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方法文章

在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

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DOI：

10.3791/65740

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2024年5月17日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

本文内容

摘要

我们已建立一种方法，用于评估基因工程小鼠中神经系统肿瘤是否能准确再现其人类对应疾病的病理特征。在此，我们将这些组织学技术、明确的病理学标准以及培养方法应用于P0-GGFβ3小鼠模型中发生的神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤。

摘要

患有常染色体显性遗传肿瘤易感综合征——1型神经纤维瘤病（NF1）的患者常出现丛状神经纤维瘤（PN），这些肿瘤随后可转化为高度侵袭性的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。若能获得可精确模拟人类NF1患者中PN向MPNST进展过程的基因工程小鼠（GEM）模型，将有助于深入理解PN转化为MPNST的机制。然而，现有的Nf1基因敲除GEM模型并不能完全重现这一过程。因此，我们开发了P0-GGFβ3小鼠模型，这是一种通过在雪旺细胞中过表达雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1（NRG1），从而高频率诱导PN形成并进展为MPNST的GEM模型。然而，为了确定P0-GGFβ3小鼠中肿瘤发生及恶性进展过程是否真实模拟了NF1患者体内的病理过程，我们必须首先证实P0-GGFβ3小鼠周围神经鞘瘤的病理特征与其人类对应肿瘤的病理特征一致。

本文介绍了利用P0-GGFβ3和P0-GGFβ3;Trp53+/-小鼠模型作为示例，在基因工程小鼠（GEM）模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专门方法。我们描述了用于诊断丛状神经纤维瘤（PNs）和恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）的组织学、免疫组织化学和组织化学方法，如何将这些肿瘤与其他病理表现相似的肿瘤类型相鉴别，以及如何对这些肿瘤进行分级。我们还讨论了从GEM来源的MPNSTs建立早期传代培养物的方法，利用免疫细胞化学对这些培养物进行表征，以及通过建立同种移植模型来验证其致瘤性。总体而言，这些技术可全面表征在GEM模型中出现的PNs和MPNSTs的病理特征，并对这些小鼠肿瘤与其人类对应物的病理学进行关键性比较。

引言

在过去三十年中，许多实验室尝试通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组，或过表达在人类癌症中过表达的基因产物，来构建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠（GEM）模型可用于多种目的，例如证实新引入的基因组修饰能够启动肿瘤发生、鉴定在肿瘤进展过程中继发发生的其他遗传或表观遗传改变，以及明确驱动肿瘤起始和进展的关键信号通路。与依赖免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同，GEM癌症模型具有完全功能的免疫系统，因此能更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而，在使用GEM癌症模型进行上述研究时，研究人员必须确认在GEM肿瘤中获得的观察结果与其对应的人类肿瘤具有相关性。这种验证应包括对GEM肿瘤病理学特征的全面评估，并确定GEM肿瘤的病理特征是否重现了相应人类肿瘤类型的病理表现。

肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）是影响人类神经系统的最常见遗传性疾病，其发生率约为每3,000至3,500名活产婴儿中1例1,2,3。NF1患者会在皮肤中（称为皮肤神经纤维瘤）以及大神经和神经丛中（称为丛状神经纤维瘤）出现多个良性的周围神经鞘瘤。尽管皮肤神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤均会因造成身体、行为和/或社交功能障碍而降低患者的生活质量，但丛状神经纤维瘤（PNs）尤其危险4,5。 这是因为PNs常转化为恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs），后者是一种侵袭性梭形细胞肿瘤，其生存率极低1,2。造成这种低生存率的主要原因是目前用于治疗MPNSTs的放疗和化疗方案效果不佳。然而，开发新的更有效的治疗方法一直面临挑战。这主要是因为尽管MPNSTs在NF1患者中较为常见，但总体上仍属于罕见肿瘤。因此，很难获得足够数量的人类肿瘤用于研究，也难以招募到足够的MPNST患者开展临床试验。为了克服这些局限性，研究人员已构建了多种基因工程小鼠（GEM）模型，旨在进一步揭示驱动神经纤维瘤发病机制及丛状神经纤维瘤向MPNST进展的异常机制，并推动候选治疗药物的临床前试验。

NF1 患者在 NF1 基因的一个拷贝中存在失活性突变。当施万细胞谱系中的某个细胞在另一个原本功能正常的 NF1 基因上发生失活性突变时，会触发神经纤维瘤的发生。然而令人意外的是，当构建携带生殖系 Nf1 失活性突变的小鼠时，这些小鼠并未出现神经纤维瘤6,7。随后的研究表明，当小鼠的施万细胞中 Nf1 基因完全缺失，同时其他所有细胞类型中 Nf1 呈单倍剂量不足（即 Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠）时，可发展出丛状神经纤维瘤，这提示在其他多种细胞类型中 Nf1 基因剂量的降低是神经纤维瘤发生所必需的8。即便如此，Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠中的丛状神经纤维瘤仍未能进展为恶性周围神经鞘瘤（MPNST），因此仅部分模拟了人类对应疾病的生物学特征。当 Nf1 突变与其他肿瘤抑制基因（如 Trp539 或 Cdkn2a10）的突变共同存在时，才可引发 MPNST 的发生；但在这些基因工程小鼠（GEM）模型中，MPNST 多为 de novo 发生，或起源于生物学潜能未明的非典型神经纤维瘤样肿瘤（ANNUBPs）11,12，而非由已存在的良性丛状神经纤维瘤转化而来（参见文献13,14 对这些模型的详尽综述，以及引入其他与 MPNST 相关的功能缺失突变（如 Suz12 和 Pten 基因）的其他模型15）。

