分裂视网膜作为研究脊椎动物视网膜内核层神经元的改进平装制剂

摘要

这项工作提出了一种替代的扁平安装视网膜制剂，其中去除感光细胞体可以更快地传播抗体并改善贴片移液器对视网膜内神经元的访问，以进行免疫组织化学、 原位 杂交和电生理学实验。

摘要

脊椎动物视网膜的双极细胞和水平细胞是光子被光感受器检测到后第一个处理视觉信息的神经元。它们执行基本操作，例如光适应、对比敏感度以及空间和颜色对立性。全面了解控制其行为的精确电路和生化机制将推动视觉神经科学研究和眼科医学的发展。然而，目前用于检查双极和水平细胞（视网膜整体支架和垂直切片）的制剂在捕获这些细胞的解剖结构和生理学方面的能力有限。在这项工作中，我们提出了一种从活的、扁平的小鼠视网膜中去除感光细胞体的方法，为有效的膜片钳和快速免疫标记提供了增强的双极和水平细胞通道。分裂视网膜的制备方法是将分离的小鼠视网膜夹在两块硝酸纤维素之间，然后轻轻地将它们剥离。分离将外丛状层上方的视网膜分裂，产生两块硝酸纤维素，一块包含感光细胞体，另一块包含剩余的内视网膜。与垂直视网膜切片不同，分裂视网膜制备不会切断视网膜内神经元的树突状过程，从而允许来自双极和水平细胞的记录，这些细胞整合了间隙连接耦合网络和宽场无长突细胞的贡献。这项工作证明了这种制剂在电生理学、免疫组织化学和 原位 杂交实验中研究水平和双极细胞的多功能性。

引言

视网膜是位于后眼的薄神经组织，光线被拦截并处理成可以被大脑解释的电化学信号。在视网膜的后部，视杆细胞和视锥细胞的光感受器受到光的刺激，从而降低了神经递质谷氨酸¹的强直释放速率。第一个经历并响应这种光诱导的谷氨酸浓度变化的神经元是双极细胞 （BC） 和水平细胞 （HC），它们的体细胞位于内核层 （INL） 的最外层区域。这些二阶神经元在视网膜中执行信号处理的第一阶段，并塑造视觉的关键特征，例如光适应、对比敏感度和空间/颜色对立度²。虽然这些功能已归因于 BC 和 HC，但这些过程背后的电路和生化机制尚不完全清楚³.因此，探索 BC 和 HC 生理学的工具和方法的进步至关重要。

垂直（横向）视网膜切片长期以来一直被证明是研究 BC 和 HC 的最实用模型;然而，在此模型下，实验者无法访问 BC 和 HC 生理学的某些方面。来自 HC 的直接记录或间接测量它们对 BC 的影响并不能反映视网膜的内源性连接，因为这些细胞的横向过程在切片过程中被切断。整个视网膜制剂通过保留这些侧向突来规避这个问题，但周围的视网膜层对进入^{这些细胞构成了}挑战4。虽然有大量来自全视网膜 INL 神经元的免疫染色⁵、⁶、^7、8 和膜片钳记录⁹ 的例子，但有机会加快和简化这些数据的收集。因此，横截面的固有局限性和整个支架模型的挑战激发了这种替代平坦支架视网膜制剂的开发。

以下工作描述了一种方案，用于从活的扁平安装视网膜中轻松去除感光层，以增强对 BC 和 HC 的访问，从而简化膜片钳和更快、更有效的免疫标记。剥离附着在孤立视网膜两侧的两片硝酸纤维素膜，通过感光器轴突撕裂组织，留下一个分裂的视网膜，保留外丛状层 （OPL） 和所有内视网膜层。虽然其他人已经描述了机械分离视网膜层的方案，但这些方法要么不适合膜片钳和显微镜应用，要么需要对组织进行繁琐的操作。其中一些方法需要冷冻或冻干组织进行层分离，这使得它们与电生理学实验不相容10,11,12。其他的则设计用于活组织，但需要用滤纸 ^4,11 连续剥离 5-15 次或用胰蛋白酶 ¹³ 处理以去除光感受器。这里描述的技术通过简化感光器去除程序和扩展下游应用库来改进其前身。

方案

随意向小鼠提供水和食物，并维持12小时的光/暗循环。小鼠通过暴露于异氟醚然后颈椎脱位而被安乐死。所有动物程序均符合美国国立卫生研究院指南，并经俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：应尽快进行眼球摘除、视网膜清扫和视网膜分裂，以保持活组织的健康。目标是在每只眼睛< 4 分钟内完成解剖。这三个步骤将按顺序执行。野生型小鼠：成年（>3个月）雄性和雌性C57BL/6J小鼠进行实验。对于突触形态学，使用在 Pcp2 启动子 （Pcp2-cre/GFP）¹⁴ 下表达绿色荧光蛋白 （GFP） 的小鼠。转基因小鼠：为了在免疫组化或电生理学实验期间使用GFP进行水平细胞可视化，使用三重转基因小鼠：vGATFLPo;vGlut2Cre;Ai80d的。vGATFlpo 和 vGluT2Cre 菌株是在其各自启动子下游表达 Flpo 或 Cre 重组酶的敲入小鼠。Ai80d 小鼠是一种交叉报告小鼠 （CatCh/EYFP），仅在表达 Cre 和 Flpo 重组酶的细胞中表达 Ca²⁺ 渗透通道视紫红质 （ChR2）。因此，三重转基因小鼠仅在具有VGAT和vGluT2表达历史的细胞中表达ChR2。

