勘误：利用幼苗淹没法高通量筛选番茄中对番茄丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）抗性的研究

摘要

已发布更正：  利用幼苗淹没法高通量鉴定番茄对番茄丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. Tomato）的抗性。引言、实验方案、代表性结果与讨论 部分已 更新。

摘要

已发布更正：针对利用幼苗淹没法高通量鉴定番茄对Pseudomonas syringae pv. tomato抗性的研究。引言、实验方案、代表性结果与讨论部分已更新。

引言部分的最后一段已从以下内容更新：

在本实验方案所述的幼苗淹水试验中，将番茄幼苗在无菌的Murashige和Skoog（MS）培养基平板上培养10天，随后用含有目标细菌及表面活性剂的接种液进行淹水处理。淹水处理后，可通过细菌增殖测定对幼苗的抗病性进行定量评估。此外，在淹水处理7至14天后，幼苗的存活或死亡可作为明确的抗性或感病表型指标。该方法为大规模筛选野生番茄种质资源对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pst）小种1菌株（如Pst菌株T1（PstT1））的抗性提供了一种高通量的替代方案，并可轻松适用于其他感兴趣的细菌菌株。

至：

在本实验方案所述的幼苗淹水试验中，将番茄幼苗在无菌的Murashige和Skoog（MS）培养基平板上培养10天，随后用含有目标细菌及表面活性剂的接种液进行淹水处理。淹水处理后，可通过细菌增殖测定对幼苗的抗病性进行定量评估。此外，在淹水处理后7–14天，幼苗的存活或死亡可作为明确的抗性或感病表型指标。该方法为大规模筛选野生番茄种质资源对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pst）小种1菌株（如Pst菌株19（Pst19））的抗性提供了一种高通量的替代方案，并可轻松适用于其他感兴趣的细菌菌株。

方案部分的第4.8步已从以下内容更新：

8. 孵育1小时后，将瓶子转移至生物安全柜中，在无菌条件下向培养基中加入1,600 µL无菌的1 M MgSO₄，并加入适当的抗生素。
   注意：对于利福平抗性菌株PstDC3000和PstT1，使用二甲基甲酰胺溶解的利福平，终浓度为50 µg/mL。为防止平板上真菌生长，使用乙醇溶解的放线菌酮，终浓度为50 µg/mL。

至：

8. 孵育1小时后，将瓶子转移至生物安全柜中，在无菌条件下向培养基中加入1,600 µL无菌的1 M MgSO₄，以及适当的抗生素。
   注意：对于利福平抗性菌株PstDC3000和Pst19，使用二甲基甲酰胺溶解的利福平，终浓度为50 µg/mL。为防止真菌在平板上生长，使用乙醇溶解的放线菌酮，终浓度为50 µg/mL。

