利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

摘要

在此，我们介绍一种简便的实验方案，可实现 体外 评估荧光标记的微小RNA（microRNA）丰度，以研究微小RNA在细胞外囊泡（EVs）中的包装与外排动力学。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由多种不同细胞分泌的重要细胞间通讯介质。这些EVs可在细胞之间转运包括蛋白质、脂质和核酸（DNA、mRNA、微小RNA及其他非编码RNA）在内的生物活性分子，从而在受体细胞中引发表型变化。在所有各类EV携带物中，微小RNA（miRNA）因其在EV中明显失调且丰度较高，且在塑造微环境和调控受体细胞功能方面发挥重要作用，已受到广泛关注。更多研究数据表明，许多miRNA被主动装载进入EVs。尽管存在这些明确证据，目前关于miRNA输出动态及其分选机制的研究仍较为有限。本文提供一种利用流式细胞术分析EV-miRNA的实验方案，可用于研究EV-miRNA装载的动力学过程，并鉴定参与miRNA外排的相关分子机制。在该方案中，预先确定在EVs中富集且在供体细胞中减少的miRNA被连接荧光染料后转染至供体细胞。随后通过qRT-PCR验证这些荧光标记的miRNA是否被成功装载入EVs并从细胞中减少。为同时实现转染对照及对转染细胞群体的设门分析，实验中还包括一种荧光标记的细胞内RNA（在细胞中保留、不进入EVs）。对同时转染EV-miRNA和细胞保留型miRNA的细胞，在72小时时间过程中检测其荧光信号。与细胞保留型miRNA相比，特异性针对EV-miRNA的荧光信号强度迅速下降。利用这一简便的实验方案，研究者可进一步评估miRNA装载的动力学特征，并鉴定参与将miRNA装载至EVs的各种关键因子。

引言

microRNA（miRNA）是小非编码RNA中最深入研究的亚群之一，以其在转录后基因调控中的关键作用而著称。大多数miRNA的表达与生成遵循一系列协调的事件，始于细胞核内初级miRNA（pri-miRNA）的转录。在细胞核内由微处理器复合物将其加工为前体miRNA（pre-miRNA）后，pre-miRNA被转运至细胞质，在细胞质中由RNase III内切酶Dicer进一步加工，形成21–23个核苷酸长度的成熟miRNA双链结构¹。成熟miRNA双链中的一条链会结合靶信使RNA（mRNA），导致靶标mRNA的降解或翻译抑制²。鉴于miRNA能够同时调控多个不同靶mRNA的多效性作用，miRNA表达受到严密调控也就不足为奇³。事实上，miRNA的异常表达与多种疾病状态相关，尤其在癌症中表现显著。miRNA的异常表达不仅可作为疾病特异性的分子标志，还逐渐成为预后判断和治疗干预的潜在靶点^4,5,6。除了在细胞内的作用外，miRNA还具有非自主性功能。例如，供体细胞可将miRNA选择性地包装进细胞外囊泡（EVs）中，并运输至受体细胞，在正常生理和疾病状态下引发多种表型响应^7<....

方案

注意：使用本技术的前提是必须先鉴定并验证选择性输出的miRNA。由于不同细胞系将其特定的miRNA装载到细胞外囊泡（EVs）中的情况各不相同，因此建议在使用前先对目标细胞系及其相应的EVs中的miRNA进行评估。此外，基于脂质体转染试剂（lipofectamine）的转染是本实验方案中的关键步骤之一，建议在正式开展实验前预先确定转染效率。

1. 培养细胞并转染荧光素标记的EV-miRNA

1. 在6孔板中，每孔接种200,000至400,000个细胞，每组设三个重复孔，加入适量培养基。轻轻摇动培养板以确保细胞分布均匀。将细胞培养至70%–80%汇合度，约需24–48小时。
2. 每个待转染孔中，将转染试剂用100 μL培养基稀释µ根据制造商说明书，将无血清培养基 L 加入微量离心管中。
   注意：在进行此实验设置之前，应针对目标细胞系确定脂质的最佳浓度。
3. 每个待转染孔，分别在微量离心管中用100 μL溶液稀释荧光素标记的EV-miRNA（2 nM）和细胞miRNA（2 nM） µ无血清培养基 L
   注意：总体积应根据转染的孔总数进行计算。在本方案中，荧光检测设置了7个时间点；因此，总体积为700 µ步骤1.2和700的L µ步骤1.3中的L。此外，为了可靠地捕获荧光阳性细胞群体，使用者应使用非荧光的乱序miRNA转染细胞，并设置门....