这些小鼠模型对于确定NF1、TP53和CDKN2A等基因在NF1相关周围神经系统肿瘤发病机制中的作用，以及用于候选治疗药物的临床前试验具有不可估量的价值。然而，我们对丛状神经纤维瘤如何进展为生物学潜能不确定的非典型神经纤维瘤性肿瘤（ANNUBPs16），进而发展为恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的过程仍缺乏完整认识。近期有报道指出，Nf1和Arf基因缺失的小鼠可发展出ANNUBPs并进一步进展为MPNSTs，这在理解该过程方面取得了一些进展11。然而，目前尚无基于Nf1突变的小鼠模型能够完全模拟人类中所见的丛状神经纤维瘤向MPNSTs进展的全过程。此外，是否存在着多条不同的通路导致MPNSTs的发生尚不明确。因此，上述基因工程小鼠（GEMs）可能仅模拟了导致神经纤维瘤向MPNSTs进展及MPNST发病的多种不同通路中的某一部分。这一点由以下事实进一步强调：MPNSTs也可散发发生，且部分散发性MPNSTs显然并不携带NF1突变17,18。

尽管 Magollon-Lorenz 等人最近提出，至少部分缺乏 NF1 突变的散发性恶性周围神经鞘瘤（MPNST）实际上是黑色素瘤或另一种类型的肉瘤19，但我们近期报道了一例散发性 MPNST 及其来源的细胞系（2XSB 细胞），该肿瘤为 NF1 野生型20。在对原发肿瘤及 2XSB 细胞系进行特征分析过程中，我们系统性地排除了其他可能的诊断，包括黑色素瘤以及在散发性恶性周围神经鞘瘤鉴别诊断中常规需考虑的多种其他肉瘤类型20。此外，我们注意到 Magollon-Lorenz 等人承认，他们在所研究的三株散发性 MPNST 细胞系中的发现并不能推广至所有被鉴定为散发性 MPNST 的肿瘤，即不能据此推断所有此类肿瘤均非 MPNST。

为了构建一种神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）发病机制不一定依赖于特定肿瘤抑制基因突变的GEM模型，我们构建了转基因小鼠模型，其中在施万细胞特异性髓鞘蛋白零（P0）启动子驱动下，强效施万细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1（NRG1）发生过表达。0）启动子（P0-GGFβ3 小鼠)21我们先前已证实，人类神经纤维瘤、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）以及MPNST细胞系均表达多种NRG1异构体，同时表达介导NRG1信号传导的erbB受体酪氨酸激酶（erbB2、erbB3和erbB4），且这些erbB受体处于持续活化状态。22我们还证明了erbB激酶的药理学抑制剂能有效抑制恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的增殖22生存23和迁移24. 与我们在人类中的观察结果一致，P0-GGFβ3 小鼠可形成丛状神经纤维瘤25 高频率进展为恶性周围神经鞘瘤21,25我们已证明 P0-GGFβ3 MPNSTs 与其人类对应物相似，通常会发生突变 Trp53 和 Cdkn2a以及可能促进肿瘤发生的众多其他基因组异常25. 发生于P的恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）0-GGFβ3 小鼠不具有失活的 Nf1 突变。然而，通过遗传互补实验，我们证明了 NRG1 能够促进 P 中的肿瘤发生0-GGFβ3 小鼠主要通过与之发生改变的相同信号级联途径 Nf1 损失26；这一结论基于我们的发现，即用 NRG1 过表达替代 Nf1 存在时的损失 Trp53 单倍剂量不足 (P0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠）可产生发生恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的动物模型 从头合成，如顺式结构中所见Nf1+/-;Trp53+/- 小鼠27.

为了获得上述及其他相关信息，以证明 P0-GGFβ3 小鼠能够准确模拟 NF1 患者中观察到的神经纤维瘤发病过程以及神经纤维瘤向恶性周围神经鞘瘤（MPNST）进展的过程，我们已开发出一系列专门的方法，用于处理这些动物的组织样本，准确诊断其肿瘤，对这些小鼠中出现的 MPNST 进行分级，并建立和表征早期传代的 P0-GGFβ3 及 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 细胞培养体系，同时系统性地比较 P0-GGFβ3 PN 和 MPNST 以及 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 与相应人类肿瘤的病理特征。这些方法中的许多可推广应用于其他神经系统肿瘤的基因工程小鼠（GEM）模型。此外，其中部分方法还可更广泛地适用于肿瘤发生于其他器官部位的 GEM 模型。因此，本文将详细描述这些方法学流程。

