利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

摘要

在此，我们介绍一种简便的实验方案，可实现 体外 评估荧光标记的微小RNA（microRNA）丰度，以研究微小RNA在细胞外囊泡（EVs）中的包装与外排动力学。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由多种不同细胞分泌的重要细胞间通讯介质。这些EVs可在细胞之间转运包括蛋白质、脂质和核酸（DNA、mRNA、微小RNA及其他非编码RNA）在内的生物活性分子，从而在受体细胞中引发表型变化。在所有各类EV携带物中，微小RNA（miRNA）因其在EV中明显失调且丰度较高，且在塑造微环境和调控受体细胞功能方面发挥重要作用，已受到广泛关注。更多研究数据表明，许多miRNA被主动装载进入EVs。尽管存在这些明确证据，目前关于miRNA输出动态及其分选机制的研究仍较为有限。本文提供一种利用流式细胞术分析EV-miRNA的实验方案，可用于研究EV-miRNA装载的动力学过程，并鉴定参与miRNA外排的相关分子机制。在该方案中，预先确定在EVs中富集且在供体细胞中减少的miRNA被连接荧光染料后转染至供体细胞。随后通过qRT-PCR验证这些荧光标记的miRNA是否被成功装载入EVs并从细胞中减少。为同时实现转染对照及对转染细胞群体的设门分析，实验中还包括一种荧光标记的细胞内RNA（在细胞中保留、不进入EVs）。对同时转染EV-miRNA和细胞保留型miRNA的细胞，在72小时时间过程中检测其荧光信号。与细胞保留型miRNA相比，特异性针对EV-miRNA的荧光信号强度迅速下降。利用这一简便的实验方案，研究者可进一步评估miRNA装载的动力学特征，并鉴定参与将miRNA装载至EVs的各种关键因子。

引言

microRNA（miRNA）是小非编码RNA中最深入研究的亚群之一，以其在转录后基因调控中的关键作用而著称。大多数miRNA的表达与生成遵循一系列协调的事件，始于细胞核内初级miRNA（pri-miRNA）的转录。在细胞核内由微处理器复合物将其加工为前体miRNA（pre-miRNA）后，pre-miRNA被转运至细胞质，在细胞质中由RNase III内切酶Dicer进一步加工，形成21–23个核苷酸长度的成熟miRNA双链结构¹。成熟miRNA双链中的一条链会结合靶信使RNA（mRNA），导致靶标mRNA的降解或翻译抑制²。鉴于miRNA能够同时调控多个不同靶mRNA的多效性作用，miRNA表达受到严密调控也就不足为奇³。事实上，miRNA的异常表达与多种疾病状态相关，尤其在癌症中表现显著。miRNA的异常表达不仅可作为疾病特异性的分子标志，还逐渐成为预后判断和治疗干预的潜在靶点^4,5,6。除了在细胞内的作用外，miRNA还具有非自主性功能。例如，供体细胞可将miRNA选择性地包装进细胞外囊泡（EVs）中，并运输至受体细胞，在正常生理和疾病状态下引发多种表型响应^7,8,9。

尽管已有明确证据表明细胞外囊泡（EV）相关的miRNA是具有功能的生物分子，但目前尚不完全清楚特定miRNA亚群在癌症等疾病状态下如何发生异常调控，以及细胞机制如何选择并将miRNA分选至EV中^10,11。鉴于EV-miRNA在调控微环境中的潜在作用，明确特定miRNA外排机制对于全面阐明EV在细胞间通讯及疾病发生中的作用至关重要。理解miRNA向EV释放的过程，不仅有助于揭示miRNA外排的重要介导因子，还可能为潜在治疗策略提供线索。要达到这一认知水平，需要对现有工具进行优化，以准确回答这些新的实验问题。事实上，随着新技术和对照方法的引入，针对EV的研究正呈指数级增长^12,13。在评估外排miRNA在EV中丰度方面，目前的标准工具主要是高通量测序（下一代测序）和定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。尽管这些工具在评估EV中miRNA丰度方面具有实用价值，但其灵敏度和特异性存在局限性，且使用这些静态方法来研究动态过程是不足的。要解析miRNA向EV外排的动态过程，需要结合多种专用工具。本文介绍了一种利用荧光标记miRNA的综合性实验方案，用于分析miRNA从供体细胞释放及其进入EV的动态过程。我们还讨论了该方法的优势与局限性，并提供了优化使用的建议。本文所介绍的这一多功能方法，将有助于致力于研究miRNA向EV释放及其在细胞通讯和疾病中潜在作用的科研人员。

