使用流式细胞术追踪miRNA释放到细胞外囊泡中

摘要

在这里，我们描述了一种简单的方案，该方案能够对荧光标记的microRNA的丰度进行 体外 评估，以研究microRNA包装的动力学并输出到细胞外囊泡（EVs）。

摘要

细胞外囊泡 （EV） 是细胞通讯的重要介质，由各种不同的细胞分泌。这些 EV 将生物活性分子（包括蛋白质、脂质和核酸（DNA、mRNA、microRNA 和其他非编码 RNA）从一个细胞运送到另一个细胞，导致受体细胞的表型后果。在所有种类繁多的 EV 货物中，microRNA （miRNA） 因其在塑造微环境和教育受体细胞方面的作用而受到广泛关注，因为它们在 EV 中具有明显的失调和丰度。其他数据表明，许多 miRNA 被主动加载到 EV 中。尽管有这些明确的证据，但对输出动力学和miRNA分选机制的研究是有限的。在这里，我们提供了一个使用EV-miRNA流式细胞术分析的方案，可用于了解EV-miRNA加载的动力学并识别参与miRNA输出的机制。在该方案中，预先确定在EV中富集并从供体细胞中耗尽的miRNA与荧光团偶联并转染到供体细胞中。然后使用 qRT-PCR 验证荧光标记的 miRNA 是否加载到 EV 中并从细胞中去除。作为转染对照和门控转染细胞群的工具，包括荧光标记的细胞RNA（细胞保留和EV耗尽）。在72小时内评估用EV-miRNA和细胞保留miRNA转染的细胞的荧光信号。与细胞保留的 miRNA 相比，EV-miRNA 特异性的荧光信号强度迅速降低。使用这种简单的方案，现在可以评估miRNA加载的动力学，并确定负责将miRNA加载到EV中的各种因素。

引言

MicroRNA （miRNA） 是小非编码 RNA 中表征最强的亚群之一，以其在转录后基因调控中的关键作用而闻名。大多数 miRNA 的表达和生物发生遵循一系列协调的事件，这些事件始于细胞核中主要 miRNA （pri-miRNA） 的转录。在微处理器复合物将核加工成前体 miRNA （pre-miRNA） 后，pre-miRNA 被输出到细胞质中，在那里它们被 RNase III 核酸内切酶进一步加工，切成 21-23 个核苷酸成熟的 miRNA 双链体¹。加工后的成熟 miRNA 的一条链与靶信使 RNA （mRNA） 结合，导致靶标降解或翻译抑制²。基于miRNA在同时调控多种不同靶标mRNA中的多效性作用，miRNA表达受到严格调控也就不足为奇^了3。事实上，不恰当的表达会导致各种疾病状态，尤其是在癌症中。miRNA 的异常表达不仅代表了疾病特异性特征，而且还已成为预后和治疗潜力的靶标 ^4,5,6。除了细胞内作用外，miRNA还具有非自主作用。例如，miRNA 可以被供体细胞选择性地包装成 EV 并输出到受体位点，在那里它们在正常和疾病生理学中引发不同的表型反应 ^7,8,9。

尽管有明确证据表明 EV 相关 miRNA 是功能性生物分子，但尚不完全了解 miRNA 的特定亚群在癌症等疾病状态下如何失调，以及细胞机器如何选择 miRNA 并将其分类到 Evs^10,11 中。鉴于 EV-miRNA 在调节微环境方面的潜在作用，确定参与选择 miRNA 输出的机制以充分阐明 EV 在细胞间通讯和疾病发病机制中的作用至关重要。了解miRNA释放到EV中的过程不仅可以突出miRNA输出的重要介质，还可以为潜在的治疗方法提供见解。为了达到这种知识水平，需要调整工具以忠实地解决这些新的实验问题。事实上，由于新技术和控制措施的引入，评估电动汽车的研究呈指数级增长^12,13。在评估输出到EV中的miRNA的丰度方面，下一代测序和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）一直是当前的标准工具。虽然这些工具可用于评估 EV 中 miRNA 的丰度，但它们的灵敏度和特异性存在局限性，并且使用这些静态方法来评估动力学是不够的。描述miRNA输出到EV的动态需要结合使用专门的工具。在这里，我们提出了一个使用荧光偶联miRNA的综合方案，以分析miRNA从供体细胞释放和掺入EV的动力学。我们还讨论了该方法的优点和局限性，并提供了最佳使用建议。本文介绍的通用方法对于有兴趣研究 miRNA 释放到 EV 中的研究人员及其在细胞通讯和疾病中的潜在作用很有用。

