使用流式细胞术追踪miRNA释放到细胞外囊泡中

摘要

在这里，我们描述了一种简单的方案，该方案能够对荧光标记的microRNA的丰度进行 体外 评估，以研究microRNA包装的动力学并输出到细胞外囊泡（EVs）。

摘要

细胞外囊泡 （EV） 是细胞通讯的重要介质，由各种不同的细胞分泌。这些 EV 将生物活性分子（包括蛋白质、脂质和核酸（DNA、mRNA、microRNA 和其他非编码 RNA）从一个细胞运送到另一个细胞，导致受体细胞的表型后果。在所有种类繁多的 EV 货物中，microRNA （miRNA） 因其在塑造微环境和教育受体细胞方面的作用而受到广泛关注，因为它们在 EV 中具有明显的失调和丰度。其他数据表明，许多 miRNA 被主动加载到 EV 中。尽管有这些明确的证据，但对输出动力学和miRNA分选机制的研究是有限的。在这里，我们提供了一个使用EV-miRNA流式细胞术分析的方案，可用于了解EV-miRNA加载的动力学并识别参与miRNA输出的机制。在该方案中，预先确定在EV中富集并从供体细胞中耗尽的miRNA与荧光团偶联并转染到供体细胞中。然后使用 qRT-PCR 验证荧光标记的 miRNA 是否加载到 EV 中并从细胞中去除。作为转染对照和门控转染细胞群的工具，包括荧光标记的细胞RNA（细胞保留和EV耗尽）。在72小时内评估用EV-miRNA和细胞保留miRNA转染的细胞的荧光信号。与细胞保留的 miRNA 相比，EV-miRNA 特异性的荧光信号强度迅速降低。使用这种简单的方案，现在可以评估miRNA加载的动力学，并确定负责将miRNA加载到EV中的各种因素。

引言

MicroRNA （miRNA） 是小非编码 RNA 中表征最强的亚群之一，以其在转录后基因调控中的关键作用而闻名。大多数 miRNA 的表达和生物发生遵循一系列协调的事件，这些事件始于细胞核中主要 miRNA （pri-miRNA） 的转录。在微处理器复合物将核加工成前体 miRNA （pre-miRNA） 后，pre-miRNA 被输出到细胞质中，在那里它们被 RNase III 核酸内切酶进一步加工，切成 21-23 个核苷酸成熟的 miRNA 双链体¹。加工后的成熟 miRNA 的一条链与靶信使 RNA （mRNA） 结合，导致靶标降解或翻译抑制²。基于miRNA在同时调控多种不同靶标mRNA中的多效性作用，miRNA表达受到严格调控也就不足为奇^了3。事实上，不恰当的表达会导致各种疾病状态，尤其是在癌症中。miRNA 的异常表达不仅代表了疾病特异性特征，而且还已成为预后和治疗潜力的靶标 ^4,5,6。除了细胞内作用外，miRNA还具有非自主作用。例如，miRNA 可以被供体细胞选择性地包装成 EV 并输出到受体位点，在那里它们在正常和疾病生理学中引发不同的表型反应^....

方案

注意:作为使用该技术的先决条件，需要鉴定和验证选择性输出的miRNA。由于不同的细胞系根据分类到其 EV 中的 miRNA 货物而有所不同，因此建议在使用前评估目标细胞系和相关 EV 的 miRNA。此外，基于脂质的转染是该方案中的关键步骤之一;建议在设置实验之前预先确定转染效率。

1. 在培养物中培养细胞并用荧光团偶联的 EV-miRNA 转染细胞

1. 在适当的培养基中，将 200,000 至 400,000 个细胞分成一式三份，放入 6 孔板中。轻轻旋转板以确保细胞分布均匀。孵育细胞直到它们达到70%-80%的汇合度，大约24-48小时。
2. 对于每个要转染的孔，根据制造商的说明，将转染试剂稀释在微量离心管中的 100μL 无血清培养基中。
   注意:在此设置之前，应确定目标细胞系的最佳脂质浓度。
3. 对于每个要转染的孔，在 100 μL 无血清培养基中的微量离心管中分别稀释荧光团偶联的 EV-miRNA （2nM） 和细胞 miRNA （2nM）。
   注意:应根据转染的孔总数计算总体积。在该方案中，在 7 个时间点评估荧光;因此，步骤1.2的总体积为700 μL，步骤1.3的总体积为700 μL。此外，为了可靠地捕获阳性荧光细胞群，用户应使用非荧光加扰的 miRNA 转染细胞，并设置排除这些细胞的门。
4. 将稀释的RNA混合物（从步骤1.3开始）加入到稀释的转染试剂（....