方案

注意：使用本技术的前提是必须先鉴定并验证选择性输出的miRNA。由于不同细胞系将其特定的miRNA装载到细胞外囊泡（EVs）中的情况各不相同，因此建议在使用前先对目标细胞系及其相应的EVs中的miRNA进行评估。此外，基于脂质体转染试剂（lipofectamine）的转染是本实验方案中的关键步骤之一，建议在正式开展实验前预先确定转染效率。

1. 培养细胞并转染荧光素标记的EV-miRNA

1. 在6孔板中，每孔接种200,000至400,000个细胞，每组设三个重复孔，加入适量培养基。轻轻摇动培养板以确保细胞分布均匀。将细胞培养至70%–80%汇合度，约需24–48小时。
2. 每个待转染孔中，将转染试剂用100 μL培养基稀释µ根据制造商说明书，将无血清培养基 L 加入微量离心管中。
   注意：在进行此实验设置之前，应针对目标细胞系确定脂质的最佳浓度。
3. 每个待转染孔，分别在微量离心管中用100 μL溶液稀释荧光素标记的EV-miRNA（2 nM）和细胞miRNA（2 nM） µ无血清培养基 L
   注意：总体积应根据转染的孔总数进行计算。在本方案中，荧光检测设置了7个时间点；因此，总体积为700 µ步骤1.2和700的L µ步骤1.3中的L。此外，为了可靠地捕获荧光阳性细胞群体，使用者应使用非荧光的乱序miRNA转染细胞，并设置门控以排除这些细胞。
4. 将稀释后的RNA混合物（来自步骤1.3）加入稀释后的转染试剂（来自步骤1.2）中，通过轻轻翻转离心管3–4次混匀。将脂质- RNA混合物在室温（RT）下孵育30分钟。
5. 从细胞中移除常规培养基，并加入 800 µ升无血清培养基至每孔。轻柔加入200 µ将1.4步骤中制备的脂质-RNA混合物逐滴加入细胞中。
   注意：转染目标细胞系（Calu6 细胞）时使用了 Opti-MEM 培养基。请尽量将脂质-RNA 混合物直接加入培养基中，避免将混合物加到培养板的侧壁上。

2. 在不同时间点收集转染细胞以分析荧光

1. 将转染后的细胞在 37 °C 下孵育 7 小时。
   注意：为了验证两种 miRNA（EV-miRNA 和 cell-miRNA）转染的一致性，可在转染后 3 小时收集一个孔中的细胞，使用流式细胞仪分析荧光信号。
2. 7 小时孵育结束后，移除各孔中的转染复合物，并更换为完全培养基。
3. 为评估 7 小时时间点，收集细胞并用 1× PBS 洗涤细胞三次。
   1. 若使用贴壁细胞，向一个孔中加入 200 µL 胰蛋白酶，等待细胞从培养板上脱落。将脱落的细胞转移至微量离心管中，在 200×g 离心 5 分钟以形成细胞沉淀。
   2. 小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。第一次 PBS 洗涤时，将沉淀重悬于约 500 µL 的 1× PBS 中，并按上述离心步骤再次离心收集沉淀。再重复 PBS 洗涤两次。
   3. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 的 2% 多聚甲醛（PFA）溶液中，随后进行荧光检测。
      注意：加入 2% PFA 后，细胞沉淀可在 4 °C 下保存 3–4 天。
4. 按照第 2.3 节中的步骤收集其余时间点的样本。收集所有保存的细胞沉淀，并继续进行第 3 节中的操作。