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方案

本文所述操作程序已获得南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，并由经过适当培训的人员根据《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》及南卡罗来纳医科大学机构动物护理指南执行。

1. 确定P0-GGFβ3小鼠的肿瘤发生率和存活率，并鉴定这些动物中的肿瘤以进行进一步表征

  1. 生成用于评估肿瘤发生的实验小鼠群体。所需小鼠数量取决于肿瘤表型的外显率。为弥补此类损耗，初始群体数量应比预期最终所需动物数多出10%–15%。
    注意：我们确定了P中的肿瘤外显率0-在最初的50只GGFβ3小鼠队列中进行实证研究（其中6只因与肿瘤无关的原因死亡（如打斗））25.
  2. 每周评估动物健康状况三次，每次检查时记录体况评分，包括体重及行为变化。对于荷瘤或濒死小鼠（见下文注释），采用二氧化碳安乐死后进行颈椎脱位处死。记录死亡时的日龄。若肿瘤体表可见，记录肿瘤尺寸（长、宽、高）。
    注意：必须确保动物的肿瘤大小不得超过IACUC批准的最大允许尺寸和/或人道终点。
  3. 利用死亡年龄绘制Kaplan-Meier生存曲线，以确定平均死亡年龄和生存时间范围。
    注意：P0-GGFβ3 小鼠的平均死亡年龄为 261.5 天，范围为 74 至 533 天；本队列中 91% 的小鼠具有多个神经纤维瘤，71% 具有恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）21.
  4. 确定是否存在肉眼可见的肿瘤；如果存在，在无菌条件下解剖以判断肿瘤是否与外周神经相关，随后切除肿瘤。在 P0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠的周围神经鞘瘤最常出现在三叉神经和坐骨神经。即使在肉眼观察下未发现这些神经有明显肿瘤，也应按照下述方法对这些神经进行固定和包埋，以便检测是否存在微小肿瘤。微小肿瘤通常发生于与这些神经相关的神经节内。
  5. 将肉眼可见的肿瘤切成三块（图1A）。将组织块1用于组织学分析（石蜡切片、免疫组织化学和组织化学染色）。将组织块2用于建立低代次培养物。将组织块3使用液氮速冻，以备将来可能的实验（如免疫印迹、RNA和DNA提取）。
  6. 将样品1置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）中，4℃过夜固定 oC. 将动物其余身体部分浸入4%多聚甲醛中，于4 °C过夜固定。