结果

在这里，我们利用流式细胞术作为研究 miRNA 从细胞释放到 EV 中的强大工具。使用该方案，对转染细胞-miRNA和EV-miRNA的细胞进行流式细胞术分析显示，对应于EV-miRNA的荧光信号连续减少，而对应于细胞-miRNA的信号保留在细胞中。为确保荧光基团偶联不会干扰 miRNA 释放到 EV 中，将 miR-451a 偶联到两个单独的荧光基团（即 Alexa fluor 488 和 Alexa fluor 750）上，并评估细胞保留率。结果表明，转染后检测单独的荧光基团信号之间的变异性很小，验证了该方法的可靠性（图3A，B）。

由于各种原因可以解释细胞中荧光标记的miR-451a的损失，包括RNA降解，因此验证细胞损失与EV丰度相吻合至关重要。使用流式细胞术，以时间依赖性方式观察到与 Alexa fluor-488 偶联的 miR-451a 在 EV 中的积累，为有效包装和最终将 miRNA 释放到 EV 中提供了证据。相反，对应于细胞保留的miRNA的荧光信号，在EV中未检测到.......

讨论

新建立的方案能够在转染 EV-miRNA 后捕获 miRNA 释放到 EV 中的动力学。该方法允许同时分析多个 EV-miRNA 和细胞 miRNA，具体取决于细胞仪的功能。此外，虽然流式细胞术分析可以为EV miRNA生物学提供有价值的见解，但它并非没有局限性。尽管与其他技术结合使用时可以克服一些限制，以获得更全面的理解。

EV 生物学的一个新兴兴趣领域是理解 miRNA 选择性输出到 EV^{中 15,16}。虽然该协议提供了一个强大的工具来研究miRNA的选择性输出，但关键挑战之一是区分主动和被动输出。必须谨慎行事，因为在足够高的浓度下过表达 miRNA 可能会改变 miRNA 的输出，可能导致不适当的被动加载。因此，在研究选择性输出时，确定miRNA最佳转染浓度的实验至关重要。

此外，当该协议与纳米颗粒跟踪分析（NTA）等互补技术相结合时，研究人员能够评估EV颗粒计数，同时评估miRNA释放，并有可能区分E.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon 管	康宁	352097
6 孔透明平底表面处理过的组织培养板	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL，（PS80/110/500 和Si180/240/300/590/880/1300 nm）	Apogee Flow Systems	1527	设置颗粒检测的门控和参数
Attune Nxt 流式细胞仪	ThermoFisher Scientific	N/A	用于 EV 中的荧光分析
BD Fortessa 细胞分析仪	BD Biosciences	N/A	用于细胞中的荧光分析
细胞培养箱	N/A	N/A	保持温度为 37 >C 和 5% CO<>2
细胞培养基	N/A	N/A	对目标细胞系具有特异性
细胞系	N/A	N/	A 测试和评估目标 miRNA 的 EV 和细胞丰度的任何细胞系。
细胞-miRNA（miRIDIAN microRNA 模拟红转染对照）	地平线发现	CP-004500-01-05	预定被目标细胞系保留且未选择性输出到 EV 中的 miRNA（
荧光团偶联的 miRNA）	整合 DNA 技术 （IDT）		预定的 miRNA 选择性分选到 EV 中
荧光显微镜	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM 减血清培养基	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific 血球计数器	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS（用于细胞培养）	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA 逆转录酶	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR 绿色 PCR	Qiagen
mirVana RNA 分离	Qiagen	AM1561
无核酸酶	水 Fisher Scientific	4387936
多聚甲醛，4% PBS	Fisher	AAJ61899AK
试剂储液槽 未灭菌	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX 实时荧光定量 PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
胰蛋白酶 0.25%	Fisher
超速离心机	N/A	N/A