3. 细胞中细胞miRNA和EV-miRNA信号的流式细胞术分析

1. 为流式细胞术分析准备细胞。将第2节中的细胞悬液通过圆底聚苯乙烯FACS管配套的35 µm滤帽过滤，以去除可能干扰荧光素分析的碎片和细胞聚集体。
2. 按照校准说明设置仪器。打开流式细胞仪，使用前至少预热30分钟。用鞘液对流体系统进行引液，并检查和调整激光对准。
3. 运行质控程序以确认仪器流体系统状态。将超纯 过滤水加入流式细胞仪，以适当的流速运行足够长的采集时间。
   注意：适当的流速和采集时间取决于目标细胞类型、样本复杂性和所需的数据质量。
4. 打开流式细胞术数据分析软件，确认检测器和激光器的性能。根据目标细胞系和所选荧光染料设置阈值和电压参数。
   注意：所有后续实验均使用Calu6细胞。
   1. 将Calu6细胞信号捕获的阈值设为FSC 5000。每次实验重复分析1 × 10⁴个细胞。
   2. 为校正不同荧光染料之间的光谱重叠，使用未转染细胞以及仅单独转染一种荧光染料的细胞来设置补偿对照。
   3. 为检测miRNA的外排，使用与Alexa Fluor 488偶联的候选EV-miRNA（miR-451a和miR-150），以及与Cy3偶联的对照细胞miRNA（cel-miR-67）。
   4. 对于每个EV-miRNA，将荧光染料偶联至5p链的5′端。转染前，将荧光标记链与其100%互补的3p链退火配对。
   5. 对转染细胞进行表达分析时，使用FSC、SSC、FITC和PE通道，电压分别设定为258、192、269和423（图1A、B）。
5. 将阴性对照样本引入流式细胞仪。在自定义工作表中定义前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）强度后，捕获细胞信号。
6. 在图中选择FSC作为X轴，SSC作为Y轴，并通过在其周围绘制多边形圈选目标细胞群（见图1B，底部图）。
7. 使用已圈选的细胞群创建新图。
   1. 将X轴设为荧光信号1（FS1），用于检测细胞miRNA；Y轴设为荧光信号2（FS2），用于检测EV-miRNA。使用分别单独转染了各荧光标记miRNA的细胞，设置各荧光染料的补偿参数。在新图中圈选目标细胞群。
   2. 检测EV-miRNA时使用FITC通道，评估细胞miRNA信号时使用PE通道。在软件中，当X轴选择FITC、Y轴选择PE时，围绕同时呈FITC和PE阳性的细胞群绘制多边形以创建门控。
8. 记录门控细胞群的统计结果。
   1. 记录门控细胞群中同时呈FITC和PE阳性的细胞百分比，以及仅呈FITC或PE阳性的细胞百分比。
9. 对实验中其他任何样本或对照重复上述步骤。

4. 从转染细胞中分离细胞外囊泡

1. 对于在含血清培养基中培养的细胞，需从血清中去除细胞外囊泡（EVs），以防止交叉污染。
   1. 为制备无EV血清，先将血清用细胞培养基稀释至50%以降低黏度，然后将所得50%血清在110,000 × g 条件下离心18小时。
   2. 小心收集上清液（无EV血清），并使用0.2 µm滤器组件过滤。将所得50%无EV血清用于配制完全培养基，本例中为RPMI加10%血清。
   3. 为收集EVs，将去除了EV的完全培养基加入细胞中，孵育48小时后收集EVs。
      注：以下所述方案经Kowal等¹⁴的方案修改而来。
2. 将细胞在15 cm组织培养皿中培养至80%汇合度。按照本方案第1节中的转染步骤，分别在10 mL Opti-MEM中对细胞进行细胞内miRNA（cell-miRNA）和EV富集miRNA（EV-miRNA）的转染。
   注：并非所有转染方案均可线性放大。可能需要首先在15 cm培养皿中优化并评估转染条件。
3. 转染7小时后，吸除转染培养基，更换为去除了EV的培养基（15 mL）。将细胞在去除了EV的培养基中继续培养48小时。
4. 从细胞中收集条件培养基，并在生物安全柜内将其分装至50 mL离心管中。在4 °C条件下以2000 × g 离心10分钟，以去除死亡细胞和细胞碎片。将上清液转移至新的离心管中。
5. 将上清液在4 °C条件下以10,000 × g 离心40分钟。弃去上清液，并使用0.2 µm滤器组件过滤沉淀物。
6. 在生物安全柜内将过滤后的细胞培养基转移至无菌超速离心管中。称重并配平各管。在4 °C条件下以110,000 × g 离心90分钟，弃去上清液。
7. 用适量体积的1× PBS重悬沉淀物，洗涤后在4 °C条件下以110,000 × g 再次离心90分钟。
   注：本研究中根据所用固定角转子管允许的最大体积，将EV沉淀重悬于60 mL的1× PBS中。
8. 吸除PBS，将EV沉淀重悬于适当体积（50–100 µL）的新鲜1× PBS中，并涡旋混匀。将EVs储存于-80 °C以备后续使用。

