板，在湿盒中4 °C孵育过夜。
    10. 用PBS漂洗3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。加入用封闭缓冲液稀释的荧光标记二抗，室温孵育1小时。避光操作。
    11. 用PBS漂洗3次，每次5分钟。将盖玻片在1–5 µg的Hoechst染料中孵育10分钟。继续避光操作。
    12. 用PBS漂洗盖玻片5分钟。使用1:1的1x PBS/甘油封片剂封片。用荧光显微镜观察成像。

8. 异体移植早期传代肿瘤细胞以证明其致瘤性

  1. 将早期传代的 P0-GGFβ3 MPNST 细胞在 DMEM10 培养基中培养至 80% 汇合度。用室温的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）冲洗细胞一次。使用非酶细胞解离溶液处理细胞 30 秒至 1 分钟，以使其从基质上脱落。每 1 mL 非酶细胞解离试剂中加入 5 mL DMEM10。
    注意：细胞解离可能需要更长时间，最长可达 10–20 分钟。请参考试剂生产商的操作说明。
    注意：不要将细胞培养至完全汇合，因为这会降低移植效果。
    1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。在 5 × g 条件下离心 5 分钟，然后将细胞重悬于 100 µL DMEM10 中，浓度为 1–2 × 106 个细胞。在注射前将细胞置于冰上保存。
    2. 将 NOD-SCIDγ（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ）小鼠置于异氟烷挥发器的诱导室中进行麻醉。将动物俯卧放置，并用 70% 乙醇消毒注射部位。在注射前让消毒部位自然干燥。注射前使细胞恢复至室温。
    3. 在右侧胁腹部皮下注射 1–2 × 106 个细胞。将小鼠单独置于无垫料的笼子中，并让其恢复。确保仅笼子的一部分置于加热垫上，以防止低体温。这样可为小鼠提供一个可移动的温度调节区域，以防过热。
      注意：我们对每种早期传代细胞系至少移植三只小鼠，因为部分移植物可能无法成功生长。
    4. 让移植物生长 15–60 天；每周检查动物健康状况 3 次，并在每次检查时记录体况评分，包括体重和行为变化。对达到最大允许肿瘤尺寸或处于濒死状态的小鼠，采用二氧化碳安乐死法，随后进行颈椎脱位。记录死亡时的日龄。当肿瘤在体表可见时，记录肿瘤尺寸（长度、宽度和高度）。
      ​注意：根据我们的经验，不同早期传代的 MPNST 细胞系在移植效率和移植物生长所需时间上存在差异。不得允许动物超过 IACUC 批准的最大允许肿瘤尺寸和/或人道终点。
  2. 收获肿瘤组织，用 4% 多聚甲醛固定，包埋于石蜡中，并按照第 2.1–2.2.9 节所述方法进行 H&E 染色，以确认异体移植物为肿瘤组织而非反应性组织。如有必要，对移植物进行免疫组织化学染色，检测原发肿瘤中存在的标志物。

结果

图2展示了P0-GGFβ3小鼠中出现的肉眼可见肿瘤的示例。通过肉眼即可识别的肿瘤可能表现为导致身体部位膨出的肿块，如图2A所示（箭头）。在判断肿瘤是否可能为周围神经鞘瘤时，关键是要确认肿瘤与周围神经相关联。在此例中，MRI扫描（图2B）显示肿瘤与坐骨神经相关（箭头所示）；该关联在处死小鼠并解剖肿瘤后得到证实。需要注意的是，肿瘤体积较大并不一定意味着其为恶性。本例中，对肿瘤进行组织学检查（图2C）表明其为神经纤维瘤。然而，大多数情况下，肉眼可见的肿瘤通常直到对小鼠进行尸体解剖时才能被发现。图2D展示了该动物臂丛内出现的一个较大、肉样的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。