2. 大体可见肿瘤的石蜡包埋及苏木精和伊红染色切片的制备用于初步诊断评估

  1. 大体可见肿瘤的石蜡包埋
    1. 将肿瘤组织块1在4%多聚甲醛中固定过夜后，用至少为组织体积10倍以上的PBS冲洗组织，每次15分钟；后续所有冲洗步骤均使用相同体积的PBS。重复此PBS冲洗两次，每次均使用新鲜PBS。
    2. 将肿瘤组织块1转移至70%乙醇中，在4 °C下于70%乙醇中孵育24小时。如需长期保存，可在上述条件下储存组织。
      注意：步骤 2.1.1 至 2.1.7 适用于无法使用商用组织处理仪的研究人员。若研究人员可使用组织处理仪，则应按照仪器预设程序，通过梯度乙醇和二甲苯对组织进行处理。
    3. 将肿瘤组织块转移至80%乙醇中，室温孵育30分钟。更换新鲜80%乙醇，再次孵育30分钟。
    4. 将肿瘤组织块1转移至95%乙醇中，室温孵育75分钟。重复孵育两次，每次均在新鲜的95%乙醇中继续孵育75分钟。
    5. 将肿瘤组织块转移至100%乙醇中，室温孵育60分钟。重复此60分钟孵育步骤两次，每次均使用新鲜的100%乙醇。
    6. 将肿瘤组织块1转移至基于d-柠檬烯的溶剂中，在室温下孵育30–60分钟。将肿瘤组织块1转移至新鲜的d-柠檬烯基溶剂中，继续在室温下孵育30–60分钟。
    7. 将肿瘤组织块1转移至1:1石蜡/柠檬烯基溶剂中，60℃孵育1小时 oC. 弃去1:1石蜡/d-柠檬烯基溶剂，将肿瘤组织块1转移至60 oC 石蜡，60°C 下孵育 20 分钟 oC. 在新鲜的 60 体积中重复孵育 oC 石蜡再次处理 20 分钟。将肿瘤组织块 1 在 60 °C 下浸入石蜡中过夜孵育 oC.
    8. 将石蜡基底倒入钢制组织学模具中，使其凝固。将肿瘤组织块1转移至石蜡基底表面，定位后立即用60 o将组织包埋盒放置于熔融的石蜡上，使其与石蜡充分接触。将模具转移至包埋机的冷凝侧，静置固化10–15分钟。
    9. 从模具中取出带有附着组织盒的石蜡块。在切片过程中，使用附着的组织盒将石蜡块固定在切片机上。
      注意：石蜡包埋块现在可于室温下长期保存。
  2. 制备肉眼可见肿瘤的苏木精和伊红染色切片。
    1. 使用切片机对肿瘤组织进行4-5 µm厚度切片，并将切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。
    2. 要进行苏木精和伊红（H&E) 染色时，将切片在基于d-柠檬烯的溶剂中室温孵育10分钟以脱蜡。更换新鲜的基于d-柠檬烯的溶剂，再次孵育10分钟。
    3. 将载玻片转移至100%乙醇中，室温孵育5分钟。将载玻片转移至新鲜的100%乙醇中，再次室温孵育5分钟。
    4. 将载玻片转移至95%乙醇中，室温孵育5分钟。将载玻片转移至新鲜的95%乙醇中，再次室温孵育5分钟。
    5. 将切片转移至70%乙醇中，室温孵育5分钟。随后转移至50%乙醇中，室温孵育5分钟。
    6. 将载玻片转移至蒸馏水中，在室温下孵育5分钟。
    7. 将切片浸入苏木精染液中，室温下染色5分钟。用流动的自来水冲洗1-2分钟。用70%乙醇中的0.5%盐酸溶液浸泡切片2-5次进行分化。在流动自来水浴中再次冲洗1-2分钟。将切片置于含0.5%冰醋酸的95%乙醇溶液中10秒。
    8. 用伊红-Y 在室温下染色 30 秒，然后将玻片转移至 100% 乙醇中 5 分钟。在基于 d-柠檬烯的溶剂中透明处理样品 5 分钟。
    9. 使用基于二甲苯的封片剂对载玻片进行封片，此时载玻片仍湿润着基于d-柠檬烯的溶剂。让封片剂过夜固化。
      注意： 不 使用水性封片介质。
  3. 准备无肉眼可见肿瘤的组织，以鉴定丛状神经纤维瘤和微小恶性周围神经鞘瘤（micro-MPNSTs）。将组织包埋于石蜡中，制备组织学切片，并用苏木精和伊红染色。
    1. 去除内脏器官，并将各器官的代表性组织部分包埋于石蜡中以制备组织切片&经染色的切片将用于显微镜下检测肿瘤的组织学证据（图 1B）。去除头部、前肢、后肢和尾部（图1C）。以检查脊髓和神经根 原位 为检测神经根肿瘤的迹象，将脊柱及相连的肋骨和软组织浸入0.3 M EDTA/4%多聚甲醛（pH 8.0）中，在4℃下脱钙48–72小时 oC；然后用1×PBS冲洗样本。脱钙结束后，尝试用针头刺穿椎体以确认脱钙是否完全。若针头可轻松刺入骨组织且无碎裂声，则表明脱钙成功。
    2. 将脱钙后的脊柱及关联结构切成适合放入组织包埋盒的小块。按照步骤2.1.2-2.1.7所述，经梯度乙醇脱水，再使用以d-柠檬烯为基础的溶剂处理。按步骤2.1.7-2.2.1所述进行石蜡包埋，并制备4–5 µm切片。进行H& 按照步骤 2.2.2–2.2.9 所述进行 E 染色；让封片剂过夜固化。