1、视网膜清扫和视网膜分裂的材料准备

1. 制备硝酸纤维素膜片
   注意：将分裂的视网膜从硝酸纤维素膜上分离可减少显微镜中的背景荧光并简化膜片钳记录。膜去除可以在组织固定之前或之后进行。对于固定的分裂视网膜，没有必要处理硝酸纤维素膜的碎片。对于活的分裂视网膜，根据步骤1.1.3-1.1.5处理膜，以促进与组织的温和分离。
   1. 将 16 片（或更多）硝酸纤维素膜切成 5 mm x 5 mm 的正方形。额外的可以散装并储存以备将来使用。
   2. 留出一半的膜片以备后用。这些碎片不会用封闭溶液处理。
   3. 将剩余的碎片在无洗涤剂的IHC封闭溶液（如3%马血清+ 0.025%NaN₃ 稀释的PBS中稀释）在室温下孵育10分钟，轻轻摇动。
      注意：处理 NaN₃ 时使用适当的 PPE，因为它是一种强效毒素。
   4. 在室温下在碳酸氢盐缓冲的Ames培养基中孵育10分钟，轻轻摇动，彻底洗涤膜片。
   5. 完全风干被堵塞的膜片（~20分钟）。在室温下标记并储存膜片，将它们与未经处理的膜片分开。
2. 准备 Ames 培养基
   1. 制备碳酸氢盐缓冲的Ames培养基，并在恒定碳化（95%O 2和5%CO₂）下将溶液保持在室温下。

2.小鼠眼摘除术

1. 根据机构IACUC指南，通过任何可用的方法对小鼠实施安乐死。
2. 将鼠标翻转到一侧，用两根手指轻轻按下眼窝周围。这将导致眼睛从颅骨中凸出。
3. 使用弯曲的解剖剪刀，剪断凸出的眼睛下方，切断视神经并将眼睛与颅骨分开。
4. 用剪刀挖出眼睛，然后将其放入装满冰冷的艾姆斯培养基的培养皿中。
   注意：对于组织在分裂后将固定的下游应用，可以使用冰冷的PBS代替Ames培养基。
5. 对剩余的眼睛重复步骤 2.1 - 2.4。

3. 视网膜夹层

1. 使用定制的玻璃转移移液器将一只眼睛转移到含有新鲜冰冷 Ames 培养基的新培养皿中。
   注意：定制移液器的大开口可防止组织意外挤压，使用玻璃可最大限度地减少组织与移液器壁的粘附。但是，如果实验者已经熟练使用该工具，则广口塑料移液器也是可以接受的。
2. 使用镊子将额外的结缔组织固定在培养皿的底部来稳定眼睛。然后，使用 25G 针沿着 锯齿线 刺穿眼睛，为 Vannas 剪刀创建一个入口点。
3. 使用Vannas剪刀沿着ora serrata线切割，直到角膜从眼睛的其余部分脱落（补充图1A）。使用镊子从眼罩上取下晶状体（补充图1B）。
4. 使用定制的玻璃移液器将眼罩转移到大体积（≥100 mL）的碳化Ames中，并用剩余的眼睛重复步骤3.1 - 3.3。
   注意：将眼罩放入碳化艾姆斯中以保持组织健康，同时对另一只眼睛进行解剖。
5. 将一个眼罩转移到装满新鲜碳化艾姆斯的培养皿中。
6. 使用Vannas剪刀，从巩膜边缘向内剪一小剪，然后使用两把镊子将巩膜从视网膜上剥离（补充图1C）。避免用镊子抓住视网膜。取而代之的是，拉开剪刀剪形成的巩膜瓣。
7. 使用Vannas剪刀剪断连接巩膜和视网膜的视神经（补充图1D），然后使用剪刀或镊子轻轻地从巩膜中撬开视网膜以隔离视网膜。（图1A）。
   注意： 虽然 RPE 通常会保持附着在眼罩上，但如果 RPE 附着在视网膜上，则无需额外步骤即可移除 RPE。此时，可以选择用手术刀修剪视网膜的边缘，以防止在压平步骤中卷曲（图1B）。
8. 使用手术刀将视网膜切成两半或四分之一（图1C），然后使用定制的移液管将碎片放回大体积（≥100mL）连续碳化的Ames培养基中。
   注意：半部分或四分之一的选择是主观的。为所需应用选择最佳选项。
9. 对剩余的眼睛重复步骤 3.5 - 3.8，然后再进行视网膜分裂。

4.视网膜分裂

1. 从培养皿中丢弃Ames培养基，并用新鲜碳化的Ames代替。
   注意：为了在视网膜分裂过程的剩余时间内保持碳化，大约每 5 分钟用新鲜碳化的 Ames 替换培养皿中的培养基。
2. 使用定制的移液器，将一块视网膜放在载玻片（7.5 cm x 5 cm）上，神经节细胞面朝上，然后通过精细的任务擦拭去除周围的液体将其压平（图1D）。如有必要，在解剖显微镜下用细尖画笔轻轻拉动视网膜边缘。
3. 使用镊子将干燥的5 mm x 5 mm硝酸纤维素膜降低到视网膜上，使其粘附在神经节细胞侧（图1E）。
   注意：如果需要从活组织中去除膜（即，用于电生理学），请使用一块干燥的血清处理膜进行此步骤（有关详细信息，请参阅步骤 1.1.3 - 1.1.5）。这降低了与神经节细胞层的粘附强度，使得分裂后更容易从硝酸纤维素中去除视网膜。
4. 将视网膜翻转过来，使硝酸纤维素停留在载玻片上，并将一块5mm x 5mm的干燥膜放在视网膜的感光侧（图1F）。
5. 将画笔的湿润尖端触摸到两个膜之间的空间，并允许毛细管作用将Ames吸入三明治中（图1G）。这减少了膜对视网膜的粘附，并且只有在视网膜被精细的任务擦拭过度干燥时才需要。
   注意：如果视网膜失去了光泽的外观，则表示它过度干燥，并且需要步骤4.5。
6. 为确保均匀粘附，用湿画笔对上膜施加轻微的向下压力（图1H）。
7. 在用一把镊子将下膜固定在玻璃上的同时，用第二把镊子用缓慢而稳定的动作轻轻地将上膜剥离。这将导致视网膜在OPL上方分裂（图1I）。
8. 丢弃含有感光器的上膜（图1J，左）。下膜包含内视网膜，以下称为分裂视网膜（图1J，右）。
9. 立即将分裂的视网膜放回碳化的Ames培养基。
   注：对于活组织的实验，视网膜可能受益于分裂后碳化Ames的15-30分钟恢复期。