图3 展示来自P的MPNST和神经纤维瘤的代表性实例0-GGFβ3 小鼠，按照方案第1节中所述步骤制备 图3A-J 展示了我们研究中独立发生的十例恶性周围神经鞘瘤（MPNST）0-GGFβ3 小鼠群体。需要注意的是，即使在同一动物体内独立发生的恶性周围神经鞘瘤（MPNST），其组织学表现也可能存在高度变异性。这种组织学上的变异性说明了为何我们常规进行病理诊断确认0-GGFβ3 MPNSTs 的免疫组织化学染色。我们还需指出，其他一些看似无关的肿瘤类型在某些近交系小鼠品系中也会以较低频率偶发（例如，我们曾多次在 P0-GGFβ3 小鼠（其转基因位于 C57BL/6J 背景上），进一步强调了使用免疫组织化学来确认肿瘤诊断的重要性。尽管这些肿瘤的组织学形态存在变异，但所展示的全部十个肿瘤 图3A-J 对S100β和nestin呈免疫阳性，而对其他肿瘤类型的标志物呈阴性。 图 3K 展示了经过适当脱钙处理的脊柱及周围组织的代表性图像。注意，脊髓、神经根、椎体和骨骼肌均保持彼此之间正常的解剖学关系。 图 3L 是椎体及其上方脊髓的高倍镜图像。由于该组织已充分脱钙，骨组织切片时易于切割，无撕裂或折叠现象，骨髓腔内的骨髓清晰可辨。若组织未充分脱钙，则会在切片过程中卡住切片刀，导致骨组织从切片中撕脱，对邻近组织（脊髓、脊神经根和骨骼肌）造成明显损伤。 图3M 展示了一例发生在P患者背根神经上的神经纤维瘤的代表性图像0- GGFβ3 小鼠。请注意，此肿瘤的细胞密度低于所示的 MPNST 肿瘤 图 3A-J神经纤维瘤的关键诊断特征是其由肿瘤性施万细胞与非肿瘤性肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞以及类似神经束膜的成分组成的复杂混合物，这些成分浸润神经并使轴突分离。

图4 展示了在初步鉴定丛状神经纤维瘤以及区分丛状神经纤维瘤与恶性周围神经鞘瘤（MPNST）时最有用的染色方法示例。 图 4A 显示P中S100β的免疫反应性0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤。请注意，S100β 免疫反应性仅在部分细胞亚群中可见，这与神经纤维瘤由肿瘤性施万细胞与其他非肿瘤性成分（成纤维细胞、肥大细胞、巨噬细胞、类似周膜细胞、一种CD34免疫反应性但表型未明的细胞群体以及脉管结构）混合构成的特点相符。遗憾的是，S100β 染色呈局灶性分布并不能有效区分丛状神经纤维瘤与恶性周围神经鞘膜瘤（MPNST），因为在 MPNST 中 S100β 染色亦可呈局灶性（H&E染色对此目的很有帮助；然而，由于恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）通常比丛状神经纤维瘤细胞密度更高［参见 图3）。肿瘤性许旺细胞对中间丝巢蛋白呈免疫反应阳性，如P中所示0- GGFβ3 MPNST 的表现形式为 图4B. 恶性施万细胞通常也表现出对转录因子 Sox10 的核免疫反应性，如在恶性周围神经鞘膜瘤中所示 图4C有助于区分丛状神经纤维瘤与恶性周围神经鞘瘤的特征包括肥大细胞的存在以及Ki67增殖标志物明显的免疫反应性。 图 4D 展示对P进行的Unna染色0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤，以突出肥大细胞的存在，其细胞质颗粒具有明显的异染性紫红色染色，易于识别。恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）中不存在肥大细胞。相反，如图中所示，丛状神经纤维瘤中 Ki67 免疫反应性几乎不存在0- GGFβ3 肿瘤显示在 图4E细胞核Ki67标记通常存在于极高比例的肿瘤细胞中，如在一名P患者三叉神经节发生的显微镜下恶性周围神经鞘瘤（MPNST）所见。0-GGFβ3 小鼠（图4F).

图5展示了我们在新开发的GEM模型中用于全面表征神经纤维瘤细胞组成的染色示例。尽管本图中所示的染色结果来自人类皮肤神经纤维瘤，但其形态与我们在GEM肿瘤中观察到的结果完全相同。肥大细胞在神经纤维瘤中对CD117（c-Kit）呈免疫阳性反应，因此其分布模式与Unna染色所见高度相似（见图3A）。如全巨噬细胞标志物Iba1染色所示，巨噬细胞也散在分布于神经纤维瘤中（见图5D）；其中包括对CD163和CD86呈免疫阳性的巨噬细胞亚群（分别见图5B和图5C）。神经纤维瘤中的部分雪旺细胞成分也表现出Sox10的核免疫阳性反应。成纤维细胞可通过其对TCF4的免疫阳性反应进行识别。在图5G中，CD31标记了神经纤维瘤内的血管结构，而图5H所示的CD34则标记了一群性质尚不明确的树突状细胞群体，有研究提示这些细胞可能为组织驻留巨噬细胞的一个亚群30，或是一类既非雪旺细胞也非成纤维细胞的新型神经鞘细胞31。