方案

注意:作为使用该技术的先决条件，需要鉴定和验证选择性输出的miRNA。由于不同的细胞系根据分类到其 EV 中的 miRNA 货物而有所不同，因此建议在使用前评估目标细胞系和相关 EV 的 miRNA。此外，基于脂质的转染是该方案中的关键步骤之一;建议在设置实验之前预先确定转染效率。

1. 在培养物中培养细胞并用荧光团偶联的 EV-miRNA 转染细胞

1. 在适当的培养基中，将 200,000 至 400,000 个细胞分成一式三份，放入 6 孔板中。轻轻旋转板以确保细胞分布均匀。孵育细胞直到它们达到70%-80%的汇合度，大约24-48小时。
2. 对于每个要转染的孔，根据制造商的说明，将转染试剂稀释在微量离心管中的 100μL 无血清培养基中。
   注意:在此设置之前，应确定目标细胞系的最佳脂质浓度。
3. 对于每个要转染的孔，在 100 μL 无血清培养基中的微量离心管中分别稀释荧光团偶联的 EV-miRNA （2nM） 和细胞 miRNA （2nM）。
   注意:应根据转染的孔总数计算总体积。在该方案中，在 7 个时间点评估荧光;因此，步骤1.2的总体积为700 μL，步骤1.3的总体积为700 μL。此外，为了可靠地捕获阳性荧光细胞群，用户应使用非荧光加扰的 miRNA 转染细胞，并设置排除这些细胞的门。
4. 将稀释的RNA混合物（从步骤1.3开始）加入到稀释的转染试剂（从步骤1.2开始）中，并通过倒置试管3-4次轻轻混合。让组合的脂质-RNA混合物在室温（RT）下孵育30分钟。
5. 从细胞中取出常规培养基，并向每个孔中加入 800 μL 无血清培养基。将 200 μL 脂质-RNA 混合物（从步骤 1.4 开始）滴加到细胞中。
   注意:Opti-MEM 培养基用于转染目的细胞系（Calu6 细胞）。尝试将脂质-RNA混合物直接添加到培养基中，避免将混合物添加到培养基的侧面。

2. 在不同时间点收获转染细胞进行荧光分析

1. 将转染的细胞在37°C孵育7小时。
   注意:为了验证两种miRNA（EV-miRNA和cell-miRNA）的一致转染，在转染后3小时从一个孔中收集细胞，以使用流式细胞仪分析荧光。
2. 孵育期7小时后，从孔中除去转染复合物并用完全培养基代替。
3. 为了评估 7 小时时间点，收获细胞并用 1x PBS 洗涤细胞 3 次。
   1. 如果使用贴壁细胞，则向一个孔中加入 200 μL 胰蛋白酶并等待细胞从板上分离。将分离的细胞转移到微量离心管中，并通过以200xg离心5分钟的方式沉淀。
   2. 小心丢弃上清液，以免破坏细胞沉淀。对于第一次PBS洗涤，将沉淀重悬于~500μL的1x PBS中，并使用上述离心步骤重复沉淀。重复PBS洗涤两次。
   3. 将细胞沉淀重悬于200μL 2%多聚甲醛（PFA）溶液中并评估荧光。
      注意:加入2%PFA后，细胞沉淀可在4°C下储存3-4天。
4. 按照第 2.3 节中的步骤收获剩余的时间点。收集所有储存的细胞沉淀并继续执行第 3 节中的步骤。