方案部分的第 5.2 步已从以下内容更新：

2. 从甘油菌种中划线接种细菌（例如 PstT1）至含有适当抗生素的KB琼脂平板上（见第4部分）。

至：

2. 从甘油菌种中划线接种细菌（例如，Pst19）至含有适当抗生素的KB琼脂平板上（见第4节）。

方案部分的第 5.6 步已从：

6. 对于 PstT1，将KB平板在28 ˚C下孵育48小时，之后用于喷雾实验中的细菌。

至：

6. 对于 Pst19，将KB平板在28 °C培养48小时，然后用于喷雾接种实验。

方案部分的第6步已从：

6. 准备PstT1 接种物

至

6. 准备Pst19 接种物

方案部分的第 6.2 步已从以下内容更新：

2. 在生物安全柜中使用无菌的 10 mM MgCl₂ 溶液进行系列稀释。对于 PstT1，使用分光光度计制备起始浓度为 OD₆₀₀ = 0.1 的接种液。

至：

2. 在生物安全柜中使用无菌的 10 mM MgCl₂ 溶液进行系列稀释。对于 Pst19，使用分光光度计制备起始浓度为 OD₆₀₀ = 0.1 的接种液。

方案部分的第 6.3 步已从以下内容更新：

3. 对于 PstT1，将初始重悬液从 OD₆₀₀ = 0.1 进行 1/10 稀释，以获得浓度为 OD₆₀₀ = 0.01 的系列稀释液。

至：

3. 对于Pst19，将初始重悬液从OD₆₀₀ = 0.1稀释1/10，得到浓度为OD₆₀₀ = 0.01的系列稀释液。

方案部分的第 8.3 步已从以下内容更新：

3. 设置计时器为 3 分钟。量取 6 mL 的最终接种液（PstT1 OD₆₀₀ = 0.0075 [第 6 节] 或 PstDC3000 OD₆₀₀ = 0.005 [第 7 节]），并将 6 mL 接种液分别转移至含有 10 天龄幼苗的每个培养皿中。

至：

3. 设置计时器为 3 分钟。量取 6 mL 的最终接种液（Pst19 OD₆₀₀ = 0.0075 [第 6 节] 或 PstDC3000 OD₆₀₀ = 0.005 [第 7 节]），并将 6 mL 接种液分别转移至含有 10 天龄幼苗的每个培养皿中。

方案部分的第 8.11 步已从以下内容更新：

11. 接种PstDC3000后7–10天或接种PstT1后10–14天进行表型观察（第11节）。若进行细菌增殖测定，于接种后4天采集叶片组织（第9和第10节），随后进行表型分析（第11节）。或者，可分别使用不同的植株组进行表型分析和细菌增殖测定。

至：

11. 接种PstDC3000后7–10天或接种Pst19后10–14天进行表型观察（第11节）。若进行细菌增殖测定，于接种后4天采集叶片组织（第9和第10节），随后进行表型分析（第11节）。或者，可分别使用不同的植株组进行表型分析和细菌增殖测定。

方案部分的第 10.7 步已从以下内容更新：

7. 获得菌落数量（图2B）后，将菌落数归一化至0.01 g组织（针对幼苗），并转换为细菌生长对数值（表1）。
   注：Moneymaker-PtoS 子叶的平均质量为0.01 g，该数值通过实验测定²²。

基因型1 列 A	组织重量 (g) 列 B	点样中菌落数量 列 C	点样的稀释倍数2 列 D	校正后菌落数量3 列 E	系列稀释的稀释倍数 列 F	总菌落数量 列 G (cfu/0.01 g)4	平均菌落数量 (cfu/0.01 g) 列 H	平均对数生长量 (cfu/0.01 g (log10)) 列 I
样本 1	0.004 g	10	200	计算方法：(C2 × 0.01 g) / B2 = 25	1000	计算方法：(D2 × E2 × F2) = 5000000	样本 1 至最后一个样本的平均值：(例如，G1:G3 的平均值) = 7000000	平均值的对数，即 log(H2) = 6.85
样本 2	0.003 g	15	200	50	1000	10000000
样本 3	0.002 g	6	200	30	1000	6000000
1数据显示为 3 个样本
2基于点样 5 µL × 200 得到 1 mL
3子叶过小无法取芯，因此菌落计数根据一个 MoneyMaker-PtoS 子叶的平均质量归一化至 0.01 g 组织（数据未显示）
4根据点样体积调整为每毫升

表1：幼苗细菌生长实验的示例计算。 示例计算展示了如何对细菌计数进行归一化处理，并确定细菌生长的对数值。

至：

7. 获得菌落数量后（图2B），将菌落计数标准化为每0.1 g组织（适用于幼苗），并转换为对数细菌生长量（表1）。
   注：Moneymaker-PtoS 子叶的平均质量为0.1 g，该数值为经验测定²²。

基因型1 列 A	组织重量 (g) 列 B	点样中菌落数量 列 C	点样的稀释倍数2 列 D	校正后菌落数量3 列 E	系列稀释的稀释倍数 列 F	总菌落数量 列 G (cfu/0.01 g)4	平均菌落数量 (cfu/0.01 g) 列 H	平均对数生长量 (cfu/0.1 g (log10)) 列 I
样本 1	0.04 g	10	200	计算公式为：(C2 × 0.1 g) / B2 = 25	1000	计算公式为：(D2 × E2 × F2) = 5000000	样本 1 至最后一个样本的平均值：(例如，G1:G3 的平均值) = 7000000	平均值的对数，即 log(H2) = 6.85
样本 2	0.03 g	15	200	50	1000	10000000
样本 3	0.02 g	6	200	30	1000	6000000
1数据显示为 3 个样本
2基于点样 5 µL × 200 次得到 1 mL
3子叶过小无法取芯，因此菌落计数根据一个 MoneyMaker-PtoS 子叶的平均质量归一化至 0.1 g 组织（数据未显示）
4根据点样体积调整为每毫升的数值