图6 旨在便于将人类丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）与P0-GGFβ3小鼠中观察到的肿瘤进行比较，并提供一些易与MPNST混淆的人类肿瘤类型的代表性示例。图6A 展示了一例发生于NF1患者臂丛的丛状神经纤维瘤，而图6B 则展示了在同一丛状神经纤维瘤内发生的WHO 4级MPNST。图6B 显示了WHO 4级MPNST的一些典型特征，包括显著的细胞密集、细胞异型性、活跃的有丝分裂活性以及肿瘤坏死。作为对比，图6C 显示了一例WHO 2级MPNST，其具有明显的细胞异型性，但细胞密度低于4级MPNST，尽管可见有丝分裂象，但有丝分裂活性较低。图6D 展示了一例纤维肉瘤，其肿瘤细胞呈交错排列的特征性“人字形”结构。然而，这种结构并不能明确区分纤维肉瘤与MPNST，因为部分MPNST也可呈现类似结构。此外，图6E 所示的高倍镜视野中，细胞形态与图6B 所示的WHO 4级MPNST相似。图6F 展示了一例平滑肌肉瘤。与大多数MPNST不同，平滑肌肉瘤对肌源性标志物（如平滑肌肌动蛋白和结蛋白）呈免疫阳性。然而，不同肿瘤间平滑肌肌动蛋白的免疫反应性可能存在差异，部分肿瘤表现为强而均匀的免疫阳性（图6G），而另一些则显示肿瘤内部细胞间的免疫反应性差异（图6H）。结蛋白的免疫反应性在平滑肌肉瘤中也可能呈局灶性分布（图6I）。黑色素瘤的形态学表现高度多样，部分肿瘤由多角形细胞构成（图6J），而另一些则由梭形细胞构成，后者可模拟MPNST细胞的形态。黑色素瘤可通过黑色素体标志物（如MART1）的免疫阳性反应与MPNST相鉴别（图6K）。然而，与MPNST类似，黑色素瘤也常对S100β和Sox10呈阳性反应（图6L）。

图7展示了从P0-GGFβ3小鼠中分离出的WHO Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的病理学特征。图8显示了早期传代的P0-GGFβ3 MPNST细胞在低倍（图7A）和高倍（图7B）下的代表性图像。这些细胞的致瘤性体现在其在软琼脂中悬浮时形成集落的能力（图7C），以及在免疫缺陷小鼠中皮下异体移植后形成移植物的能力（图7D）。