3. 鉴别潜在的丛状神经纤维瘤并进行特殊染色以确认诊断

注意：我们强烈建议在评估基因工程小鼠肿瘤组织的苏木精与伊红（H&E）染色及特殊染色时，纳入具有经验的人类或兽医病理学家参与。

  1. 检查 H&使用明场显微镜观察上述方法制备的苏木精-伊红（H&E）染色切片，以识别潜在的周围神经鞘肿瘤。由于神经纤维瘤和恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）起源于周围神经，因此确定显微镜下肿瘤是否与周围神经相关至关重要。应识别出含有潜在周围神经鞘肿瘤的组织块，以便进行免疫组织化学染色及其他特殊染色，从而证实或排除诊断。
  2. 根据亮视野下观察到的组织学特征，区分潜在的PNs与MPNSTs/其他高级别肿瘤&E染色切片。人类PNs是一种轻度细胞增多的肿瘤，主要由具有细长且常呈波浪状核的细胞组成。在许多区域，细胞排列疏松，可能被黏液样细胞外物质分隔；PN中的PNs0-GGFβ3 小鼠具有相似的表型。通常不存在有丝分裂象；如果出现有丝分裂且肿瘤细胞中度至高度密集，则应诊断为恶性外周神经鞘瘤（MPNST）或其他类型的高级别肿瘤（见下文）。
  3. PNs 由肿瘤性施万细胞和肥大细胞等非肿瘤性细胞类型混合组成。为确认 PN 的身份，应对 H&E 染色中识别出的疑似 PN 组织块切片进行免疫染色，检测施万细胞标志物 S100β 和 Sox10 以及肥大细胞标志物 CD117（c-Kit）&E 染色（替代性肥大细胞标志物染色方案参见第 3.4 节）。进行 Ki67 免疫染色以确认低增殖率。
    注意： 表1 列出了用于常规鉴定GEM丛状神经纤维瘤的抗原标志物（S100β、Sox10、CD117、Ki67）、恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的诊断，以及对神经纤维瘤中其他共存细胞类型的全面评估；仅在首次描述新的GEM模型时，才会对上述后者抗原进行染色。请查阅抗体生产商提供的产品说明书以获取推荐的实验条件。注意抗体说明书是否建议进行抗原修复；并非所有抗原均需抗原修复步骤即可被检测到。
    1. 从选定的石蜡包埋块制备4-5 μm厚的切片，并将其贴附于带正电荷的载玻片上。按照步骤2.2.2–2.2.6中所述方法进行脱蜡处理。
    2. 用1×PBS冲洗切片3-5分钟。
    3. 如果抗体生产商建议进行抗原修复，则配制柠檬酸缓冲液。取9 mL柠檬酸溶液（10.5 g柠檬酸溶于500 mL蒸馏水中）与41 mL柠檬酸钠溶液（14.7 g柠檬酸钠溶于500 mL蒸馏水中）混合。
    4. 将切片放入柠檬酸盐缓冲液中，于加热的电饭煲内孵育20分钟以进行抗原修复。
    5. 将切片转移至3%过氧化氢/1x PBS中孵育10分钟，以消除组织中的过氧化物酶活性。
      注意：每次均需新鲜配制此溶液，若过氧化氢的储存液已存放超过3-4个月，则不得使用。
    6. 用1×PBS冲洗切片。
    7. 使用封闭缓冲液（含2% BSA、0.1% Triton X-100的1×PBS）封闭切片，室温孵育1小时。用1×PBS短暂漂洗载玻片。
    8. 向组织切片中加入一抗。用稀释的封闭缓冲液配制一抗，将切片于37℃孵育2小时。 o4°C 过夜 oC.
    9. 用1×PBS清洗载玻片，每次5分钟，重复3次。
    10. 将组织与生物素标记的二抗在室温下孵育1-2小时。
    11. 根据制造商说明书配制二氨基联苯胺（DAB）溶液，将切片浸入溶液中孵育2–10分钟。用蒸馏水洗涤切片5分钟。
    12. 将切片浸入苏木精染液中染色10-15分钟进行复染。用流水冲洗至流水清澈。将载玻片快速浸入酒精中并用水冲洗。
    13. 将载玻片依次浸入梯度乙醇中脱水，每种溶液快速浸入4-5次，顺序为70%乙醇、95%乙醇，最后100%乙醇。随后将载玻片置于基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。再将载玻片转移至另一批基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。
    14. 使用二甲苯基介质封片 封片剂
    15. 使用明场显微镜观察载玻片。
    16. 进行免疫荧光时，省略步骤 3.3.10–3.3.15。改为将组织与用封闭缓冲液稀释的种属特异性二抗在室温下孵育 1–2 小时。
    17. 用1×PBS冲洗载玻片5分钟，重复3次。
    18. 使用1×PBS/甘油封片。
    19. 使用荧光显微镜观察载玻片。
  4. 染色肥大细胞的替代方法：甲苯胺蓝染色
    1. 将1 g甲苯胺蓝O溶解于100 mL 70%乙醇中，配制甲苯胺蓝储备液。
    2. 将0.5 g氯化钠（NaCl）溶解于50 mL蒸馏水中，配制1%氯化钠（NaCl）溶液。搅拌至完全溶解。用HCl调节pH至约2.0–2.5。
      注意：每次染色时，该 NaCl 溶液必须 freshly 制备。
    3. 将 5 mL 品红蓝贮存液加入 45 mL 的 1% NaCl 溶液中，配制品红蓝工作液。充分混匀，并确保 pH 值约为 2.3。
      注意：pH 高于 2.5 会导致异染性染色减弱。每次染色时均需新鲜配制该溶液。
    4. 对固定在正电荷载玻片上的4-5 μm切片进行脱蜡，操作步骤如2.2.2–2.2.6所述。将脱蜡后的切片用流水冲洗2分钟。
    5. 用甲苯胺蓝工作液染色切片 2-3 分钟，蒸馏水中洗涤 2 分钟。
    6. 将切片在95%乙醇中浸入10次进行脱水。将玻片在100%乙醇中浸入10次。再将玻片在新鲜的100%乙醇中浸入10次。
    7. 将载玻片置于基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。将载玻片置于第二批基于d-柠檬烯的溶剂中孵育2分钟。
    8. 使用基于二甲苯的封片剂封片，此时载玻片仍被基于d-柠檬烯的溶剂润湿。
      注意： 不 使用水性封片介质。
    9. 使用明场显微镜观察载玻片。通过细胞质内深紫色颗粒的存在来鉴定肥大细胞。其他细胞类型被染成浅蓝色。