表1：幼苗细菌生长测定的示例计算。 示例计算展示了如何对细菌计数进行归一化处理，并确定细菌生长的对数值。

将方案部分的第 11.3 步更新为：

3. 在淹水接种后10–14天观察感染 PstT1 的植株表型。

至：

3. 在淹灌接种后10–14天观察感染Pst19的植株表型。

《方案》部分的图4已从以下内容更新：

图 4：不同遗传背景下幼苗抗性与死亡表型的示意图。（A）Rio Grande-PtoR 与近等基因系品种 Rio Grande-PtoS 的幼苗在用 PstDC3000（OD₆₀₀ = 0.005）+ 0.015% 表面活性剂浸润处理后第 7 天的表型如图所示。Rio Grande-PtoR 表现出稳定的抗性，而 Rio Grande-PtoS 表现出稳定的感病性，对 PstDC3000 感染具有明显且二元的表型差异。（B）野生材料（如 Solanum neorickii LA1329）的幼苗在用 PstT1（OD₆₀₀ = 0.0075）+ 0.015% 表面活性剂浸润处理后第 10 天的表型如图所示。这些幼苗表现出一定的表型变异，但仍被记录为二元表型。表型变异的程度以及表型记录方式（二元抗性或抗性谱）取决于所测试的具体材料。（C）通过将野生材料与感病品种杂交产生的定位群体，在 F2 分离群体中可能表现出更广泛的表型谱。在此情况下，将幼苗表型记录为连续谱可能更为合适。在用 PstT1 处理后，定位群体中的高度感病幼苗最早在第 7 天即可表现出死亡表型，典型特征为顶端分生组织呈褐色、上胚轴几乎无伸长、无新的绿色营养生长。感病幼苗的顶端分生组织可能在较长时间内保持绿色或浅褐色，上胚轴可能有轻微伸长，营养生长极少，并在第 10 天左右转褐并停止生长。可根据第 14 天时新产生的及持续进行的营养生长量，对单株幼苗进行抗性表型鉴定。随后可根据上述描述的表型将幼苗划分为不同的抗性等级，例如弱抗性、中等抗性或强抗性。请点击此处查看该图的放大版本。

至：

图4：不同遗传背景下幼苗抗性与死亡预期表型的示意图 (A) 里约格兰德幼苗PtoR 及其近等基因系品种 Rio Grande-PtoS 在淹水后7天显示 PstDC3000（OD₆₀₀ = 0.005）+ 0.015% 表面活性剂。Rio Grande-PtoR 表现出一致的抗性，以及Rio Grande-PtoS 对感染表现出一致的易感性 PstDC3000。这些品系产生明显且为二元的表型。B) 野生生态型的幼苗，例如 Solanum neorickii LA1329 在淹水后10天的表现如图所示 Pst19 (OD₆₀₀ = 0.0075) + 0.015% 表面活性剂。幼苗表现出表型变异，但记录为二元表型。表型变异的程度及表型鉴定方法（二元抗性或抗性谱）将取决于所测试的具体生态型。C通过将野生种系与感病栽培品种杂交产生的作图群体，其F2分离群体可能表现出更广泛的表型谱。在此情况下，最适宜采用连续谱系的方式记录幼苗表型。当淹水处理时，作图群体中的高度感病幼苗可能早在第7天即可观察到死亡表型。 Pst19天时，通常表现出褐色的顶端分生组织，上胚轴无伸长或伸长极少，且无新的绿色营养生长。感病幼苗的顶端分生组织可能保持绿色或极浅的褐色更长时间，上胚轴可能有一定伸长，并出现极少的营养生长，但至第10天时转为褐色并停止生长。可根据第14天时新产生的及持续进行的营养生长量对单株幼苗进行抗性表型鉴定。随后可根据上述表型将幼苗归类为不同等级的抗性，如弱抗性、中等抗性或强抗性。 请点击此处以查看此图的放大版本。