小鼠尸检及恶性周围神经鞘瘤切除示意图；免疫组织化学与组织化学流程。
图1：用于处理P0-GGFβ3小鼠肿瘤及其他组织的工作流程。（A）肉眼可见的肿瘤被取出后分为三部分：1）用4%多聚甲醛固定，随后进行免疫组织化学和组织化学分析；2）建立早期传代肿瘤细胞培养和/或进行基因组分析；3）使用液氮速冻，用于蛋白质、DNA或RNA的提取。（B）切除肿瘤后，将小鼠尸体置于4%多聚甲醛中固定，并取出内脏器官。取样这些器官进行组织学检查，以识别肿瘤及其他病理过程的显微证据。（C）移除内脏器官后，从尸体上分离头部、四肢、尾部及皮肤。脊柱、邻近肋骨及邻近骨骼肌使用0.3 M EDTA/4%多聚甲醛（pH 8.0）进行脱钙处理。脱钙后的组织经石蜡包埋，并制备组织切片用于免疫组织化学和组织化学检查。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠肿瘤研究；MRI扫描、组织学切片、肿瘤生长；生物医学研究示意图。
图2：P0-GGFβ3 小鼠中肉眼可见的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的代表性图像。（A）一只 P0-GGFβ3 小鼠，其右侧 flank 区域有一个明显的大型肿瘤（箭头所示）。（B）该小鼠的 MRI 扫描显示，肿瘤与坐骨神经相连（箭头所示），并已穿透覆盖的筋膜，在皮下组织内扩展（箭头所示，主体肿瘤团块）。（C）对该肿瘤的显微镜检查显示，尽管肿瘤体积较大，但仍为神经纤维瘤。（D）在一只 P0-GGFβ3 小鼠臂丛部位发生的大型肉质性 MPNST。比例尺 = 100 µm。（C）。缩写：MPNSTs = 恶性周围神经鞘瘤；MRI = 磁共振成像。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学切片显示脊髓和肌肉组织切片；显微镜分析重点。
图3：按照方案第1节所述方法制备的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）、脱钙脊柱及神经纤维瘤的代表性图像。（A-J） 切除并经苏木精-伊红（H&E）染色的P0-GGFβ3小鼠MPNST显示组织学上的异质性。所有图像均为独立发生的MPNST。尽管组织学表现存在差异，这些肿瘤均表现出与表1中所述MPNST标志物一致的阳性标记。比例尺 = 200 µm。（K）脱钙脊柱横截面的H&E染色代表性图像。该图像中可清晰观察到以下结构：脊髓、椎体骨、背侧脊神经根上的背根神经节以及椎旁骨骼肌。放大倍数为4倍。（L）图K中脊髓和椎骨的高倍图像，显示采用本方法脱钙后骨组织形态正常。放大倍数为10倍。（M）P0-GGFβ3小鼠背侧神经根神经纤维瘤的代表性图像。放大倍数为40倍。比例尺 = 100 µm。缩写：MPNSTs = 恶性周围神经鞘瘤；H&E = 苏木精和伊红。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学切片；染色组织样本；显微镜下比较；细胞形态学分析。
图 4：用于丛状神经纤维瘤初步鉴定及其与恶性周围神经鞘瘤（MPNST）区分的诊断性染色。（A）P0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤中 S100β 的免疫染色。注意该抗原的强棕褐色染色仅出现在肿瘤的部分细胞中，这与神经纤维瘤由肿瘤性许旺细胞及多种非肿瘤性细胞类型组成的特点一致。（B）P0-GGFβ3 恶性周围神经鞘瘤中中间丝蛋白 nestin（红色）的免疫荧光图像，并用双苯并咪唑（蓝色，细胞核染色）复染。（C）恶性周围神经鞘瘤中转录因子 Sox10 的染色。部分肿瘤细胞的细胞核中可见明显的强免疫反应性（棕色）。（D）P0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤经 Unna 染色后的高倍镜视野。该染色使肥大细胞中的颗粒呈现异染性（紫色）染色。由于恶性周围神经鞘瘤缺乏肥大细胞，因此可通过此特征与丛状神经纤维瘤相区分。（E,F）Ki67 免疫组织化学染色结果：（E）P0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤；（F）P0-GGFβ3 恶性周围神经鞘瘤。两切片均经苏木精复染（蓝色细胞核染色），Ki67 免疫反应性在免疫过氧化物酶染色中表现为棕褐色细胞核染色。注意丛状神经纤维瘤中无明显棕褐色细胞核染色，而在恶性周围神经鞘瘤中大多数肿瘤细胞的细胞核呈阳性。比例尺 = 100 µm。缩写：MPNST = 恶性周围神经鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor）。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞核和蛋白质标志物的荧光显微镜图像；多色染色、示意图、分析。