图 1：分裂视网膜手术 。 （A）在冷PBS或Ames培养基中进行眼球剜除和眼罩制备后，将小鼠视网膜与眼罩分离，并用室温，碳化的Ames培养基替换PBS。（B） 使用手术刀，修剪视网膜的边缘，直到没有向内卷曲的区域（可选）。（C） 用手术刀将视网膜切成四分之一或两半。（D） 使用定制移液器将一块视网膜放在载玻片上（神经节细胞面朝上），并使用精细的任务擦拭去除所有多余的 Ames。在进行下一步之前，请确保半干性视网膜平放在玻璃上。使用艾姆斯湿润的画笔笔尖轻轻展开视网膜上不平坦的区域。（E） 使用镊子，将一块预先切割的干燥硝酸纤维素膜 （5 mm x 5 mm） 放在扁平的视网膜上。（F）翻转硝酸纤维素片，使视网膜的感光侧现在朝上。然后将另一片干燥的膜放在视网膜上。（G） 将刷子的湿尖端接触两层膜之间的空间，让毛细管作用将 Ames 吸入三明治中。这减少了膜对视网膜的粘附，并且只有在视网膜被精细的任务擦拭过度干燥时才需要。（H） 用湿画笔笔尖轻轻向下按压在夹层视网膜的中心。（I） 用一把镊子将底部的膜片固定在载玻片上，同时使用另一对镊子轻轻地将顶部的膜片从底部的膜片上剥离。（J）内视网膜（左）留在底膜上，而感光器（右）被顶膜拉开。图（A）、（B）、（C）、（D）和（J）使用解剖显微镜采集;比例尺表示大约 1 毫米;面板 （E-I） 是用智能手机摄像头拍摄的，没有放大倍率。 请点击这里查看此图的较大版本.

5. 免疫荧光实验用分裂视网膜的制备

注意：分裂的视网膜仍将附着在硝酸纤维素膜上，直到步骤 5.5。完成步骤 5.1、5.2、5.3 或 5.4，但不是所有四个步骤，因为这些步骤适用于不同的实验。

注意：使用适当的个人防护装备，并在处理多聚甲醛（固定剂）时小心操作。

1. 平贴免疫荧光的制备
   1. 使用足够的溶液将分裂的视网膜在冰上的4%多聚甲醛中孵育30分钟，以完全覆盖视网膜。
   2. 在 5-10 mL 室温 PBS 中洗涤分裂的视网膜 3 次。可选暂停：分裂的视网膜可以在4°C的PBS中保留长达24小时。
2. 裂开视网膜垂直切片的免疫荧光制备
   1. 使用足够的溶液将分裂的视网膜在冰上的4%多聚甲醛中孵育30分钟，以完全覆盖视网膜。
   2. 在 5-10 mL 室温 PBS 中洗涤分裂的视网膜 3 次。可选暂停：分裂的视网膜可以在4°C的PBS中保留长达24小时。
   3. 在膜仍附着的情况下，依次将分裂的视网膜浸入10%，20%和30%蔗糖中，在4°C下各浸泡1小时，以冷冻保护组织。
   4. 将冷冻保护的分裂视网膜嵌入最佳切割温度 （O.C.T.） 化合物中，并将它们储存在 -80 °C（长达 6 个月）直至冷冻切片。
   5. 从-80°C取出嵌入的分裂视网膜，并使用低温恒温器切割20μm厚的切片。将切片安装在带静电的玻璃显微镜载玻片上，让它们风干，然后在-20°C下储存长达6个月。
3. 双荧光 原 位杂交和免疫组化制备
   1. 使用足够的溶液将分裂的视网膜在冰上的4%多聚甲醛中孵育2小时，以完全覆盖视网膜。
   2. 在 5-10 mL 室温 PBS 中洗涤分裂的视网膜 3 次。可选暂停：分裂的视网膜可以在4°C的PBS中保留长达24小时。
4. 电生理学的准备
   1. 通过使用微量移液器拉拔器用细丝拉动厚壁硼硅酸盐玻璃移液器来准备贴片移液器。仅使用测量电阻在 6-10 MΩ 之间的移液器。
   2. 用含有（mM）的内部溶液回填拉出的移液器：125 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，5 HEPES，1 MgCl 2,1 CaCl 2,0.2 EGTA，3 ATP-Mg和0.5 GTP-Na。
5. 从硝酸纤维素膜上去除分裂的视网膜
   1. 使用疏水屏障笔，在显微镜载玻片（直径~1cm）上制备圆形孔，并使其风干5-10分钟。
   2. 将分裂的视网膜置于准备好的疏水屏障笔孔中，并加入足够的PBS以完全覆盖它们。
   3. 在解剖显微镜下，将细画笔的刷毛推到组织边缘下方，然后轻轻向上提起。以这种方式，在视网膜周围转圈，将其从膜上抬起。
   4. 使用镊子从漂浮的视网膜下方去除膜。
   5. 小心地吸出剩余的PBS，使视网膜片停在显微镜载玻片上，神经节细胞面朝下。
      注意：以下步骤不是按顺序执行的。为所需应用选择适当的方案（即免疫染色或双荧光原位杂交 [FISH] 和免疫组织化学 [IHC] 或电生理学）。