4. 特殊染色以诊断恶性周围神经鞘瘤并排除其他鉴别诊断

  1. 人源恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的组织学形态具有高度变异性，多种不同类型的肿瘤在形态上与MPNST相似28。由于MPNST起源于施万细胞谱系，应通过大体检查或对苏木精-伊红（H&E）染色切片进行明场显微镜检查，判断肿瘤是否起源于外周神经或既有的良性神经鞘瘤（PN）。尽管偶有MPNST并不与外周神经或PN相关（通常是因为在解剖过程中意外与神经分离、原有PN被MPNST过度生长所破坏，或病变为转移性病变），但仍应寻找肿瘤与神经或PN的关联性，若肿瘤未与神经或PN相关，则MPNST的诊断可能性较低。
  2. 从含有疑似MPNST的石蜡包埋块中制备4–5 μm厚的切片，并按照步骤2.2.1所述方法将其贴附于带正电荷的载玻片上。随后按照步骤2.2.2–2.2.6所述方法进行脱蜡处理。
  3. 按照步骤3.3.1–3.3.15所述方法，使用表2中列出的抗体组合进行免疫组织化学染色。
  4. 通过明场显微镜观察免疫染色结果。由于MPNST表现出施万细胞样分化特征，应观察S100β、nestin和Sox10是否存在均匀或局灶性的免疫反应性。若肿瘤对这三种标志物均呈阴性，可参考表2以确立诊断。
    ​注：人和小鼠的MPNST均可表现出异源性分化。例如，部分人源MPNST可出现局灶性横纹肌样分化（此类变异型称为恶性Triton肿瘤）；尽管这些肿瘤仍可表达施万细胞标志物，但同时也表达结蛋白（desmin）、MyoD1和肌生成素（myogenin）等肌肉标志物。对后一类标志物的免疫反应性不应妨碍研究者将其诊断为MPNST。尽管已有多种条件性表达SS18-SSX融合基因的小鼠模型用于模拟滑膜肉瘤的发病机制29，但据我们所知，尚无能自发产生相应融合转录本的滑膜肉瘤模型被报道。因此，我们不对GEM肿瘤检测SS18-SSX融合转录本，而是依赖免疫组织化学谱型进行判断。

5. 恶性周围神经鞘瘤的分级

  1. 确定是否存在肿瘤坏死，这是 WHO 4 级恶性周围神经鞘膜瘤（MPNST）的特征性表现。对于 4 级 MPNST，应观察是否存在明显的细胞丰富、活跃的有丝分裂活性（每 10 个高倍视野（40x）中 ≥4 个有丝分裂相）以及细胞学异型性。
    1. 若无坏死存在，则评估肿瘤是否具有细胞丰富、活跃的有丝分裂活性和细胞学异型性。若在无坏死的情况下上述特征均存在，则将该肿瘤分级为 WHO 3 级 MPNST。
    2. WHO 2 级肿瘤的特征是细胞密度增加，但程度低于 WHO 3 级和 4 级 MPNST。WHO 2 级 MPNST 肿瘤细胞的细胞核体积增大（大于神经纤维瘤中肿瘤细胞核大小的 3 倍）并伴有深染。有丝分裂活性增加（<每 10 个高倍视野 4 个有丝分裂相）可出现在 WHO 2 级肿瘤中，但并非诊断所必需。
      注：由于高级别肿瘤通常由低级别进展而来，同一 MPNST 中可能同时存在低级别和高级别区域。在此情况下，肿瘤的分级应依据其中最高级别的区域确定。
      注：在人类病理学领域，目前对于上述 WHO 分级系统是否能预测患者预后仍存在争议，部分病理学家更倾向于仅将 MPNST 分为低级别或高级别两类。在此分类方案下，高级别 MPNST 具有显著的细胞学异型性、活跃的有丝分裂活性（>每 10 个高倍视野 5 个有丝分裂相），以及明显的细胞丰富，可伴或不伴坏死；而低级别 MPNST 缺乏坏死，但其有丝分裂活性、细胞学异型性和细胞密度介于高级别 MPNST 与具有未知生物学潜能的非典型神经纤维瘤样肿瘤（ANNUBP）之间。我们更倾向于采用上述分级系统，因为对于缺乏长期经验的研究人员而言，区分 ANNUBP 与低级别 MPNST 可能具有挑战性。

6. 初代 P0-GGFβ3 MPNST 细胞培养物的制备

  1. 从新鲜的2号肿瘤组织块（步骤1.5，图1A）中培养早期代次P0-GGFβ3肿瘤细胞。从此步骤开始保持无菌条件。
    1. 将肿瘤组织切成小块（2–4 mm），在含有10%胎牛血清、2 µmol/L佛司可林和10 nmol/L神经调节蛋白1β（NRG1β）的DMEM10（杜氏改良伊格尔培养基）中进行机械剪碎，置于100 mm组织培养皿中。
    2. 将培养皿置于37 oC、5% CO2条件下培养，使细胞从剪碎的组织片段中迁移生长，直至细胞融合。每3–4天更换一次培养基。
    3. 传代细胞培养物。吸除100 mm培养皿中的培养基，用PBS洗涤细胞，去除并弃去残留的组织碎片。吸除PBS后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在室温下消化2–5分钟。为促进细胞脱落，可轻轻敲击培养皿，并在光学显微镜下观察脱落情况；根据需要适当延长胰蛋白酶消化时间。
    4. 加入2 mL DMEM10以中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至离心管中，在500 × g条件下离心5分钟以收集细胞。吸除上清液，向细胞沉淀中加入5 mL新鲜DMEM10。
    5. 将细胞悬液分种至2–4个含有DMEM10的100 mm培养皿中。传代次数不得超过五代（见步骤6.1.3和6.1.4），之后维持在不含佛司可林和NRG1β的DMEM中培养。请记得在第2代时冻存细胞以备后续使用。