代表性结果部分的第二段已从以下内容更新：

利用幼苗抗性测定对野生种质进行表型筛选
图6展示了在用PstT1接种并淹水处理后10–14天，感病和抗病种质幼苗的代表性结果。感病种质包括RG-PtoR、S. pimpinellifolium LA1375和S. pimpinellifolium LA1606；抗病种质包括S. neorickii LA1329。10日龄幼苗分别用含10 mM MgCl₂和0.015%表面活性剂的溶液进行淹水处理作为阴性对照，另一组则用光密度为0.0075的PstT1菌液加0.015%表面活性剂处理。幼苗在淹水处理至少10天后进行表型观察，因为感染PstT1的幼苗死亡速度比感染PstDC3000的幼苗更慢。模拟接种的幼苗保持绿色、健康，并持续生长。该对照至关重要，可用于确认种质对表面活性剂浓度不敏感，并排除细菌污染的可能性。感病种质（Rio Grande-PtoR [n = 7]、S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7] 和 S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]）在接种PstT1后10–14天全部死亡，顶端分生组织呈褐色，且无新组织生长。相比之下，两个S. neorickii LA1329（n = 3）个体表现出大量新生绿色组织，并成功抵抗了PstT1感染（图6）。另有三株LA1329幼苗未萌发。通常，在初筛中每种种质检测5–7个个体，以评估群体中抗性表型的普遍程度。当对LA1329等遗传背景更复杂的野生种质进行PstT1淹水处理时，个体幼苗间的抗性表型变异程度略高于用PstDC3000处理的Moneymaker-PtoR材料。然而，其表型变异通常仍低于F2作图群体中的变异水平。因此，对LA1329采用二元表型判定标准。

至：

利用幼苗抗性测定法对野生种质资源进行表型筛选
图6展示了感病和抗病种质资源幼苗在接种Pst19后10–14天的代表性结果。感病种质资源包括RG-PtoR、S. pimpinellifolium LA1375和S. pimpinellifolium LA1606，抗病种质资源包括S. neorickii LA1329。10日龄幼苗分别用含10 mM MgCl₂和0.015%表面活性剂的溶液作为阴性对照，以及含光密度为0.0075的Pst19菌液和0.015%表面活性剂进行淹水处理。接种后至少10天进行表型观察，因为Pst19感染的幼苗死亡速度比PstDC3000感染的幼苗更慢。模拟接种的幼苗呈现绿色、健康且持续生长。该对照至关重要，用于确保种质资源对表面活性剂浓度不敏感，并排除细菌污染的可能性。感病种质资源（Rio Grande-PtoR [n = 7]、S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7] 和 S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]）在接种Pst19后10–14天全部死亡，顶端分生组织呈褐色，且无新组织生长。相比之下，两个S. neorickii LA1329（n = 3）幼苗表现出大量新生绿色组织，并成功抵抗了Pst19感染（图6）。另有三株LA1329幼苗未能萌发。通常，在初筛中每种质资源检测5–7个个体，以确定群体中抗性性状的普遍程度。当对遗传背景较复杂的野生种质资源（如LA1329）接种Pst19时，其个体幼苗间的抗性表型变异略大于经PstDC3000处理的Moneymaker-PtoR植株。然而，其表型变异通常仍小于F2作图群体中的变异程度。因此，对LA1329采用二元表型分类标准。

代表结果部分的图6已从以下内容更新：

图6：野生种质材料在接种后10–14天的抗性或病害表型特征分析。 Rio Grande-PtoR、S. pimpinellifolium LA1606、S. pimpinellifolium LA1375 和 S. neorickii LA1329 番茄幼苗在 0.5x MS 培养基平板上生长10天后，用 PstT1（OD₆₀₀ = 0.0075）加0.015% 表面活性剂进行淹灌处理。图中显示了每种野生种质材料在测试总数中存活的幼苗数量。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的高清版本。

