人类骨骼肌纤维类型鉴定

摘要

本方案展示了如何从冻干的人体骨骼肌中分离单根肌纤维，并利用点印迹技术根据肌球蛋白重链（MHC）同工型进行纤维类型分类。鉴定出的MHC I型和II型肌纤维样本可进一步通过蛋白质印迹法分析其纤维类型特异性的蛋白质表达差异。

摘要

本文所述技术可用于通过点印迹法鉴定单个肌纤维片段中的特异性肌球蛋白重链（MHC）同工型，下文简称肌球蛋白重链点印迹检测以鉴定肌纤维类型（MyDoBID）。本方案描述了人骨骼肌组织的冷冻干燥及单根肌纤维片段分离的过程。利用MyDoBID技术，分别使用针对MHCI和IIa的特异性抗体对I型和II型肌纤维进行分类。随后，将已分类的肌纤维按每份活检样本汇总为特定肌纤维类型的样品。

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和紫外光激活凝胶技术测定各样本中的总蛋白含量。使用蛋白质印迹法（western blotting）验证样本的肌纤维类型。本文还阐述了进行蛋白上样量归一化的重要性，以增强在多个蛋白质印迹实验中对目标蛋白的检测效果。相较于单根肌纤维的蛋白质印迹分析，将分类后的肌纤维整合为特定纤维类型的样本具有多项优势，包括样本适用性更广、样本通量更高、所需时间更短以及成本更低，同时仍能保留使用匀浆化肌肉样本时常被忽略的有价值的纤维类型特异性信息。本实验方案的目的是实现对冻干人骨骼肌样本中分离出的I型和II型肌纤维进行准确且高效的鉴定。

随后将这些单根肌纤维进行组合，以制备I型和II型肌纤维特异性样本。此外，本方案进一步扩展，通过使用肌动蛋白（Actin）作为标志物来鉴定IIx型肌纤维：对MHCI和MHCIIa呈阴性反应的纤维，经蛋白质印迹法（western blotting）确认为IIx型纤维。每种肌纤维特异性样本随后均用于通过蛋白质印迹技术定量分析多种目标蛋白的表达水平。

引言

骨骼肌是一种异质性组织，其细胞的代谢和收缩特性各不相同，这取决于肌细胞（肌纤维）属于慢缩型（I型）还是快缩型（II型）。通过检测肌球蛋白重链（MHC）同工型可以确定纤维类型，这些同工型在收缩时间、缩短速度和抗疲劳能力等方面存在差异¹。主要的MHC同工型包括I型、IIa型、IIb型和IIx型，其代谢特征分别为氧化型（I型和IIa型）或糖酵解型（IIx型、IIb型）¹。这些纤维类型的比例因肌肉种类和物种而异。IIb型在啮齿类动物肌肉中广泛存在。人类肌肉中不存在IIb型纤维，主要由MHC I型和IIa型纤维组成，并含有少量IIx型纤维²。不同纤维类型的蛋白质表达谱存在差异，并可随年龄³、运动^4,5和疾病⁶发生改变。

在不同骨骼肌纤维类型中测量细胞反应常常被忽视或难以实现，原因在于通常采用肌肉匀浆（包含所有纤维类型的混合物）进行检测。单根肌纤维 Western blot 技术可对单个肌纤维中的多种蛋白质进行分析⁷。该方法此前已被用于获得利用匀浆制备样本无法获取的新型且具有信息价值的单纤....

方案

在无菌条件下，使用局部麻醉（利多卡因）和改良的手动负压吸引 Bergstrom 针，从 n = 3 名（2 名男性，1 名女性）年龄为 70–74 岁的受试者股外侧肌获取人体肌肉样本^11,12。这些样本来自先前一项经维多利亚大学人类研究伦理委员会（HRETH11/221）批准并遵循《赫尔辛基宣言》开展的研究¹³。 所有参与者均签署书面知情同意书，同意参加本研究。本方案所需全部材料的完整详情见材料表。此外，表 1 中提供了针对常见实验方案问题的故障排除策略列表。

1. 冷冻干燥

1. 将活检的肌肉样本保持在干冰上冷冻的同时，在天平上称量并去皮一个空的冷冻管。
2. 迅速称取至少 10 mg 湿重的冷冻组织，记录重量至小数点后一位。
3. 将组织放入已预先冷却的微量离心管中，管盖上已穿刺 3–4 个小孔，并将该管放入装有 2–3 粒干冰的小烧杯中。
4. 按照冷冻干燥机制造商的操作说明进行操作。
5. 确保冷冻干燥机上的所有阀门均已关闭，然后打开冷冻干燥机电源。
6. 使用控制面板检查真空设定值是否已设置为适用于....