7. 通过免疫细胞化学法验证早期传代 MPNST 细胞的身份

  1. 将无菌的18 mm #1.5圆形玻璃盖玻片放入6孔无菌组织培养板的孔中。
    1. 将聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白溶液加入孔中，体积以能够覆盖盖玻片为宜。用塑料封口膜密封培养板以减少蒸发。于4 °C孵育过夜。次日早晨，用无菌PBS洗涤盖玻片3次。
      注意：我们曾尝试将早期传代的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞接种于未包被的盖玻片上，发现细胞在缺乏聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白包被的情况下贴壁效果不佳。
    2. 通过向含有盖玻片的每个孔中轻柔加入2 mL生长培养基中的细胞悬液，接种10,000个细胞。将培养板置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中过夜孵育。
    3. 次日早晨，用PBS漂洗盖玻片，每次5分钟，共2次。
    4. 用含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定细胞18分钟。
    5. 用PBS漂洗盖玻片，每次5分钟，共3次。如需保存，可用塑料封口膜密封培养板，并在此时置于4 °C保存。
    6. 配制新鲜的含50 mM NH4Cl的PBS溶液。将盖玻片在含50 mM NH4Cl的PBS中于室温孵育10分钟，以淬灭醛基。
    7. 将盖玻片在含0.3% Triton X-100的PBS中于室温孵育15分钟以通透细胞。随后用PBS漂洗盖玻片，每次5分钟，共3次。
    8. 将盖玻片在封闭缓冲液（含1%牛血清白蛋白、0.2%脱脂奶粉和0.3% Triton X-100的1x PBS）中于室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。
    9. 移除封闭缓冲液，加入识别原发肿瘤中MPNST标志物（通常为S100β、Nestin和Sox10）的一抗，用封闭缓冲液按预先确定的最佳稀释比例稀释后加入。用塑料封口膜包裹培养板，在湿盒中4 °C孵育过夜。
    10. 用PBS漂洗3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。加入用封闭缓冲液稀释的荧光标记二抗，室温孵育1小时。避光操作。
    11. 用PBS漂洗3次，每次5分钟。将盖玻片在1–5 µg的Hoechst染料中孵育10分钟。继续避光操作。
    12. 用PBS漂洗盖玻片5分钟。使用1:1的1x PBS/甘油封片剂封片。用荧光显微镜观察成像。

8. 异体移植早期传代肿瘤细胞以证明其致瘤性

  1. 将早期传代的 P0-GGFβ3 MPNST 细胞在 DMEM10 培养基中培养至 80% 汇合度。用室温的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）冲洗细胞一次。使用非酶细胞解离溶液处理细胞 30 秒至 1 分钟，以使其从基质上脱落。每 1 mL 非酶细胞解离试剂中加入 5 mL DMEM10。
    注意：细胞解离可能需要更长时间，最长可达 10–20 分钟。请参考试剂生产商的操作说明。
    注意：不要将细胞培养至完全汇合，因为这会降低移植效果。
    1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。在 5 × g 条件下离心 5 分钟，然后将细胞重悬于 100 µL DMEM10 中，浓度为 1–2 × 106 个细胞。在注射前将细胞置于冰上保存。
    2. 将 NOD-SCIDγ（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ）小鼠置于异氟烷挥发器的诱导室中进行麻醉。将动物俯卧放置，并用 70% 乙醇消毒注射部位。在注射前让消毒部位自然干燥。注射前使细胞恢复至室温。
    3. 在右侧胁腹部皮下注射 1–2 × 106 个细胞。将小鼠单独置于无垫料的笼子中，并让其恢复。确保仅笼子的一部分置于加热垫上，以防止低体温。这样可为小鼠提供一个可移动的温度调节区域，以防过热。
      注意：我们对每种早期传代细胞系至少移植三只小鼠，因为部分移植物可能无法成功生长。
    4. 让移植物生长 15–60 天；每周检查动物健康状况 3 次，并在每次检查时记录体况评分，包括体重和行为变化。对达到最大允许肿瘤尺寸或处于濒死状态的小鼠，采用二氧化碳安乐死法，随后进行颈椎脱位。记录死亡时的日龄。当肿瘤在体表可见时，记录肿瘤尺寸（长度、宽度和高度）。
      ​注意：根据我们的经验，不同早期传代的 MPNST 细胞系在移植效率和移植物生长所需时间上存在差异。不得允许动物超过 IACUC 批准的最大允许肿瘤尺寸和/或人道终点。
  2. 收获肿瘤组织，用 4% 多聚甲醛固定，包埋于石蜡中，并按照第 2.1–2.2.9 节所述方法进行 H&E 染色，以确认异体移植物为肿瘤组织而非反应性组织。如有必要，对移植物进行免疫组织化学染色，检测原发肿瘤中存在的标志物。

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结果

图2展示了P0-GGFβ3小鼠中出现的肉眼可见肿瘤的示例。通过肉眼即可识别的肿瘤可能表现为导致身体部位膨出的肿块，如图2A所示（箭头）。在判断肿瘤是否可能为周围神经鞘瘤时，关键是要确认肿瘤与周围神经相关联。在此例中，MRI扫描（图2B）显示肿瘤与坐骨神经相关（箭头所示）；该关联在处死小鼠并解剖肿瘤后得到证实。需要注意的是，肿瘤体积较大并不一定意味着其为恶性。本例中，对肿瘤进行组织学检查（图2C）表明其为神经纤维瘤。然而，大多数情况下，肉眼可见的肿瘤通常直到对小鼠进行尸体解剖时才能被发现。图2D展示了该动物臂丛内出现的一个较大、肉样的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。

图3 展示来自P的MPNST和神经纤维瘤的...