至：

图6：野生种质材料接种后10–14天的抗性或发病表型特征分析。 Rio Grande-PtoR、S. pimpinellifolium LA1606、S. pimpinellifolium LA1375 和 S. neorickii LA1329 番茄幼苗在0.5x MS培养基上生长10天后，用Pst19（OD₆₀₀ = 0.0075）+ 0.015% 表面活性剂溶液浸润处理。图中显示各野生种质材料在测试总数中存活幼苗的数量。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的高清版本。

代表性结果部分的第三段已从：

利用幼苗浸水法对细菌生长进行定量评估
为证实 LA1329 对 PstT1 所表现出的抗性导致了更低的细菌增殖水平，在番茄幼苗中进行了细菌生长测定实验。接种后第 4 天测定 PstT1 在 Moneymaker-PtoS 和 S. neorickii LA1329 中的生长水平。Moneymaker-PtoS 是一个近等基因系，其个体幼苗间具有稳定的感病性。而野生种质资源如 S. neorickii LA1329 通常具有更复杂的遗传背景。LA1329 在群体中表现出约 60% 的对 PstT1 的抗性²²。由于幼苗在接种后可能脱落子叶，因此每块培养板仅种植一株幼苗，以便将收获的子叶中细菌生长量与至少接种后 10 天时通过表型观察确定的幼苗整体存活或死亡情况进行关联分析。每株幼苗在第 4 天的细菌计数被标准化至 0.01 g 组织，并转换为对数生长值（CFU/0.01 g（log₁₀））。表型抗性 LA1329 幼苗（LA1329^RES）和表型感病幼苗（LA1329^SUS）的对数生长值分别归类汇总，并相互之间以及与感病品种 Moneymaker-PtoS 进行比较。例如，LA1329^RES（对数 6.3）与 LA1329^SUS（对数 8.0）之间的细菌生长差异为 1.7 个对数单位，LA1329^RES（对数 6.3）与 Moneymaker-PtoS（对数 7.9）之间的差异为 1.6 个对数单位（图 7）。因此，表型抗性与幼苗测定中的定量抗性呈正相关。

至：

利用幼苗浸水法对细菌生长进行定量评估
为了验证LA1329对Pst19表现出的抗性是否导致细菌生长减少，在番茄幼苗中进行了细菌生长测定实验。在接种后第4天测定Pst19在Moneymaker-PtoS和S. neorickii LA1329中的生长水平。Moneymaker-PtoS是一个近等基因系，其各个幼苗之间具有稳定的感病性。而野生种质资源如S. neorickii LA1329通常具有更复杂的遗传背景。LA1329在整个群体中对Pst19表现出约60%的抗性²²。由于幼苗在接种后可能会脱落子叶，因此每块培养皿中仅种植一株幼苗，以便将收获的子叶中的细菌生长量与幼苗整体的存活或死亡表型（在浸水处理至少10天后确定）相对应。每株幼苗在第4天的细菌计数被标准化为每0.01 g组织，并转换为对数生长值（CFU/0.01 g（log₁₀））。表型抗性LA1329幼苗（LA1329^RES）和表型感病幼苗（LA1329^SUS）的对数生长值分别归类汇总，并相互比较，同时与感病品种Moneymaker-PtoS进行比较。例如，LA1329^RES（对数值6.3）与LA1329^SUS（对数值8.0）之间的细菌生长差异为1.7个对数单位，而LA1329^RES（对数值6.3）与Moneymaker-PtoS（对数值7.9）之间的差异为1.6个对数单位（图7）。因此，幼苗实验中的表型抗性与定量抗性呈正相关。