图 5：用于鉴定构成神经纤维瘤的细胞亚群的免疫染色代表性图像。 这些来自人皮肤神经纤维瘤的免疫荧光图像分别对以下标志物进行了染色：（A）CD117（c-Kit；肥大细胞标志物），（B）CD163（M2型巨噬细胞），（C）CD86（M1型巨噬细胞），（D）Iba1（全巨噬细胞标志物），（E）Sox10（施万细胞标志物），（F）TCF4（成纤维细胞标志物），（G）CD31（血管系统标志物），以及（H）CD34（标记神经纤维瘤中一类独特但尚未明确理解的细胞亚群）。放大倍数为60倍，比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学组织切片分析；显微镜下的细胞；蛋白质表达研究；染色样本。
图6：丛状神经纤维瘤、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）以及在MPNST鉴别诊断中需考虑的其他一些人类肿瘤类型的代表性图像。（A）来自一名NF1患者臂丛的丛状神经纤维瘤，显示该肿瘤整体细胞密度较低且呈良性形态。尽管在H&E染色切片中不易观察到，但实际存在多种细胞类型的复杂混合物。未见有丝分裂象。放大倍数：40x。（B）由图A所示丛状神经纤维瘤发展而来的WHO IV级MPNST。注意其细胞密度显著增高。箭头指示一个有丝分裂象，星号标记了该显微视野右上区域的肿瘤坏死区。放大倍数：40x。（C）WHO II级MPNST。该肿瘤的细胞密度低于图B所示的WHO IV级MPNST，但其核异型性和深染程度较图A所示丛状神经纤维瘤更为明显。箭头指示在此肿瘤中偶尔观察到的有丝分裂象之一。放大倍数：63x。（D）成人型纤维肉瘤的低倍镜图像，显示该肿瘤类型典型的“人字形”结构（肿瘤细胞交织成束）。遗憾的是，部分人类MPNST中也可出现人字形结构，因此不能用于区分纤维肉瘤与MPNST。放大倍数：20x。（E）图D所示纤维肉瘤的高倍镜图像。注意该纤维肉瘤的细胞形态与图B所示WHO IV级MPNST的细胞形态非常相似。放大倍数：40x。（F）平滑肌肉瘤的高倍镜图像，显示其细胞形态落在MPNST所见变异范围之内。放大倍数：40x。（G）图F所示平滑肌肉瘤的平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。注意肿瘤细胞对该抗原呈现均匀且强烈的免疫反应性。放大倍数：40x。（H）另一种平滑肌肉瘤的平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。在此肿瘤中，免疫反应性的强度存在更大差异，部分细胞染色较其他细胞更强。同一抗原在一个肿瘤中可表现为所有肿瘤细胞均呈免疫反应性，而在另一肿瘤中仅部分肿瘤细胞呈免疫反应性，这种情况并不少见。放大倍数：40x。（I）第三例平滑肌肉瘤的结蛋白（desmin）免疫组化染色。在此肿瘤中，仅部分肿瘤细胞对该抗原呈现强烈免疫反应性。（J）转移性黑色素瘤。黑色素瘤的形态高度多变，可从立方形到梭形不等；具有后一种梭形形态的肿瘤最容易与MPNST混淆，尤其因为黑色素瘤和MPNST均可表达S100β和Sox10。放大倍数：40x。（K）图J所示肿瘤的黑色素瘤标志物MART1免疫反应性。放大倍数：40x。（L）图J所示黑色素瘤中转录因子Sox10的核免疫反应性。放大倍数：40x，比例尺 = 100 µm。缩写：MPNST = 恶性周围神经鞘瘤。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学组织分析；染色样本，显微镜图像，细胞结构观察。
图7：WHO 2-4级P的代表性图像0-GGFβ3 MPNST细胞 (A低-和（B) WHO 2级MPNST的高倍光学显微照片。请注意，其细胞密度低于图中所示的WHO 3级MPNST C 且肿瘤细胞的细胞核中 D 比图中所示的细胞核深染（颜色更深） B. (C低-和（D) WHO 3级恶性周围神经鞘膜瘤的高倍显微照片。该肿瘤表现出 >每10个高倍视野中可见4个有丝分裂相，细胞排列更为紧密，核染色更深，且具有非典型性核。E低- 和（F) WHO 4级恶性周围神经鞘膜瘤的高倍镜视野。注意图中下中部区域的坏死灶 F低倍镜 = 20x；高倍镜 = 40x，比例尺 = 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