6. 免疫染色

1. 如果尚未制备，请使用疏水屏障笔在显微镜载玻片（直径~1cm）上创建圆形孔，并使其风干5-10分钟。所有孵育步骤和洗涤步骤都将在这些笔孔内进行。
2. 在室温下将分裂的视网膜或垂直分裂的视网膜切片在抗体孵育溶液（AIS：3%马血清，0.5%Triton X-100,0.025%NaN 3的PBS溶液）中孵育30分钟。
3. 在室温下用在AIS中稀释的一抗孵育分裂的视网膜或垂直分裂的视网膜切片1小时。
   注：一抗孵育时间需要针对不同的蛋白靶标和抗体进行优化。
4. 在室温PBS中洗涤组织3次。
5. 在室温下用在AIS中稀释的二抗孵育组织1小时。在室温PBS中洗涤组织3次。
6. 如果需要核染色，则在室温下用在PBS中稀释的DAPI孵育组织30秒。在室温PBS中洗涤组织1次。
7. 在每张纸巾上滴一滴载玻片封固剂，然后安装玻璃盖玻片。
8. 在盖玻片的边缘涂上指甲油以密封样品。将载玻片储存在4°C。

7. 双 FISH 和 IHC

1. 在杂交炉中在40°C下烘烤分裂的视网膜30分钟，以增加对载玻片的粘附。
2. 根据制造商的方案完成RNAscope FISH方案，但有以下例外和更改：
   1. 无需抗原修复步骤。使用蛋白酶III，在室温下孵育时间为18分钟。
   2. 在疏水屏障笔制成的孔内的载玻片上执行所有洗涤步骤。
3. 将样品在PBS中稀释的一抗（参见 材料表）中在杂交烘箱中在40°C下孵育30分钟。在室温PBS中洗涤样品3次。
4. 将样品在PBS中稀释的二抗（参见 材料表）中在杂交烘箱中40°C孵育30分钟。在室温PBS中洗涤样品3次。
5. 在室温下将样品在1x DAPI中孵育30秒。在室温PBS中洗涤样品1次。
6. 在每张纸巾上滴一滴抗褪色封固剂，然后安装玻璃盖玻片。
7. 在盖玻片的边缘涂上指甲油以密封样品。将载玻片储存在4°C。

8. 电生理学

1. 去除硝酸纤维素膜后，将分裂的视网膜转移到膜片钳记录室中，并用铂金竖琴轻轻将其固定到位。
2. 在整个实验过程中，用含有95%O₂ 和5%CO₂的Ames溶液连续灌注分裂的视网膜。将溶液保持在32-34°C之间。
   注意：在实验过程中，可以使用Dodt梯度对比显微镜观察组织。
3. 在房间照明下，执行全细胞电压钳位以记录 INL 神经元。
   1. 记录时，使用微孔细胞注射单元应用药物化合物，或使用 470 nm LED 刺激通道视紫红质 （ChR2） 模拟光响应。
      注意： 可以使用数字光功率计测量光强度。

9. 共聚焦显微镜

1. 对于共聚焦免疫荧光，使用40x / 1.3或63x / 1.40油浸物镜使用共聚焦显微镜拍摄图像。使用 FIJI 调整亮度和对比度，并从图像堆栈生成 Z 投影。

  

结果

视网膜分裂保留了感光器末端

为了确认视网膜分裂不会损害OPL中二阶神经元的树突，用突触囊泡蛋白突触素（绿色）和蛋白激酶Cα（PKCα;红色）的抗体对分裂视网膜的垂直切片进行染色。分裂视网膜顶部的突触素标记的强烈条带表明感光器突触末端被保留（图2）。此外，PKCα 染色显示杆状双极细胞 （RBC） 的正常形态。没有可见的感光细胞核，表明视网膜在OPL和最内层的感光细胞体之间分裂（图2）。

图 2：分裂的视网膜保留感光器末端。 荧光共聚焦显微照片显示了在分裂程序后冷冻切片（20 μm 厚度）的唾液视网膜的垂直横截面。每张图像都是共聚焦 z 轴堆栈的最大投影。该切片用抗 PKCα（上图中心）和突触素（右上）的抗体进行免疫标记，以分别观察红细胞和突触囊泡。合并的图像（底部）显示了突触囊泡（绿色），它位于感光器末端，就在 OPL 中红细胞（红色）的顶端突上方。细胞核用DAPI（蓝色）标记。在ONL内没有可见的感光细胞核。缩写：ONL = 外核层;OPL = 外丛状层;INL = 核内层;IPL = 内丛状层;GC = 神经节细胞。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

  

视网膜分裂后，OPL中的突触形态得以保留

使用在 pcp2 启动子¹⁴ 下的红细胞中表达 GFP 的小鼠对 OPL 中的突触前和突触后蛋白进行免疫标记，以评估分裂后该突触层的完整性¹⁴.尽管通过光感受器的轴突发生剪切力，但分裂不会扰乱OPL中光感受器-BC突触的形态，因为观察到标记为RGS11的红细胞树突和标记为CtBP2¹⁵ 的感光器突触带的正常定位（图3）。对于视杆细胞和红细胞之间的每个突触接触，RGS11 可以看作是位于突触带马蹄形（绿色）内的红色点状。在随后的实验中，抗 GPR179 抗体¹⁶ 用于标记突触后 ON-BC 树突状尖端¹⁶，抗 PSD-95 抗体用于标记突触前杆光感受器末端（补充图 2）。这些结果再次证实了OPL在分裂视网膜制备中的稳定性，因为红细胞树突被证明与其突触前伴侣杆状末端密切相关。