结果

使用点印迹法鉴定单个 MHCI、MHCIIa 和 MHCIIx 肌纤维
MyDoBID 的一个特点是可对特定肌纤维中 MHCI、MHCII 和肌动蛋白（Actin）信号强度的差异进行分类（图 4A）。肌纤维类型的鉴定依据是 MHCI 和 MHCIIa 同工型的有无（图 4B）。有 6 根纤维未检测到 MHC 或肌动蛋白信号，表明未成功采集到肌纤维。该次点印迹实验的结果为：鉴定出 22 根 II 型纤维、7 根 I 型纤维和 3 根潜在的 IIx 型纤维；另有 2 个样本未能识别，6 个样本被归类为“无纤维”采集（图 4B，C）。对于未检测到 MHCI 或 MHCIIa 信号但肌动蛋白呈阳性的纤维，通过排除法将其鉴定为潜在的 IIx 型纤维。根据信号强度图谱对 MHCI 和 MHCIIa 的信号强度进行分类时，将“中等”或“饱和”强度的纤维分别合并为 I 型或 II 型样本。未识别出的纤.......

讨论

纤维收集
根据多年经验，大多数研究人员能够掌握该技术；然而，通过练习可提高纤维收集的速度和效率，从而更好地进行后续分析。为了能够分离出质量合格、可用于混合分析的30根单根纤维片段，建议每个样本收集50根纤维片段。建议仔细观看纤维收集操作视频，并完成两次练习（每次约50根纤维），以达到合理的操作水平。所有收集的纤维均需进行MyDoBID检测以鉴定纤维类型，从而评估该技术的操作效果。成功的操作表现为纤维样本中检测到的“无纤维”或“信号微弱”的MHC信号数量较少（见方案第5.1节）。