5. 细胞miRNA和EV-miRNA在EVs中的流式细胞术分析

1. 为进行流式细胞术分析，将细胞外囊泡（EVs）用适量超滤的1×PBS稀释。
   注意：EVs流式细胞术分析的上样体积应根据样品中EVs的数量确定。大致而言，若EV悬液中约有30,000个颗粒，则最终体积应为1×PBS中的500–600 µL。洁净样品的颗粒浓度约为35–50个/µL。
2. 使用纳米流式细胞仪或具备足够检测能力的替代设备，以分析纳米级颗粒。
   注意：本实验中使用了Attune NxT纳米流式细胞仪。
3. 打开仪器软件，并按照推荐的校准说明设置仪器。使用性能纳米微球进行性能测试。若纳米微球在标准尺寸范围内被检测到，则表明仪器性能处于最佳状态。确定适合检测EV颗粒的流速。
4. 使用超纯过滤水运行质控程序，以确认仪器流路系统以及检测器和激光器的性能。
5. 使用适用于本实验的校准微球，设置流式细胞仪以准确检测不同尺寸的微球，并测量荧光信号。
   注意：在本实验的EV流式分析设置中，使用了ApogeeMix微球。该微球包含非荧光二氧化硅微球和荧光聚苯乙烯微球的混合物，尺寸范围为80 nm至1300 nm。
   1. 根据制造商提供的方案设置参数，以评估微球混合物中不同群体的灵敏度和分辨率。使用适当的设门方法将微球群体与仪器噪声区分开。
6. 在上样分析前，充分涡旋震荡样品，使EVs均匀分布。
7. 打开流式细胞术数据分析软件，引入超滤PBS。使用超滤PBS设置EV颗粒的设门策略，同时确保该设门范围与步骤5.5中微球所对应的颗粒适当尺寸一致。
8. 加载阴性对照样品，分析EVs通过流式细胞仪时的信号。在X轴绘制FSC、Y轴绘制SSC，以捕获EV信号。
   注意：捕获EVs时，SSC阈值设定为300；采集体积设定为从总共145 µL吸取体积中获取95 µL；流速设定为12.5 µL/min；分析基于1 × 10⁶个EV颗粒进行。EV群体具有异质性，因此分离过程中会伴随部分碎片。在FSC与SSC散点图中的总体颗粒检测显示出广泛的颗粒分布范围，这在使用粗提EV制备物时属预期结果。
9. 使用已设门的群体创建新图。
   1. 此次选择荧光信号1（FS1）用于细胞miRNA检测，置于X轴；荧光信号2（FS2）用于EV-miRNA检测，置于Y轴。
   2. 使用转染单一miRNA的细胞所分离出的EV样品，设置荧光染料的补偿参数。在新图中对目标EV群体进行设门。
   3. 对转染细胞来源EV中荧光标记miRNA的表达分析，使用FSC、SSC、BL1和YL1通道，电压单位分别设定为370、370、400和400（图2A，B）。
   4. 记录设门群体的统计结果，并通过直方图和点图进行可视化展示。
10. 对实验中其他任何附加样品或对照重复上述步骤。

6. 通过qRT-PCR验证miRNA在EVs中的释放

1. 使用 miRVana RNA 提取试剂盒，按照制造商说明书从细胞外囊泡（EVs）和亲代细胞中提取 RNA。
   注意：由于从 EVs 中提取的总 RNA 量通常无法达到标准 Nano-drop 的最低定量阈值，因此无法对 EVs 中提取的 RNA 进行准确定量。这主要是由于 EV 样品中核糖体 RNA 的缺失所致，可通过 Agilent Bioanalyzer 验证。因此，EV-RNA 定量的完整性评分通常不可靠，也不能真实反映 EV-RNA 的实际含量。因此，在进行 qRT-PCR 定量分析 EV-RNA 和细胞 RNA 时，应使用从相同数量细胞中提取后等体积的 RNA 样品。qRT-PCR 的归一化处理采用先前 RNA 测序数据确定的在多个样本中普遍存在的 miRNA 进行。
2. 使用专用于小 RNA 的逆转录试剂盒将提取的 RNA 转化为 cDNA。
3. 按照制造商说明书，以 cDNA 为模板并使用 miRNA 特异性引物进行 qRT-PCR 反应体系的构建。
   注意：在验证实验中，采用 miRCURY LNA qRT-PCR 试剂盒及厂家提供的相应引物，用于检测细胞 miRNA 和 EV-miRNA 的表达水平。