图 3：视网膜分裂后，OPL 中的突触形态得以保留。 在Pcp2启动子下在红细胞中表达GFP的转基因小鼠分裂视网膜的共聚焦免疫荧光图像。GFP表达水平（蓝色）在视网膜红细胞中各不相同。分裂后，将视网膜固定，然后与抗 CtBP2（绿色）和 RGS11（红色）的抗体一起孵育，分别标记感光器突触带和 ON-BC 树突状尖端。每对红绿代表杆和 ON-BC 之间的突触接触。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

视网膜分裂维持红细胞活力

为了评估分裂后视网膜内神经元的活力，使用了膜不可渗透的近红外核染料 （MI-NIR），该染料能够识别死细胞。用MI-NIR孵育后，固定分裂的视网膜，然后用抗PKCα标记以鉴定红细胞。 分裂视网膜的共聚焦显微照片揭示了整个组织中细胞活力的区域变异性，某些区域的细胞死亡率高于其他区域。这种变异性可能是由于在解剖、分裂或处理过程中对视网膜的某些区域造成的损伤造成的（图 4）。鉴于红细胞的细胞体位于INL的最外层区域，靠近分裂部位，因此有必要仔细评估其活力。PKCα 和 MI-NIR 的稀缺共定位证实，大多数红细胞在视网膜分裂后仍然存活（图 4）。

图 4：视网膜分裂后视杆状双极细胞是存活的。 荧光共聚焦显微照片以平坦的视角显示裂开的视网膜区域。分裂后，将活视网膜与MI-NIR染料（红色）在37°C下孵育30分钟。 然后固定视网膜并用抗PKCα抗体进行免疫标记，以可视化红细胞。在视网膜的这个区域，PKCα 和 MI-NIR 的共定位并不常见。MI-NIR 与不属于红细胞的细胞核（蓝色）共定位。 缩写：MI-NIR = 膜不可渗透的 NIR 活/死染色。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

  

分裂视网膜适合双重 FISH 和 IHC

通过延长标准 IHC 的固定时间，FISH 和 IHC 可以依次处理分裂的视网膜，以同时标记 mRNA 和蛋白质^17,18。实验证实，在 4% 多聚甲醛中固定 2 小时可产生稳健的 mRNA 标记，同时仍保留用于抗体结合的蛋白质表位。在分裂的视网膜上进行FISH，然后进行IHC，以可视化GABA_A受体亚基δ（GABRD;反义mRNA探针）的表达与红细胞（抗PKCα抗体）在外部INL中的位置的关系（图5A）。GABRD mRNA表达在红细胞中很少见（图5A）;然而，转录本由无长突细胞和神经节细胞大量表达，完整视网膜横截面上的标记模式证明了这一点（图5B）。在外部INL（图5A）中，与内部INL（图5C）相比，GABRD mRNA的分布更均匀，后者集中在不同的细胞中。靶向其他GABA受体亚基的反义探针产生不同的标记模式，证明了探针的特异性（数据未显示）。

图 5：分裂视网膜和完整视网膜中的双重 FISH 和 IHC。 （A、C） 平坦分裂视网膜的共聚焦显微照片和 （B） 完整视网膜的垂直切片。（A）和（C）中的图像分别是INL上部和下部区域光学截面的最大投影。（B） 中的虚线矩形表示用于创建 （A） 和 （C） 中所示投影的近似边界。将分裂的视网膜（A，C）固定2小时，然后用针对GABRD的反义mRNA探针标记（红色）。之后，用针对 PKCα 的抗体对分裂的视网膜进行染色以标记红细胞（绿色）。为清楚起见，PKCα通道在较低INL的投影中被省略。将（B）中的完整视网膜固定24小时后再切片。之后，用针对 GABRD 的反义 mRNA 探针标记固定视网膜（红色）。在盖玻片安装之前，所有样品均用DAPI（蓝色）染色20秒。缩写：INL = 内核层。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

分裂视网膜非常适合膜片钳从 BC 和 HC 进行电生理记录

要在传统的全视网膜中修补 BC 或 HC 胞体，移液器必须从神经节细胞侧或感光器侧接近。这两种方法都需要穿过几个视网膜层才能到达INL，在此期间，移液器吸头经常被碎屑阻塞。在振动切片制备中，BC 和 HC 胞体很容易接近，但它们的树突突可能会被切断，从而破坏它们的横向连接。然而，在分裂的视网膜中，红细胞和HC的细胞体位于组织表面，大大改善了贴片移液器的通路，同时保留了OPL的侧向回路。

图 6 显示了在分裂视网膜中从 BC 记录的化学模拟光响应。灌注的Ames培养基补充有III组mGluR激动剂L-AP4（4μM），以模拟黑暗中光感受器释放谷氨酸。将 mGluR6 拮抗剂 CPPG（600 μM，在 Ames 中）膨化到贴片细胞的树突上（保持在 -60 mV），以通过抑制 mGluR6 模拟光闪光。细胞以两种类型的向内电流响应 CPPG 喷气。一种类型显示瞬态电流，然后是平台期（图6A），类似于视网膜切片中红细胞记录的典型光诱发电流¹⁹。另一种类型在整个喷气持续时间内保持持续（图6B），类似于从ON锥体双极细胞（ON-CBC）记录的电流¹⁹。

对靶向HCs进行了一项单独的实验，HCs是一种具有宽树突状野的细胞类型，通常难以在切片制备中保存。使用在HCs中表达通道视紫红质（ChR2）和GFP的小鼠系，便于在荧光显微镜下进行识别。首先，记录来自HC的电流，以响应一系列去极化步骤（-100 mV至50 mV，步长= 15 mV），它们以向内电流和向外电流响应（图6C）。然后用短暂的蓝光脉冲（200 ms，470 nm）刺激这些细胞，在两个细胞中产生大的ChR2驱动的向内电流（图6D）。