癌细胞显微镜图像、培养皿生长、组织学、细胞增殖图。
图 8：早期传代 P0-GGFβ3 MPNST 细胞的代表性图像及其致瘤性，通过软琼脂中生长能力及异体移植成瘤能力展示。（A）早期传代 P0-GGFβ3 MPNST 细胞的低倍和（B）高倍相差显微图像。（C）P0-GGFβ3 MPNST 细胞在软琼脂中培养并用苏丹黑染色；菌落表现为琼脂中的黑色斑点。（D）将 P0-GGFβ3 MPNST 细胞皮下异体移植至免疫缺陷小鼠后形成的肿瘤组织，经苏木精和伊红染色的图像，移植操作按本方案所述进行。（E）通过 Celigo 图像细胞仪测定的早期传代 P0-GGFβ3 MPNST 细胞在 5 天内的增殖情况。低倍 = 10x，高倍 = 40x；所有图示的比例尺 = 100 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

名称用途种属反应性/类别
CD117预稀释rabbit monoclonal
CD1631:200mouse monoclonl
CD311:50rabbit polyclonal
CD341:2000rabbit monoclonal
CD861:1000rabbit monoclonal
Cytokeratin1 µg/mLmouse monoclonal
Desmin1:50mouse monoclonal
Iba11:500polyclonal rabbit
Ki-671:50rabbit monoclonal
MART11 µg/mLmouse monoclonal
Nestin1:1,000mouse monoclonal
PMEL1:100rabbot monoclonal
S100B1:200 rabbit polyclonal
SMA1:100mouse monoclonal
Sox101:10mouse monoclonal
TCF4/TCFL2 1:100rabbit monoclonal

表1：用于丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤诊断的抗体。 用于常规鉴定GEM丛状神经纤维瘤（S100β、Sox10、CD117、Ki67）、MPNST诊断以及对神经纤维瘤中其他存在细胞类型的全面评估所使用的抗体。缩写：MPNST = 恶性周围神经鞘瘤。

S100βNestinSox10MART1PMELDesmin平滑肌肌动蛋白细胞角蛋白SS18-SSX 融合
恶性周围神经鞘瘤（MPNST）50–90%，通常为局灶性阳性1约 30%阴性阴性阴性阴性阴性阴性
纤维肉瘤阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性
平滑肌肉瘤罕见阴性阴性阴性阴性50–100%阳性约 40%阴性
上皮样肉瘤阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阳性阴性
黑色素瘤阳性阳性85%阳性阳性阴性阴性阴性阴性
单相型滑膜肉瘤约 30%阴性阴性阴性阴性阴性阴性阳性阳性

表2：用于确定人类肿瘤身份的标志物。 这些免疫组织化学和组织化学标志物，结合对肿瘤微观形态的评估，可用于区分恶性周围神经鞘瘤（MPNST）与其他形态相似的肿瘤。在人类MPNST的鉴别诊断中，通常需考虑成人型纤维肉瘤、上皮样肉瘤、平滑肌肉瘤、单相性滑膜肉瘤和黑色素瘤。成人型纤维肉瘤在显微镜下呈人字形排列，表达波形蛋白（vimentin），但不表达S100β。平滑肌肉瘤（而非MPNST）对结蛋白（desmin）呈免疫反应阳性；此外，平滑肌肉瘤的细胞核具有明显的钝端形态。上皮样肉瘤（而非MPNST）对细胞角蛋白（cytokeratin）呈免疫反应阳性。黑色素瘤与MPNST相似，可能S100β阳性，但同时还表达MART-1和PMEL。缩写：MPNST = 恶性周围神经鞘瘤。1S100β与巢蛋白（nestin）联合检测对MPNST具有高度预测价值。

讨论

本文介绍的组织学与生物化学方法为神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤（MPNST）发生机制的基因工程小鼠（GEM）模型的诊断与表征提供了框架。多年来，我们发现这些方法在评估GEM模型中发生的外周神经鞘膜肿瘤病理方面非常有用21,25,26。然而，尽管本文概述的方案有助于确定GEM模型中肿瘤在多大程度上准确再现了人类对应肿瘤的病理特征，但这些策略仍存在一些局限性，需加以认识。首先，P0-GGFβ3 小鼠的肿瘤表型几乎完全外显，这使得获得大量带有神经纤维瘤和MPNST的小鼠相对容易，可用于基因组研究以及全基因组规模的shRNA筛选21,25,26。该模型中表型的高外显率也使P0-GGFβ3小鼠在临床前试验中具有较高应用价值。然而应认识到，并非所有GEM癌症模型都具有这一特点。因此，我们强调了确定可预测发生肿瘤的动物比例的重要性。当使用肿瘤发生频率较低的动物模型时，我们发现采用磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）等影像学手段来明确识别携带肿瘤的个体，进而将其纳入临床前试验或其他研究，是一种有利策略。然而，若需重复扫描，该方法可能因成本过高而难以实施。因此，我们也强调了明确所关注GEM模型的平均生存时间的重要性26——了解动物预期发生肿瘤的时间，可减少为识别具有目标表型个体所需的扫描次数，从而降低相关成本。