代表结果部分的图7已从以下内容更新：

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图7：抗性Solanum neorickii LA1329幼苗中的细菌生长水平低于Moneymaker-PtoS或感病型S. neorickii LA1329。 接种PstT1后第4天测定S. neorickii LA1329（n = 14）和Moneymaker-PtoS（n = 10）幼苗的细菌数量，并以每0.01克组织为单位进行归一化处理。对于LA1329，分别观察并计数了两个表型组：感病型（SUS）和抗性型（RES）。柱状图上方的星号*表示通过单因素方差分析确定的统计学显著差异。采用一般线性模型程序（p < 0.001），随后使用Tukey事后检验进行均值多重比较。误差线表示标准误。该图展示了一次代表性实验的结果。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 7：抗性 Solanum neorickii LA1329 幼苗中的细菌生长水平低于 Moneymaker-PtoS 或感病型 S. neorickii LA1329。 接种 Pst19 后第 4 天测定 S. neorickii LA1329（n = 14）和 Moneymaker-PtoS（n = 10）幼苗的细菌数量，并以每 0.1 g 组织为单位进行归一化处理。对于 LA1329，观察到两种表型群体——感病型（SUS）和抗性型（RES），并分别计数。柱状图上方的星号 * 表示通过单因素方差分析确定的统计学显著差异。采用广义线性模型程序（p < 0.001），随后使用 Tukey 事后检验进行均值多重比较。误差线表示标准误。该图展示了一次代表性实验的结果。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论部分的第一段已从以下内容更新：

一种用于淹水接种的方案 PstDC3000 或 Pst描述了一种经优化用于检测番茄幼苗对这些细菌菌株抗性的T1方法。幼苗抗性测定中获得最佳结果需控制多个关键参数，包括细菌浓度和表面活性剂浓度，这些参数均通过实验确定。²²。对于 PstDC3000，通过优化光密度以实现在含有抗性基因的抗性品种上的完全存活 Pto/Prf 在缺乏该基因的感病品种上形成菌落并导致完全死亡 Pto/Prf 簇²²对于像这样的菌株 PstT1时期，由于尚无已知的抗性品种，将光密度优化至尽可能低，以确保植株一致且完全死亡²². Uppalapati 等²⁴ 设计了一种番茄幼苗测定法以研究其致病机制 PstDC3000 及冠毒素的毒力功能。在此毒力测定实验中，感染所用细菌浓缩至 OD₆₀₀ 0.1的²⁴，是我们耐药性检测所用菌株光密度的20倍。对 Pst番茄幼苗中携带的DC3000效应子AvrPto和AvrPtoB Pto/Prf 基因簇导致ETI和宏观的HR²²在强免疫反应（如ETI）的背景下，使用了较低的细菌滴度 PstDC3000，以避免压倒植物的遗传抗性 Pto/Prf 基因簇²²此外，这些结果表明，高浓度的细菌可能压倒较弱的免疫反应，例如PTI或由多个基因共同决定整体表型的定量部分抗性。表面活性剂对于细菌黏附于叶片表面是必需的；然而，过高浓度会导致叶片出现氯害。²²我们先前测试了一系列表面活性剂浓度，以通过实验确定10日龄番茄幼苗中的最佳浓度²²在测试对表面活性剂敏感性可能存在差异的新物种时，应优化表面活性剂浓度，以确定在无细菌条件下不会引起损伤或黄化的浓度。合适的测定条件需要优化表面活性剂浓度以避免造成损伤，同时优化细菌浓度，使其能在所有易感对照组中引发病害。

至：

一种用于淹水接种的方案 PstDC3000 或 Pst19 种用于检测番茄幼苗对这些细菌菌株抗性的优化方法被描述。幼苗抗性测定中获得最佳结果的关键参数包括细菌浓度和表面活性剂浓度，这些参数是通过实验确定的。²²。对于 PstDC3000，通过优化光密度以实现在含有抗性基因的抗性品种上的完全存活 Pto/Prf 在缺乏该基因的感病品种上形成簇状并完全致死 Pto/Prf 簇²²对于像这样的菌株 Pst19，在尚无已知抗性品种的情况下，将光密度优化至尽可能低，以确保植株一致且完全死亡²². Uppalapati 等²⁴ 设计了一种番茄幼苗测定法以研究其致病机制 PstDC3000 及其毒力功能中的冠菌素。在此毒力测定实验中，感染过程使用浓度调整至 OD 的细菌进行₆₀₀ 0.1 的²⁴，是我们耐药性检测所用菌株光密度的20倍。对 Pst番茄幼苗中携带的DC3000效应子AvrPto和AvrPtoB Pto/Prf 基因簇导致ETI和宏观的HR²²在强免疫反应（如ETI）背景下，使用了较低的细菌滴度 PstDC3000，以避免对遗传抗性产生过强的选择压力 Pto/Prf 基因簇²²此外，这些结果表明，高浓度的细菌可能压倒较弱的免疫反应，例如PTI或由多个基因共同决定整体表型的定量性部分抗性。表面活性剂对于细菌黏附于叶片表面是必需的；然而，过高浓度会导致叶片出现氯化现象。²²我们先前测试了一系列表面活性剂浓度，以通过实验确定10日龄番茄幼苗中的最佳浓度²²在测试对表面活性剂敏感性可能存在差异的新物种时，应优化表面活性剂浓度，以确定在无细菌情况下不会引起损伤或失绿的浓度。合适的测定条件需要优化表面活性剂浓度（不引起损伤）和细菌浓度（在所有感病对照中均引发病害）。