图 6：分裂视网膜中 INL 神经元的膜片钳记录 。 （A） 推定的 RBC 和 （B） CBC 在含有 L-AP4 （4 μM） 的灌注 Ames 培养基中以 -60 mV 电压钳位。将CPPG（600μM）膨化到夹紧细胞的树突上会唤起向内电流，该电流在红细胞中是瞬态的，但在CBC中持续存在。（A） 中的红细胞记录是单条迹线，而 （B） 中的 CBC 记录代表 3 条迹线的平均值。（C） vGATFLPo 中来自 HC 的膜片钳记录;vGlut2Cre;Ai80d 鼠标。红线显示了 200 ms、470 nm 光脉冲的持续时间，该脉冲用于调用通过 ChR2 的大向内电流。 （D） 从电压钳位在 -60 mV 的 HC 注入电流响应，然后在 -70 mV 和 +35 mV 之间以 15 mV 的间隔步进，然后返回到 -60 mV。插图显示了电压阶跃开始前后的 6 ms 窗口中的相同迹线。（E） 平装分裂视网膜的免疫荧光显微照片显示 vGATFLPo 中表达 GFP 的水平细胞;vGlut2Cre;Ai80d 鼠标。比例尺 = 20 μm。以 20 kHz 采样率收集电生理学数据，并使用 5 kHz 的低通贝塞尔滤波器进行滤波。然后导出数据，并使用 Python 3 进行离线可视化和分析。 请点击这里查看此图的较大版本.

视网膜分裂可快速询问 INL 和 OPL 解剖结构

视网膜的外部限制膜 （ELM） 和 ONL 包含一个 ~90 μm 厚的屏障，它阻碍了抗体扩散到视网膜内层，并产生了次优的免疫染色条件^20,21,22。因此，使用传统的扁平视网膜对 OPL 或 INL 中的靶标进行免疫标记需要耗时的染色方案，通常需要 48-96 小时的抗体孵育⁵、⁶、⁷、⁸、^20、22。

去除光感受器可以使抗体快速渗透到视网膜内神经元。因此，使用染料偶联的一抗可以在短短 1 小时内实现视网膜内蛋白靶标的标记。针对PKCα和Calbindin-D的抗体分别用于标记INL的RBC和HC（图7）。与截断宽视野神经元横向突的传统垂直视网膜切片不同，分裂视网膜制备能够可视化宽视野细胞（如HCs）的完整树突状乔木（图6E， 图7）。

图 7：裂开视网膜中视网膜内蛋白的快速免疫标记。 从平面安装角度拍摄的裂合视网膜的共聚焦免疫荧光图像。将分裂的视网膜与抗PKCα（黄色）和钙结合蛋白-D（绿色）的抗体在室温下孵育1小时，分别标记ON-BCs和HCs。（A）每个单通道图像是由四个光学截面组成的平均Z轴投影：DAPI，平均z10-13;Calbindin-D，平均z11-14;PKCα，平均z11-14。（B） 在合并的图像中，叠加相同的投影。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充图1：视网膜清扫的关键阶段。 所有图像均使用安装在解剖显微镜目镜上的智能手机摄像头拍摄。（A） 切除角膜后小鼠眼睛的自上而下图像。（B） 取下晶状体后鼠标眼罩的自上而下的图像。（C） 在小鼠眼罩的巩膜上做一个小切口。箭头表示巩膜的两个皮瓣，它们被镊子向相反方向拉动，开始将视网膜与巩膜分开。（D）巩膜部分脱离视网膜后，将Vannas剪刀插入巩膜和视网膜之间，切断视神经，释放视网膜。红色虚线圆圈表示视神经头，剪刀显示正确的切割轨迹（在巩膜和视网膜之间插入剪刀）。巩膜后孤立的视网膜被撬开。 请点击这里下载此文件。

补充图 2：分裂视网膜中 OPL 突触前和突触后成分的特征。 来自分裂视网膜中 OPL 的共聚焦免疫荧光图像。将分裂的视网膜与针对 GPR179 和 PSD95 的抗体在室温下孵育 1 小时，分别标记到 ON-BC 的树突状尖端和杆状光感受器的末端。左图和中间图像是几个光学截面的最大投影;相同的投影叠加在最右边的图像中。ON-BC 树突尖端的 GPR179 点状物与杆状感光器末端密切相关，表明 OPL 内完整的突触接触。比例尺 = 10 μm。 请点击此处下载此文件。

补充图 3：故障排除：评估分裂视网膜的质量。 用DAPI染色的裂解视网膜的荧光显微照片，以可视化细胞核。可以根据细胞核的直径和组织深度来识别细胞。（A） 感光细胞核更小、更亮、更浅，而 （B） BC 细胞核更大、更暗、更深。（C） 感光器未完全去除的区域的低倍率图像。出现在焦点中的细胞核来自BCs，它比图像边缘上看起来失焦的感光细胞核更深。（A） 和 （B） = 20 μm 的比例尺。比例尺 （C） = 50 μm。 请点击这里下载此文件。