还需要认识到，小鼠体内体积较大的肿瘤实际上仍是相对少量的组织。在本方案中，我们建议将肿瘤组织均分为三部分，分别用于组织学/免疫组织化学分析、建立早期传代细胞培养以及目标生物分子（蛋白质、RNA、DNA）的提取。然而，肿瘤大小存在差异，若肿瘤体积较小，则可能无法获得足够的组织以进行上述分割。在此情况下，研究人员需判断应优先进行肿瘤诊断还是其他用途的组织利用。32在此情况下，我们的倾向是：在开展其他实验之前，必须先获得准确的诊断，以明确所研究的对象。我们发现，通常仅需使用不到三分之一的肿瘤组织即可建立明确的肿瘤诊断。在处理较小的肿瘤时，我们通常会取下一小块肿瘤组织，用组织学包埋纸包裹后放入组织盒中，以确保组织在后续处理过程中不会丢失。这种方法的缺点是，若需按照世界卫生组织（WHO）标准进行分级，可能会导致研究者对肿瘤的分级偏低；其原因是，癌症中常同时存在低级别和高级别的区域，若取样过小，则所得分级结果将取决于所取样本在肿瘤中的具体位置。

我们所描述的用于确定周围神经鞘瘤身份的方案在很大程度上依赖于免疫组织化学。尽管对于某些细胞类型偶尔可采用替代方法（例如，进行Unna染色以鉴定肥大细胞），但对于神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤中大多数细胞类型而言，这种情况并不普遍适用。因此，必须格外谨慎，确保所使用的免疫组织化学实验流程已得到适当优化。根据我们的经验，多个因素可能会影响诊断性免疫组织化学的结果。研究者在首次使用某种一抗时，必须进行梯度稀释实验；此外，在使用先前已优化过抗体的新批次时，也应重新进行梯度稀释实验33。同时必须注意确保试剂的新鲜度。根据我们的经验，过氧化氢和DAB在存放时间较长后特别容易失效，可能导致研究者错误地判断染色结果为阴性。

我们所描述的丛状神经纤维瘤、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）以及在MPNST鉴别诊断中需考虑的各种肿瘤的免疫组织化学谱，是我们在实践中最常遇到的情况21,25,26,34。然而，由于MPNST及其他此类恶性肿瘤常出现分化方向的异质性，研究者可能会遇到与本文所述略有不同的染色模式。正是由于这些细微差异，我们强烈建议在对新的基因工程小鼠（GEM）肿瘤发生模型进行表征时，团队中应包括一位具有经验的人类或兽医病理学家。在本方案中，我们已将世界卫生组织（WHO）分级系统应用于GEM模型及人类MPNST。我们倾向于使用该分级系统，是因为其分级标准相对明确，且便于在人类与小鼠MPNST之间进行比较2,28。但需要指出的是，WHO分级标准并未被所有病理学家一致接受，原因是目前尚不明确应用于MPNST的三个WHO等级是否能够有效预测患者的临床预后。因此，许多病理学家更倾向于将MPNST简单地分为低级别或高级别恶性肿瘤。按照这一分类方法，约85%的MPNST被视为高级别恶性肿瘤，其特征为活跃的有丝分裂活性、显著的细胞异型性和深染性，且常伴有肿瘤坏死。低级别MPNST则表现为较低的细胞密度、较轻的核深染以及较少的有丝分裂活性。

我们发现，异体移植早期传代的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞是验证这些细胞系致瘤性的简便方法。然而，当细胞未能成功建立异体移植模型时，需考虑一些问题32。根据我们的经验，尽管绝大多数早期传代的MPNST细胞能够成功建立异体移植，但偶尔也会遇到早期传代细胞系无法成瘤的情况。尽管如此，染色体微阵列比较基因组杂交（aCGH）和全外显子组测序结果表明，这些早期传代的细胞仍存在多种基因组异常，符合肿瘤细胞的特征25,26。此外，我们也发现某些早期传代的细胞状态不佳，通常是因为在收获用于移植前让细胞过度生长至汇合状态所致。因操作不当而受损的细胞（例如，使用非酶解细胞解离液孵育时间过长，或反复吹打次数过多）在移植后表现也较差。我们还需指出，文中所提及的移植建立所需时间是基于我们经验的估计值。偶尔我们会遇到某些早期传代细胞系虽能成功建立异体移植，但所需时间更长。