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讨论

本文介绍的组织学与生物化学方法为神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤（MPNST）发生机制的基因工程小鼠（GEM）模型的诊断与表征提供了框架。多年来，我们发现这些方法在评估GEM模型中发生的外周神经鞘膜肿瘤病理方面非常有用21,25,26。然而，尽管本文概述的方案有助于确定GEM模型中肿瘤在多大程度上准确再现了人类对应肿瘤的病理特征，但这些策略仍存在一些局限性，需加以认识。首先，P0-GGFβ3 小鼠的肿瘤表型几乎完全外显，这使得获得大量带有神经纤维瘤和MPNST的小鼠相对容易，可用于基因组研究以及全基因组规模的shRNA筛选21,25,26。该模型中表型的高外显率也使P0-GGFβ3小鼠在临床前试验中具有较高应用价值。然而应认识到...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究工作获得了美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353 和 R01 NS109655 资助 S.L.C.；R01 NS109655-03S1 资助 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 资助 S.L.C.）以及美国国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 资助 S.L.C.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 组织培养板康宁 Falcon353003
3,3'-二氨基联苯胺（DAB）Vector LaboratoriesSK-400
6孔板Corning Costar3516
乙酸Fisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 二抗（山羊抗小鼠）InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 二抗（山羊抗小鼠）InvitrogenA21043 或 A11004
Alexa Fluor 568 二抗（山羊抗兔）InvitrogenA11036
氯化铵（NH₄Cl）4ClFisher ScientificA661-500
BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23225
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP1600-100
钙调蛋白结合蛋白ABCAM E89，ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
细胞刮刀Sarstedt83.183
细胞刮刀康宁25-056-CI
圆形盖玻片Fisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid（基于d-柠檬烯的溶剂）Decon Laboratories5989-27-5
柠檬酸Fisher ScientificA104-500
细胞角蛋白ABCAM C-11, ab7753
结蛋白安捷伦 Dako 克隆 D33 (M0760)
二氨基联苯胺（DAB）溶液Vector LaboratoriesSK-4100
DMEM康宁15-013-CV
伊红Y赛默飞世尔科技7111
乙醇（200 证明）Decon Laboratories2716
胎牛血清Omega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
甘油Sigma-AldrichG6279
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）康宁21-022-CV
哈里斯苏木精Fisherbrand245-677
血细胞计数板Brightline-Hauser Scientific1490
盐酸Fisher ScientificA144-212
过氧化氢Fisher Scientific327-500
Iba1和光纯药工业株式会社019-19741
ImmPRESS HRP（过氧化物酶）聚合物试剂盒，小鼠抗小鼠Vector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP（过氧化物酶）聚合物试剂盒，马抗兔Vector LaboratoriesMP-7401
培养箱赛默飞世尔科技Heracell 240i CO₂培养箱
异氟烷PiramalNDC 66794-017-25
异丙醇Fisher ScientificA415
Ki-67细胞信号传导 12202
层粘连蛋白Thermo Fisher Scientific23017015
液氮
MART1ABCAM M2-9E3，ab187369
切片机
NestinMillipore 人源：MAD5236（10C2），人源：MAB353（Rat-401）
Neuregulin 1 beta内部由 S.L.C. 制备（也可从 R 获得，货号 396-HB-050/CF）&D Systems
神经纤维瘤蛋白Santa Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠杰克逊实验室5557
脱脂奶粉沃尔玛优质之选品牌
P0-GGFβ3只小鼠内部
石蜡LeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
4% 多聚甲醛赛默飞世尔科技J19943-K2
Permount（二甲苯封片介质）Fisher ScientificSP15-100
pH计Mettler ToldedoSeven Excellence, 8603
磷酸盐缓冲液（Dulbecco改良型）康宁20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2)，ab137078
聚-L-赖氨酸氢溴化物Sigma-AldrichP5899-5MG
便携式异氟烷麻醉机VetEquip 吸入式麻醉系统
PVA-DABCO（水性封片剂）默克生命科学10981100ML
电饭煲Beech Hamilton
S100B安捷伦 Dako Z0311  （现为 GA504）
SMAVentana Medical Systems 克隆 1A4
氯化钠Fisher ScientificS640
柠檬酸钠（二水合物）Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
钢制组织学模具
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 细胞信号传导 (CH48H11) #2569
组织包埋盒
甲苯胺蓝ACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
胰蛋白酶康宁25-051-31

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