已知肌肉中可能存在混合型肌纤维，即同时含有 MHCI 和 MHCIIa 的纤维，或同时含有 MHCIIa 和 IIx^2,14的纤维。MyDoBID 的一个局限性在于无法确定混合型纤维的存在，因为对 MHCI 和 MHCIIa 抗体均呈阳性的样本可能是单根混合型纤维，也可能是采集到了两根独立的纤维。此外，MyDoBID 无法将 MHCIIa 纤维与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× 变性缓冲液	按配方制作	成分可从 Sigma-Aldrich 或其他化学试剂供应商处获取	1×变性缓冲液通过将3×变性缓冲液1与1×Tris-HCl（pH 6.8）按体积比1:3稀释制得。置于-20℃保存。 °C.
3x 变性缓冲液	按配方制备	成分可从 Sigma-Aldrich 或其他化学试剂供应商处获取	3×变性缓冲液包含：0.125 M Tris-HCl、10% 甘油、4% SDS、4 M 尿素、10% 2-巯基乙醇和 0.001% 溴酚蓝，pH 6.8。  -20℃保存 °C.
95% 乙醇	N/A	100% 乙醇可从任意公司采购	用超纯水稀释至95%2O.
兔抗肌动蛋白多克隆抗体	Sigma-Aldrich	A2066	用 BSA 缓冲液按 1:1,000 比例稀释。
分析天平	Mettler Toledo	型号：MSZ042101
抗体增强剂	赛默飞世尔科技	32110	产品名称为 Miser Antibody Extender Solution NC。
烧杯（100 mL）	N/A	N/A
台式离心机	Eppendorf	5452	型号名称：Mini Spin
封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉的洗涤缓冲液。	文凭	市售
BSA缓冲液：1 % BSA/PBST，0.02 % NaN3	BSA：Sigma-Aldrich              PBS：Bio-Rad Laboratories。NaN3 Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS：1610780                       NaN3S2002	牛血清白蛋白（BSA）、磷酸盐缓冲液（PBS）和叠氮化钠（NaN3）。4 ℃保存 °C.
盒带开启杆	伯乐生命科学公司	4560000	用于打开预制胶盒。
Chemidoc MP 成像系统	伯乐生命医学产品（上海）有限公司	型号：Universal hood III	任何具备免染凝胶成像功能的成像系统。
标准滤纸	伯乐生命医学产品（上海）有限公司	1704070	包含冰袋、转移托盘、滚轴、2 个胶片夹、滤纸、泡沫垫以及带线缆的盖子。
Criterion 细胞（Bio-Rad）	伯乐生命科学公司	1656001
ECL（增强型化学发光）	伯乐生命医学产品（上海）有限公司	1705062	产品名称：Clarity Max Western ECL 底物
电泳缓冲液 1x Tris 甘氨酸 SDS（TGS）	伯乐生命科学公司	1610772	将10倍浓度的TGS 1用超纯水按1:10比例稀释2O.
滤纸，0.34 毫米厚	Whatmann	3030917	3毫米厚，每包100张，315 × 335毫米
精细组织解剖镊	Dumont	F6521-1EA	珠宝匠’5号镊子
扁平塑料托盘/盖	N/A	N/A	足够大以放置膜，确保表面完全平整。
冷冻干燥系统	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L 带玻璃腔室样品台
-80℃冰箱 oC	N/A	N/A	任何能保持 -80 恒定温度的超低温冰箱 °C 是合适的。
凝胶释放器	1653320	Bio-Rad	在膜下移动以收集或转移膜。
灰色铅笔	N/A	N/A
Image Lab 软件	伯乐生命科学公司	N/A	图示基于软件版本 5.2.1，但也可使用其他版本。
培养箱	伯乐生命科学公司	1660521	任何可调节至37的培养箱 °C 即可满足要求。
灯	N/A	N/A
带搅拌子的磁力搅拌器	N/A	N/A
膜滚轮	伯乐生命科学公司	1651279	可购买转移试剂盒组合装。然而，若该产品不可得，任何表面光滑、长度足以滚过膜的圆柱形管均可替代使用。
微量离心管  (0.6 mL)	N/A	N/A
小鼠 IgG HRP 二抗	赛默飞世尔科技	31430	山羊抗小鼠 IgG（H+L），RRID AB_228341。用封闭缓冲液按 1:20,000 稀释。
小鼠 IgM HRP 二抗	Abcam	ab97230	山羊抗小鼠 IgM μ链。使用浓度与小鼠 IgG 相同。
肌球蛋白重链 I（MHCI）一抗	DSHB	A4.840	稀释范围：在BSA缓冲液中1:200至1:500。
肌球蛋白重链IIa（MHCIIa）一抗	DSHB	A4.74	稀释范围：在BSA缓冲液中1:200至1:500。
肌球蛋白重链IIx（MHCIIx）一抗	DSHB	6H1	稀释范围：在BSA缓冲液中1:200至1:500。
硝酸纤维素膜 0.45 µm	伯乐生命医学产品（上海）有限公司	1620115	用于蛋白质印迹分析。
培养皿盖	N/A	N/A
塑料镊子	N/A	N/A
动力包	伯乐生命科学公司	164-5050	产品名称：基础电源供应器
蛋白ladder	赛默飞世尔科技	26616	PageRuler 预染蛋白质标准品，10 至 180 kDa
PVDF 膜 0.2 µm	伯乐生命科学公司	1620177
兔源 HRP 二抗	赛默飞世尔科技	31460	山羊抗兔IgG（H+L），RRID AB_228341。稀释比例与小鼠二抗相同。
摇床	N/A	N/A
尺子	N/A	N/A
剪刀	N/A	N/A
体视显微镜	Motic	SMZ-168
stripping 缓冲液	赛默飞世尔科技	21059	产品名称：Restore Western Blot 剥离缓冲液
无绒布（无尘布）	Kimberly-Clark 专业	34120	产品名称：Kimwipe
转移缓冲液（1× Tris 甘氨酸缓冲液（TG），20% 甲醇）	TG：Bio-Rad Laboratories   甲醇：Merck	TG缓冲液：1610771           甲醇：1.06018	将10倍浓度的TG缓冲液用超纯水稀释2O至1×。加入100%甲醇至终浓度为20%甲醇。4℃保存 °C.
转移托盘	伯乐生命科学公司	1704089
紫外活化预制凝胶	伯乐生命科学公司	5678085	凝胶类型：4–15% Criterion TGX 免染蛋白凝胶，26 孔，15 µL.
涡旋混合	N/A	N/A
洗涤缓冲液（1x TBST）	10x TBS：Astral Scientific  Tween 20：Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST 配方：将 10x Tris 缓冲盐水（TBS）用超纯水稀释至 1x2O，加入Tween 20至终浓度0.1%。将缓冲液于4℃保存 °C.
清洗容器	系统	市售	任何适合膜的大致尺寸的保鲜盒均可使用。