上述方法为表征新开发的外周神经系统肿瘤GEM模型的关键特征，以及准确诊断这些动物出现的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）提供了全面的手段。我们概述的建立早期传代MPNST细胞培养物并利用这些培养物进行同种移植的方法，也为GEM模型中鉴定出的肿瘤的致瘤性提供了明确证据。需要强调的是，在建立早期传代培养物时，我们并未进行单克隆筛选。尽管我们认识到将肿瘤细胞置于培养环境中时不可避免地会发生一定程度的筛选，但这些初步结果表明，早期传代GEM来源的MPNST培养物中鉴定出的突变与原发肿瘤中的突变高度相似。然而，通过aCGH分析，我们还发现，若将这些早期传代培养物继续进行更长时间的传代，其基因组将发生改变，并逐渐偏离这些肿瘤细胞早期传代时的基因组特征。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究工作获得了美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353 和 R01 NS109655 资助 S.L.C.；R01 NS109655-03S1 资助 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 资助 S.L.C.）以及美国国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 资助 S.L.C.）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 组织培养板康宁 Falcon353003
3,3'-二氨基联苯胺（DAB）Vector LaboratoriesSK-400
6孔板Corning Costar3516
乙酸Fisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 二抗（山羊抗小鼠）InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 二抗（山羊抗小鼠）InvitrogenA21043 或 A11004
Alexa Fluor 568 二抗（山羊抗兔）InvitrogenA11036
氯化铵（NH₄Cl）4ClFisher ScientificA661-500
BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23225
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP1600-100
钙调蛋白结合蛋白ABCAM E89，ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
细胞刮刀Sarstedt83.183
细胞刮刀康宁25-056-CI
圆形盖玻片Fisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid（基于d-柠檬烯的溶剂）Decon Laboratories5989-27-5
柠檬酸Fisher ScientificA104-500
细胞角蛋白ABCAM C-11, ab7753
结蛋白安捷伦 Dako 克隆 D33 (M0760)
二氨基联苯胺（DAB）溶液Vector LaboratoriesSK-4100
DMEM康宁15-013-CV
伊红Y赛默飞世尔科技7111
乙醇（200 证明）Decon Laboratories2716
胎牛血清Omega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
甘油Sigma-AldrichG6279
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）康宁21-022-CV
哈里斯苏木精Fisherbrand245-677
血细胞计数板Brightline-Hauser Scientific1490
盐酸Fisher ScientificA144-212
过氧化氢Fisher Scientific327-500
Iba1和光纯药工业株式会社019-19741
ImmPRESS HRP（过氧化物酶）聚合物试剂盒，小鼠抗小鼠Vector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP（过氧化物酶）聚合物试剂盒，马抗兔Vector LaboratoriesMP-7401
培养箱赛默飞世尔科技Heracell 240i CO₂培养箱
异氟烷PiramalNDC 66794-017-25
异丙醇Fisher ScientificA415
Ki-67细胞信号传导 12202
层粘连蛋白Thermo Fisher Scientific23017015
液氮
MART1ABCAM M2-9E3，ab187369
切片机
NestinMillipore 人源：MAD5236（10C2），人源：MAB353（Rat-401）
Neuregulin 1 beta内部由 S.L.C. 制备（也可从 R 获得，货号 396-HB-050/CF）&D Systems
神经纤维瘤蛋白Santa Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠杰克逊实验室5557
脱脂奶粉沃尔玛优质之选品牌
P0-GGFβ3只小鼠内部
石蜡LeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
4% 多聚甲醛赛默飞世尔科技J19943-K2
Permount（二甲苯封片介质）Fisher ScientificSP15-100
pH计Mettler ToldedoSeven Excellence, 8603
磷酸盐缓冲液（Dulbecco改良型）康宁20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2)，ab137078
聚-L-赖氨酸氢溴化物Sigma-AldrichP5899-5MG
便携式异氟烷麻醉机VetEquip 吸入式麻醉系统
PVA-DABCO（水性封片剂）默克生命科学10981100ML
电饭煲Beech Hamilton
S100B安捷伦 Dako Z0311  （现为 GA504）
SMAVentana Medical Systems 克隆 1A4
氯化钠Fisher ScientificS640
柠檬酸钠（二水合物）Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
钢制组织学模具
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 细胞信号传导 (CH48H11) #2569
组织包埋盒
甲苯胺蓝ACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
胰蛋白酶康宁25-051-31

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丛状神经纤维瘤基因工程小鼠1型神经纤维瘤病肿瘤分级免疫组织化学组织学分析施万细胞标志物早期传代培养肿瘤同种异体移植
在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤
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