讨论

在光感受器将光子吸收转化为神经递质释放后，BC 和 HC 是第一个处理视觉信号的视网膜神经元²³。虽然这些神经元的重要性得到了很好的理解，但它们的许多功能尚未完全理解或完全未被探索。许多 BC 和 HC 生理学研究可能会受益于扁平安装视网膜制剂，该制剂可改善对 INL 神经元的访问，同时保持横向连接。分裂视网膜方法的开发代表了一种努力，旨在提供一种简单的协议，用于以平面安装方向从 BC 和 HC 获取高质量的电生理记录和显微镜数据。这里描述的分裂视网膜制备可以在视网膜分离后每只小鼠约20分钟（每个视网膜10分钟）内进行，而无需使用专门的设备。该方法从现有的感光器去除程序中汲取灵感，但在简单性、速度和多功能性方面提供了显着改进 4,10,11,12,13。与以前分离视网膜层的方法不同，视网膜分裂不需要冷冻、冻干或在视网膜上重复涂抹粘合剂。通过实践，几乎所有的光感受器都可以用硝酸纤维素膜在一次撕裂中去除。这种方法的速度和易用性使人们能够最大限度地减少视网膜从碳化艾姆斯中花费的时间，从而实现长时间的高细胞活力;分裂的视网膜可以在分裂后在碳化的 Ames 培养基中维持数小时。作为该制剂中INL神经元健康的证明，活/死细胞染色（图4）和膜片钳电生理学（图6）证实了分裂后红细胞和HC的活力。

在免疫标记过程中，分离视网膜中感光层的去除通过显着减少抗体进入 INL 的扩散时间，在免疫标记过程中具有显着优势。一抗和二抗标记可在 2 小时内完成，这比传统的平贴染色有了实质性改进，传统的平贴染色可能需要 72 小时或更长时间，具体取决于靶标⁵、^6、7、⁸、^20、22。因此，显微镜数据可以在组织制备的同一天获得，大大加快了免疫荧光实验的步伐。为了促进 mRNA 探针退火，FISH 实验通常推荐比免疫标记¹⁸ 更长的固定时间（~24 小时）。然而，这里介绍的实验表明，2 小时固定仍然会产生出色的 FISH 标记（图 5）。尽管将固定时间从 30 分钟延长到 2 小时，但无需执行抗原修复步骤即可获得出色的免疫标记，但这可能因抗体或抗原而异。FISH方案中的蛋白酶处理可能会干扰抗体标记，这可能是由于靶表位的破坏。通过使用靶向多个表位的多克隆抗体来规避这个问题，从而降低了表位破坏阻碍免疫标记的可能性。此外，使用适度的蛋白酶处理（ACD蛋白酶III）来防止过度的表位改变，同时仍提供足够的组织渗透。

有时，视网膜会分裂穿过外核层 （ONL），留下没有可见 INL 细胞的感光体层。为防止这种情况，应确保视网膜完全平放在玻璃上，并且已清除视网膜周围的任何残留液体。用画笔更牢固地按压硝酸纤维素也可能有助于防止通过 ONL 分裂。如果膜变得太湿或视网膜自行折叠，成功分裂的机会将大大降低。使用DAPI对细胞核进行染色有助于评估分裂的质量并确定剩余光感受器的覆盖率。感光细胞核更小、更亮、更浅（补充图3A），而BC细胞核更大、更暗、更深（补充图3B）。在某些情况下，撕裂的平面在视网膜上会略有不同，导致光感受器细胞体未完全去除的斑块（补充图3C）。对于显微镜和电生理学中的应用，这并不妨碍从正确去除光感受器的区域收集高质量数据的能力;使用贴片移液器成像或记录时，可以很容易地发现大面积暴露的内视网膜。如果需要更彻底地去除感光器，可以使用额外的硝酸纤维素膜进行第二次撕裂，尽管不能保证 100% 去除感光器。因此，在基因表达或蛋白质组学研究中使用分裂视网膜时，建议谨慎使用残留的感光器材料可能会影响结果。对于单细胞应用，这种担忧是没有根据的，因为来自光感受器的数据可以被排除在分析之外。

分裂视网膜制备的优点可能在宽场中间神经元的电生理记录中最为突出。传统的垂直切片切断了宽视场细胞的广泛过程，而分裂的视网膜制备使 OPL 和 IPL 完好无损，允许人们从宽视场细胞（如 HCs 24、A17s²⁵、TH ACs 26 和 NOS-1 ACs²⁷）捕获输入，否则这些输入在垂直切片中会被忽略。因此，对结果的解释以及与先前从视网膜切片收集的数据进行比较需要仔细考虑。尽管如此，在使用光刺激的药理学模拟物的实验中，这些结果类似于从视网膜切片记录的数据¹⁹。通过在细胞特异性启动子下表达 ChR2，可以在 INL 中记录 BC 的同时刺激所需的细胞群，以研究所需细胞对垂直信息通路的影响。在分裂的视网膜中，直接从更深的INL神经元（如无长突细胞）进行记录也是可行的。虽然在这种情况下，贴片电极必须首先穿过更浅表的INL神经元，但与传统的全贴片制备相比，阻碍其路径的组织要少得多。

除了测量宽场细胞对其他神经元的影响外，该方法还能够从 HC 直接进行单细胞膜片钳，HC 的树突在 OPL²⁸ 中形成广泛的间隙连接耦合网络。水平细胞向光感受器发送关键反馈，从而塑造垂直信息通过视网膜的传输。然而，由于HC的树突状场在垂直切片中被截断，因此缺乏单细胞记录数据。这项工作提出了解剖学和生理学上完整的HC，从中记录ChR2诱发电流的三转基因小鼠系（图6 CE）。在 ChR2 刺激之外，分裂视网膜可用于研究内源性 HC 电流和间隙连接耦合²⁸。虽然分裂视网膜为研究化学应用或 ChR2 刺激诱导的突触连接和神经元活动提供了一个方便的模型，但缺乏光感受器排除了对自然光反应或光适应机制的任何直接探索。