3. 细胞内细胞-miRNA和EV-miRNA信号的流式细胞术分析

1. 准备用于流式细胞术分析的细胞。过滤第 2 节至 35 μm 过滤器盖的细胞悬液，这些过滤器帽是圆底聚苯乙烯 FACS 管的一部分，以去除可能干扰荧光团分析的碎屑和细胞聚集体。
2. 按照校准说明设置仪器。打开流式细胞仪，使其在使用前预热至少 30 分钟。用鞘液灌注流体系统，并检查和调整激光对准。
3. 运行质量控制以确认仪器流体。将超纯过滤水加载到流式细胞仪中，并以适当的流速运行，以获得足够的采集时间。
   注:适当的流速和采集时间将取决于感兴趣的细胞类型、样品复杂性和所需的数据质量。
4. 打开流式细胞术数据分析软件，确认检测器和激光器的性能。根据目标细胞系和选择的荧光团设置检测阈值和电压参数。
   注意:对于所有下游实验，使用Calu6细胞。
   1. 在 FSC 5000 处设置捕获 Calu6 细胞信号的阈值。对每个实验重复的 1 x 10⁴ 个细胞进行分析。
   2. 为了解释不同荧光团之间的光谱重叠，使用未转染的细胞和仅用其中一个荧光团独立转染的细胞来设置补偿对照。
   3. 为了检测 miRNA 输出，使用与 Alexa-fluor 488 偶联的候选 EV-miRNA（miR-451a 和 miR-150）以及与 Cy3 偶联的对照细胞 miRNA（cel-miR-67）。
   4. 对于每个 EV-miRNA，将荧光团偶联到 5p 链的 5' 末端。转染前，将荧光团偶联链退火至其 100% 互补 3p 链。
   5. 对于转染细胞中的表达分析，使用分别设置为 258、192、269 和 423 电压单位的 FSC、SSC、FITC 和 PE 通道分析样品（图 1A、B）。
5. 将阴性对照样品引入流式细胞仪。在自定义工作表中定义前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 强度后捕获单元信号。
6. 在图中，通过在图周围绘制多边形，为 X 轴选择 FSC，为 Y 轴选择 SSC，为感兴趣的总体选择门（参见 图 1B，底板）。
7. 使用门控人口创建新图。
   1. 将 X 轴设置为荧光信号 1 （FS1） 用于细胞 miRNA 检测，将 Y 轴设置为荧光信号 2 （FS2） 用于 EV-miRNA 检测。使用独立转染每个荧光标记的miRNA的细胞为单个荧光团设置补偿参数。在新地块中，对感兴趣的人口进行门控。
   2. 要检测 EV-miRNA，请使用 FITC 通道。对于细胞-miRNA信号的评估，请使用PE通道。在软件中，当 X 轴选择 FITC 并为 Y 轴选择 PE 时，通过在双荧光群体周围绘制多边形，在 FITC 和 PE 均呈阳性的细胞周围创建一个门。
8. 记录门控人口的统计数据。
   1. 记录门控群体中 FITC 和 PE 均呈阳性的细胞以及 FITC 或 PE 呈阳性的细胞百分比。
9. 对实验中的任何其他样品或对照重复上述步骤。

4. 从转染细胞中分离 EV

1. 对于在含血清培养基中培养的细胞，从血清中耗尽 EV 以防止交叉污染。
   1. 为了产生耗尽EV的血清，在细胞培养基中将血清稀释至50%以降低粘度，并将所得的50%血清以110,000× g 离心18小时。
   2. 仔细收集上清液（不含EV的血清），并使用0.2μm过滤器组件进行过滤。使用所得的 50% 无 EV 血清生成完整的培养基，在本例中为 RPMI 加 10% 血清。
   3. 要收集 EV，将 EV 耗尽的完全培养基添加到细胞中，并在孵育 48 小时后收集 EV。
      注意:下面概述的协议已从 Kowal 等人 ¹⁴ 修改而来。
2. 在15cm组织培养皿中培养细胞至80%汇合度。按照方案第 1 节中的转染方案，在 10 mL Opti-MEM 中分别用 cell-miRNA 和 EV-miRNA 转染细胞。
   注意:并非所有转染方案都线性放大。首先调整和评估 15 cm 平板中的转染条件可能至关重要。
3. 7小时后，吸出转染培养基并用EV耗尽培养基（15mL）替换。在EV耗尽的培养基中培养细胞48小时。
4. 从细胞中取出条件培养基，并将其分配到生物安全柜内的 50 mL 离心管中。在4°C下以2000× g 离心条件培养基10分钟，以除去死细胞和细胞碎片。将所得上清液转移到新管中。
5. 将上清液在4°C下以10,000× g 离心40分钟。 除去上清液并使用0.2μm过滤器组件进行过滤。
6. 将过滤的细胞培养基转移到生物安全柜内的无菌超速离心管中。称重并平衡试管。将样品在4°C下以110,000× g 旋转90分钟。 弃去上清液。
7. 将沉淀重悬于适当体积的1x PBS中，以110,000× g 洗涤并离心90分钟4°C。
   注意:根据本研究中使用的固定角转子管允许的最大体积，将 EV 沉淀重悬于 60 mL 1x PBS 中。
8. 吸出PBS并将EV沉淀悬浮在适当体积（50-100μL）的新鲜1x PBS和涡旋中。将 EV 储存在 -80 °C 以备后用。