讨论部分的第三段已从：

Pst 是一种叶部病原菌，优先定植于番茄幼苗的地上部分，包括子叶²⁴（图3）。因此，幼苗浸水接种实验中的定性表型分析主要关注幼苗地上部分的生长状况和病害症状，而用于细菌生长测定的组织样本则取自子叶，以进行定量分析。在浸水接种后，幼苗可能在接种 PstDC3000 后 7–10 天内或接种 PstT1 后 10–14 天内死亡，具体如第 11 节所述。幼苗死亡表现为顶端分生组织呈褐色、上胚轴伸长停滞和/或营养生长停滞。若使用不同的细菌菌株，需通过实验确定其致病进程的时间。此外，应从浸水处理后开始每日监测对照植株的病害发展情况，直至明确从症状出现到幼苗死亡的一致时间范围。根据浸水实验中所用的基因型和处理方式，幼苗表型可记录为二元表型或按病害连续谱进行分级（图4）。当对野生番茄材料与感病栽培品种杂交所得的 F2 作图群体进行浸水接种时，可能观察到更广泛的表型谱（图4C）。根据幼苗死亡速度以及新生营养生长和分枝的程度，对分离群体采用病害连续谱进行表型鉴定可能是更合适的方法（图4C）。幼苗浸水接种实验还可与幼苗细菌生长实验联合使用，以定量评估单株幼苗中与定性表型相关的细菌增殖水平（图7）。与感病栽培品种相比，野生材料抗病幼苗中若出现显著的细菌生长抑制（即约降低 3 个对数级）或强抗性，提示其抗性遗传基础可能源于效应子触发的免疫反应（ETI）²²。而较小程度的细菌生长抑制（即约降低 1.7 个对数级），如在 LA1329 幼苗中所观察到的情况，可能归因于数量性状位点和/或模式触发免疫反应（PTI）所带来的较弱抗性贡献。因此，幼苗生长实验可成为进一步表征野生番茄品系抗性的重要工具。

至：

Pst 是一种叶部病原菌，优先定植于番茄幼苗的地上部分，包括子叶²⁴（图3）。因此，幼苗浸水接种实验中的定性表型分析主要关注幼苗地上部分的生长状况和病害症状，而用于细菌生长测定的组织样本则取自子叶，以进行定量分析。在浸水接种后，幼苗可能在接种 PstDC3000 后 7–10 天内死亡，或在接种 Pst19 后 10–14 天内死亡，如第 11 节所述。幼苗死亡表现为顶端分生组织变褐、上胚轴伸长停滞和/或营养生长停滞。若使用不同的细菌菌株，其致病进程需通过实验经验确定。此外，应每天监测对照植株的病害发展情况，直至明确从症状出现到幼苗死亡的一致时间范围。根据浸水实验中所用的基因型和处理方式，幼苗表型可记录为二元表型或按病害连续谱进行分级（图4）。当对野生番茄材料与感病栽培品种杂交产生的 F2 作图群体进行浸水接种时，可能观察到更广泛的表型谱（图4C）。根据幼苗死亡速度以及新产生的营养生长和分枝程度，对分离群体采用病害连续谱进行表型鉴定可能更为合适（图4C）。幼苗浸水接种实验还可与幼苗细菌生长实验联合使用，以定量评估单株幼苗中与定性表型相关的细菌增殖水平（图7）。与感病栽培品种相比，野生材料抗性幼苗中若出现极显著的细菌生长抑制（即约降低 3 个对数级）或强抗性，提示其抗性遗传基础可能源于效应子触发的免疫反应（ETI）²²。而细菌生长的较小程度抑制（即约降低 1.7 个对数级），如在 LA1329 幼苗中所观察到的，则可能归因于数量性状位点和/或模式分子触发的免疫反应（PTI）所提供的较弱抗性。因此，幼苗生长实验可成为进一步表征野生番茄品系抗性的重要工具。