结果

在此，我们利用流式细胞术作为一种强大工具，研究miRNA从细胞释放到细胞外囊泡（EVs）中的过程。通过本方案，对转染了细胞miRNA和EV-miRNA的细胞进行流式细胞术分析，结果显示对应于EV-miRNA的荧光信号呈连续性降低，而对应于细胞miRNA的信号则保留在细胞内。为确保荧光染料偶联不影响miRNA向EVs中的释放，将miR-451a分别偶联至两种不同的荧光染料（即Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750），并评估其在细胞内的保留情况。结果表明，转染后不同荧光染料信号的检测之间变异极小，验证了该方法的可靠性（图3A，B）。

由于细胞中荧光标记的miR-451a丢失可能由多种原因引起，包括RNA降解，因此验证细胞中miRNA的减少是否与细胞外囊泡（EV）的数量增加相一致显得尤为关键。通过流式细胞术检测发现，与Alexa Fluor-488偶联的miR-451a在EV中呈时间依赖性积累，表明该miRNA被有效包装并最终释放至EV中。相比之下，对应于细胞内滞留miR.......

讨论

新建立的方案能够捕获转染EV-miRNA后miRNA向细胞外囊泡（EV）中释放的动力学过程。该方法允许同时分析多种EV-miRNA和细胞内miRNA，具体分析数量取决于流式细胞仪的检测能力。此外，尽管流式细胞术分析可为EV miRNA生物学提供有价值的见解，但其本身也存在局限性。然而，若将该技术与其他方法联合使用，则可在一定程度上克服部分局限，从而获得更全面的认识。

在细胞外囊泡（EV）生物学中，一个新兴的研究领域是理解miRNA选择性地被分泌到EV中的机制^15,16。尽管本实验方案提供了一种有力的工具用于研究miRNA的选择性分泌，但其中一项关键挑战在于区分主动分泌与被动分泌。需格外谨慎，因为当miRNA过表达至足够高的浓度时，可能改变其分泌行为，导致不适当的被动装载。因此，在研究miRNA选择性分泌时，确定miRNA转染的最佳浓度至关重要。

此外，当该方案与纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tra.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon 管	康宁	352097
6孔透明平底经表面处理的组织培养板	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL（PS80/110/500） &和 Si180/240/300/590/880/1300 nm	Apogee 流式系统	1527	设置粒子检测的门控和参数
Attune Nxt 流式细胞仪	赛默飞世尔科技	N/A	用于细胞外囊泡的荧光分析
BD Fortessa 细胞分析仪	BD 生物科学	N/A	用于细胞中的荧光分析
细胞培养箱	N/A	N/A	保持37℃温度 °C 和 5% CO₂2
细胞培养基	N/A	N/A	特定于目标细胞系
目标细胞系	N/A	N/A	任何已针对细胞外囊泡及细胞内目标miRNA丰度进行测试与评估的细胞系。
细胞miRNA（miRIDIAN microRNA模拟物红色转染对照）	视野发现	CP-004500-01-05	预先确定保留在目标细胞系中且未被选择性外排至细胞外囊泡（EVs）中的miRNA
EV-miRNA（荧光标记的miRNA）	Integrated DNA Technologies (IDT)		预先确定被选择性分选至细胞外囊泡中的miRNA
荧光显微镜	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM 低血清培养基	Fisher Scientific	31-985-070
豪斯科学血细胞计数板	Fisher	02-671-54
Hyclone 1× PBS（用于细胞培养）	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAiMAX	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA 逆转录酶	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA 提取	Qiagen	AM1561
无核酸酶水	Fisher Scientific	4387936
4% 多聚甲醛（PBS 配制）	Fisher	AAJ61899AK
非无菌试剂储液槽	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX 实时荧光定量 PCR	赛默飞世尔科技	N/A
0.25% 胰蛋白酶	Fisher	SH3004201
超速离心机	N/A	N/A