5. EVs中细胞miRNA和EV-miRNA信号的流式细胞术分析

1. 为了制备用于流式细胞术分析的EV悬浮液，在适当体积的超滤1x PBS中稀释EV。
   注意:EV流式细胞术分析的上样体积应根据样品中的EV数量确定。粗略地说，如果 EV 悬浮液中有 ~30,000 个颗粒，则 1x PBS 中的最终体积应为 ~500-600 μL。一个干净的样品大约有 35-50 个颗粒/μL。
2. 使用纳米流式细胞仪或功能强大到足以分析纳米级颗粒的替代设备。
   注:此处使用的是Attune NxT纳米流式细胞仪。
3. 打开软件并按照推荐的校准说明设置仪器。使用高性能纳米珠进行 性能测试 。如果在标准尺寸范围内检测到纳米微珠，则性能最佳。确定检测 EV 颗粒的适当流速。
4. 使用超纯过滤水进行质量控制，以确认仪器的流体以及探测器和激光器的性能。
5. 使用适合实验的校准微球，设置流式细胞仪准确检测不同大小的微珠并测量荧光信号。
   注意:对于通过流式细胞术设置 EV 分析，使用了 ApogeeMix 微珠。这些微珠包含非荧光二氧化硅微珠和荧光聚苯乙烯微珠的混合物，尺寸范围为 80 nm 至 1300 nm。
   1. 根据制造商的方案设置参数以评估微球混合物中不同群体的灵敏度和分辨率。使用适当的门控来解析仪器噪声中的磁珠填充。
6. 在加载进行分析之前，彻底涡旋样品以均匀分布 EV。
7. 打开流式细胞术数据分析软件，引入超滤PBS。使用超滤 PBS 设置 EV 颗粒的门控，同时确保门控对应于基于步骤 5.5 中的磁珠的适当颗粒尺寸。
8. 加载阴性对照样品以分析通过流式细胞仪的 EV。捕获 EV 信号，同时在 X 轴上绘制 FSC，在 Y 轴上绘制 SSC。
   注意:捕获电动汽车的 SSC 阈值设定为 300。采集体积从总共 145 μL 的拉伸体积设置为 95 μL。流速设定为12.5 μL/min。使用 1 x 10⁶ EV 颗粒进行分析。电动汽车种群是异质的，将导致一些碎片与电动汽车一起隔离。FSC 与 SSC 图中的整体颗粒检测突出显示了不同范围内的颗粒，这在使用粗 EV 制剂时是预期的。
9. 使用门控人口创建新图。
   1. 这一次，在X轴上选择荧光信号1（FS1）进行细胞miRNA检测，在Y轴上选择荧光信号2（FS2）进行EV-miRNA检测。
   2. 使用从用单个 miRNA 转染的细胞中分离的 EV 样品为荧光团设置补偿参数。在新图中，对感兴趣的电动汽车人群进行门禁。
   3. 对于从转染细胞中分离的 EV 中荧光团偶联的 miRNA 的表达分析，使用分别设置为 370、370、400 和 400 电压单位的 FSC、SSC、BL1 和 YL1 通道分析 EV 样品（图 2A、B）。
   4. 记录门控总体的统计数据，并使用直方图和点图对其进行可视化。
10. 对实验中的任何其他样品或对照重复上述步骤。

6. 通过qRT-PCR验证EV中miRNA的释放

1. 按照制造商的说明，使用 miRVana RNA 分离试剂盒从 EV 和亲本细胞中提取 RNA。
   注意:无法定量从 EV 中分离的 RNA，因为从 EV 中分离的 RNA 总量通常不会超过标准纳米滴的最小数量阈值。这是由于 EV 样品中核糖体 RNA 的耗尽，这可以使用安捷伦生物分析仪进行验证。因此，EV-RNA定量的完整性评分通常不可靠，不能真实地表示EV-RNA数量。因此，对于EV-RNA和细胞RNA的qRT-PCR定量，使用从相同数量的细胞中分离出等体积的RNA分离物。对于qRT-PCR的标准化，使用根据先前获得的RNA测序数据确定的在多个样品中普遍存在的miRNA。
2. 使用对小RNA具有特异性的逆转录酶试剂盒将提取的RNA转化为cDNA。
3. 按照制造商的说明，使用 cDNA 模板和 miRNA 特异性引物设置 qRT-PCR 反应。
   注意:对于验证实验，使用制造商的miRCURY LNA qRT PCR试剂盒和相应的引物来评估细胞-miRNA和EV-miRNA的表达。