近年来，视网膜原位成像取得了令人钦佩的进展。然而，大多数影像学研究仅限于整个视网膜制剂中的神经节细胞层²⁹。作者设想，分裂视网膜中没有光感受器将使其成为OPL和INL中实时钙成像的理想模型。除了钙成像之外，该模型还具有与基因编码生物传感器（如 iGluSnFR^30,31、iGABASnFR 32 和 pHluorin ³³）一起使用的巨大潜力。结合分裂视网膜准备，这些强大的工具可能为探索有助于视网膜光处理的 BC 和 HC 的突触相互作用和生物物理特性提供有效的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 玻璃封面套	费舍尔布兰德	12544E
两对Dumont #5产钳	特德·佩拉	38125
25号针	贝克顿·迪肯森	305122
470 nm 发光二管	索拉布斯	M470L2
5-306弯剪刀	米尔泰克斯	5-306
9英寸一次性巴斯德烟斗和nbsp;	费舍尔布兰德	13-678-20D	用于构建定制转移移液器
Ai80d 鼠标	杰克逊实验室	25109	RRID：IMSR_JAX：025109
Ames中型含L-谷氨酸	美国生物	A1372-25
放大器控制软件	分子器件	Clampex 10.3 软件
抗钙结合蛋白D28K抗体	Invitrogen	PA-5 85669	RRID：AB_2792808，宿主物种=兔子;1：100稀释
抗CtBP2抗体	BD生物科学	612044	RRID： AB_399431，宿主物种=小鼠;1：5000稀释
抗GPR179抗体	匿名	匿名	基里尔·马尔捷米亚诺夫的赠礼;佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所;寄主物种=绵羊;1：1000稀释
抗PKCα抗体	西格玛-奥尔德里奇	P4334	RRID：AB_477345，宿主物种=兔子;1：5000稀释
抗PKCα抗体	圣克鲁斯生物技术	SC8393 AF594	RRID：AB_628142，宿主物种=小鼠;1：1000稀释
抗PSD95抗体	BD传导实验室	610495	RRID： AB_397862，宿主物种=小鼠;1：1000稀释
抗RGS11抗体	匿名	匿名	由特德·温塞尔赠送;德克萨斯州休斯顿贝勒医学院; 寄主物种=兔子;稀释时间介于1：1000到1：5000之间
抗突触激素P38抗体	西格玛	S-S5768	RRID：AB_477523，宿主物种=小鼠;1：1000稀释
水量装载介质	埃普雷迪亚	13800	滑套安装介质
C57BL/6J 鼠标	杰克逊实验室	000664	RRID：IMSR_JAX：000664
碳化剂罐	马瑟森	匿名	95%<氧>25%二氧化碳<>2
定制转移移液器	定制改装	匿名	说明：用剪刀在开始变细的部位剪掉血浆转移移液器的尖端。用钳子安全地切断玻璃巴斯德移液器最后2-3英寸的部分。将玻璃巴斯德移液器的窄端插入塑料转移移液器的宽顶端。在两件接合处缠绕透光膜以增强密封效果。
数字光功率计	索拉布斯	PM100D
解剖显微镜	蔡司	斯特米2000
电生理放大器	分子器件	Axopatch 200B
电生理显微镜	奥林匹斯	奥林匹斯，BX50WI	Dodt梯度对比显微镜
氟含剂-G	南方生物技术	0100-01
HC PL APO CS2 40x/1.3	徕卡	506358
HC PL APO CS2 63x/1.40	徕卡	15506350
杂交炉	罗宾斯科学	1000型	仅适用于RNAscope协议
伊姆梅奇疏水屏障围栏	向量实验室	H-4000
异氟醚	皮拉马尔重症监护	66794-017-25
Kimwipe（精细任务清除）	金科技科学	34155
徕卡 HC PL APO CS2 40x/1.3 油浸物镜	徕卡	506358
徕卡 HC PL APO CS2 63x/1.40 油浸物镜	徕卡	15506350
徕卡 TCS SP8 X 共軛焦显微镜	徕卡	已停产
中等15毫米培养皿	科宁	25060-60	视网膜剥离时眼睛会留在这里
Merit 97-275钢剪刀	功绩	97-275
微量移液器拔除器	萨特乐器	P-97
Mm-Gabrd-C2 mRNA探针	ACD	459481-C2
老鼠安乐死舱	匿名	匿名	定制改装;玻璃培养皿覆盖着一个小玻璃罐。
硝化纤维素膜过滤器	通用电气医疗生命科学;什么人	7184-005	0.45 和微型;孔径 m
皮科斯普里策	通用阀公司	皮科斯普里策二号及nbsp;	文中称为微细胞注射单元
塑料转印移液器	费舍尔布兰德	13-711-7M	用于构建定制转移移液器
塑料管	泰贡	R-603	连接碳化油罐
铂金竖琴	定制改装	匿名	用于在电生理记录室中锚定分裂视网膜。
0号画笔	通用	匿名	用于分裂过程中视网膜的平整。
SlowFade Gold 防褪色试剂	分子探针	S36937	文中称为防衰落安装介质
小型10毫米培养皿	猎鹰	353001	摘除后眼睛置于此处
小玻璃片（7.5厘米 x 5厘米）	通用	匿名	分离的视网膜片段被放置在该结构上进行分裂程序
Superfrost 加显微镜载玻片	费舍尔布兰德	12-550-15	静电玻璃显微镜载玻片
厚壁硼硅玻璃移液器，带丝材等;	萨特乐器	BF150-86-10HP
范纳斯剪刀;直线	泰坦医疗	TMS121	不是品牌特定;任何类似的剪刀都能用
vGATFLPo 鼠标	杰克逊实验室	29591	RRID：IMSR_JAX：029591
vGlut2Cre 鼠标	杰克逊实验室	28863, 016963	RRID：IMSR_JAX：028863，RRID：IMSR_JAX：016963
僵尸近红外可修复可行套件	生物传说	423105	文中称为MI-NIR