结果

在此，我们利用流式细胞术作为一种强大工具，研究miRNA从细胞释放到细胞外囊泡（EVs）中的过程。通过本方案，对转染了细胞miRNA和EV-miRNA的细胞进行流式细胞术分析，结果显示对应于EV-miRNA的荧光信号呈连续性降低，而对应于细胞miRNA的信号则保留在细胞内。为确保荧光染料偶联不影响miRNA向EVs中的释放，将miR-451a分别偶联至两种不同的荧光染料（即Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750），并评估其在细胞内的保留情况。结果表明，转染后不同荧光染料信号的检测之间变异极小，验证了该方法的可靠性（图3A，B）。

由于细胞中荧光标记的miR-451a丢失可能由多种原因引起（包括RNA降解），因此验证细胞中miRNA的减少是否与细胞外囊泡（EV）的数量增加相一致显得尤为关键。通过流式细胞术检测发现，与Alexa Fluor-488偶联的miR-451a在EV中呈时间依赖性积累，表明该miRNA被有效包装并最终释放至EV中。相比之下，对应于细胞内滞留mi...

讨论

新建立的方案能够捕获转染EV-miRNA后miRNA向细胞外囊泡（EV）中释放的动力学过程。该方法允许同时分析多种EV-miRNA和细胞内miRNA，具体分析数量取决于流式细胞仪的检测能力。此外，尽管流式细胞术分析可为EV miRNA生物学提供有价值的见解，但其本身也存在局限性。然而，若将该技术与其他方法联合使用，则可在一定程度上克服部分局限，从而获得更全面的认识。

在细胞外囊泡（EV）生物学中，一个新兴的研究领域是理解miRNA选择性地被分泌到EV中的机制^15,16。尽管本实验方案提供了一种有力的工具用于研究miRNA的选择性分泌，但其中一项关键挑战在于区分主动分泌与被动分泌。需格外谨慎，因为当miRNA过表达至足够高的浓度时，可能改变其分泌行为，导致不适当的被动装载。因此，在研究miRNA选择性分泌时，确定miRNA转染的最佳浓度至关重要。

此外，当该方案与纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tra...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon 管	康宁	352097
6孔透明平底经表面处理的组织培养板	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL（PS80/110/500） &和 Si180/240/300/590/880/1300 nm	Apogee 流式系统	1527	设置粒子检测的门控和参数
Attune Nxt 流式细胞仪	赛默飞世尔科技	N/A	用于细胞外囊泡的荧光分析
BD Fortessa 细胞分析仪	BD 生物科学	N/A	用于细胞中的荧光分析
细胞培养箱	N/A	N/A	保持37℃温度 °C 和 5% CO₂2
细胞培养基	N/A	N/A	特定于目标细胞系
目标细胞系	N/A	N/A	任何已针对细胞外囊泡及细胞内目标miRNA丰度进行测试与评估的细胞系。
细胞miRNA（miRIDIAN microRNA模拟物红色转染对照）	视野发现	CP-004500-01-05	预先确定保留在目标细胞系中且未被选择性外排至细胞外囊泡（EVs）中的miRNA
EV-miRNA（荧光标记的miRNA）	Integrated DNA Technologies (IDT)		预先确定被选择性分选至细胞外囊泡中的miRNA
荧光显微镜	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM 低血清培养基	Fisher Scientific	31-985-070
豪斯科学血细胞计数板	Fisher	02-671-54
Hyclone 1× PBS（用于细胞培养）	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAiMAX	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA 逆转录酶	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA 提取	Qiagen	AM1561
无核酸酶水	Fisher Scientific	4387936
4% 多聚甲醛（PBS 配制）	Fisher	AAJ61899AK
非无菌试剂储液槽	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX 实时荧光定量 PCR	赛默飞世尔科技	N/A
0.25% 胰蛋白酶	Fisher	SH3004201
超速离心机	N/A	N/A