结果

在这里，我们利用流式细胞术作为研究 miRNA 从细胞释放到 EV 中的强大工具。使用该方案，对转染细胞-miRNA和EV-miRNA的细胞进行流式细胞术分析显示，对应于EV-miRNA的荧光信号连续减少，而对应于细胞-miRNA的信号保留在细胞中。为确保荧光基团偶联不会干扰 miRNA 释放到 EV 中，将 miR-451a 偶联到两个单独的荧光基团（即 Alexa fluor 488 和 Alexa fluor 750）上，并评估细胞保留率。结果表明，转染后检测单独的荧光基团信号之间的变异性很小，验证了该方法的可靠性（图3A，B）。

由于各种原因可以解释细胞中荧光标记的miR-451a的损失，包括RNA降解，因此验证细胞损失与EV丰度相吻合至关重要。使用流式细胞术，以时间依赖性方式观察到与 Alexa fluor-488 偶联的 miR-451a 在 EV 中的积累，为有效包装和最终将 miRNA 释放到 EV 中提供了证据。相反，对应于细胞保留的miRNA的荧光信号，在EV中未检测到...

讨论

新建立的方案能够在转染 EV-miRNA 后捕获 miRNA 释放到 EV 中的动力学。该方法允许同时分析多个 EV-miRNA 和细胞 miRNA，具体取决于细胞仪的功能。此外，虽然流式细胞术分析可以为EV miRNA生物学提供有价值的见解，但它并非没有局限性。尽管与其他技术结合使用时可以克服一些限制，以获得更全面的理解。

EV 生物学的一个新兴兴趣领域是理解 miRNA 选择性输出到 EV^{中 15,16}。虽然该协议提供了一个强大的工具来研究miRNA的选择性输出，但关键挑战之一是区分主动和被动输出。必须谨慎行事，因为在足够高的浓度下过表达 miRNA 可能会改变 miRNA 的输出，可能导致不适当的被动加载。因此，在研究选择性输出时，确定miRNA最佳转染浓度的实验至关重要。

此外，当该协议与纳米颗粒跟踪分析（NTA）等互补技术相结合时，研究人员能够评估EV颗粒计数，同时评估miRNA释放，并有可能区分E...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon 管	康宁	352097
6 孔透明平底表面处理过的组织培养板	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL，（PS80/110/500 和Si180/240/300/590/880/1300 nm）	Apogee Flow Systems	1527	设置颗粒检测的门控和参数
Attune Nxt 流式细胞仪	ThermoFisher Scientific	N/A	用于 EV 中的荧光分析
BD Fortessa 细胞分析仪	BD Biosciences	N/A	用于细胞中的荧光分析
细胞培养箱	N/A	N/A	保持温度为 37 >C 和 5% CO<>2
细胞培养基	N/A	N/A	对目标细胞系具有特异性
细胞系	N/A	N/	A 测试和评估目标 miRNA 的 EV 和细胞丰度的任何细胞系。
细胞-miRNA（miRIDIAN microRNA 模拟红转染对照）	地平线发现	CP-004500-01-05	预定被目标细胞系保留且未选择性输出到 EV 中的 miRNA（
荧光团偶联的 miRNA）	整合 DNA 技术 （IDT）		预定的 miRNA 选择性分选到 EV 中
荧光显微镜	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM 减血清培养基	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific 血球计数器	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS（用于细胞培养）	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA 逆转录酶	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR 绿色 PCR	Qiagen
mirVana RNA 分离	Qiagen	AM1561
无核酸酶	水 Fisher Scientific	4387936
多聚甲醛，4% PBS	Fisher	AAJ61899AK
试剂储液槽 未灭菌	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX 实时荧光定量 PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
胰蛋白酶 0.25%	Fisher
超速离心机	N/A	N/A