讨论部分的第四段已从以下内容更新：

通常，为了鉴定野生番茄品系中对P. syringae的抗性遗传基础，遗传筛选是在4至5周大的成年番茄植株上进行的^20,21。成年番茄植株生长周期更长，在培养室中占用更多空间，且植株体积较大，因此通常每个品系只能筛选少量个体。幼苗浸润法为鉴定野生番茄品系中P. syringae抗性提供了一种强大而替代性的方法。在幼苗阶段进行筛选可测试更大的样本量，这对于检测遗传背景复杂的群体中的抗性尤为有利。由于所需培养室空间更小、生长周期更短，该方法有利于高通量筛选，并能快速发现野生品系对新发病原菌的天然抗性。此外，本实验中在幼苗阶段鉴定出的P. syringae抗性并不局限于特定发育阶段。S. neorickii LA1329和S. habrochaites LA1253最初在幼苗阶段被鉴定出具有抗性，如先前研究所述，它们在成年植株中同样表现出对PstT1的抗性²²。

至：

通常，为了鉴定野生番茄种质中对P. syringae的抗性遗传基础，遗传筛选是在4至5周龄的成年番茄植株上进行的^20,21。成年番茄植株需要更长的生长时间，在生长室中占用更多空间，且植株体积较大，因此通常每种品系只能筛选少量个体。幼苗浸润法为鉴定野生番茄种质中P. syringae抗性提供了一种强大而替代性的方法。在幼苗阶段进行筛选可测试更大的样本量，这在检测遗传背景复杂的群体中的抗性时尤为有利。减少对生长室空间和生长时间的需求，有助于实现高通量筛选，并快速发现野生种质对新发病原菌的天然抗性。此外，本实验中在幼苗阶段鉴定出的P. syringae抗性并不局限于特定发育阶段。S. neorickii LA1329和S. habrochaites LA1253最初在幼苗阶段被鉴定出具有抗性，其在成年植株中同样表现出对Pst19的抗性，如先前研究所述²²。

方案

已发布更正： 利用幼苗浸润法高通量鉴定番茄对Pseudomonas syringae pv. tomato的抗性。引言、实验方案、代表性结果和讨论部分已更新。

引言部分的最后一段已从以下内容更新：

在本实验方案所述的幼苗淹水试验中，将番茄幼苗在无菌的Murashige和Skoog（MS）培养基平板上培养10天，随后用含有目标细菌及表面活性剂的接种液进行淹水处理。淹水处理后，可通过细菌增殖测定对幼苗的抗病性进行定量评估。此外，在淹水处理7至14天后，幼苗的存活或死亡可作为明确的抗性或感病表型。该方法为大规模筛选野生番茄种质资源对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pst）小种1菌株（如Pst菌株T1（PstT1））的抗性提供了一种高通量的替代方案，并可轻松适用于其他感兴趣的细菌菌株。

至：

在本实验方案所述的幼苗淹水法中，将番茄幼苗在无菌的Murashige和Skoog（MS）培养基平板上培养10天，随后用含有目标细菌及表面活性剂的接种液进行淹水处理。淹水处理后，可通过细菌增殖实验对幼苗的抗病性进行定量评估。此外，在淹水处理后7–14天，幼苗的存活或死亡可作为明确的抗性或感病表型指标。该方法为大规模筛选野生番茄种质资源对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pst）小种1菌株（如Pst菌株19（Pst19））的抗性提供了一种高通量的替代方案，并可轻松适用于其他感兴趣的细菌菌株。

方案部分的第 4.8 步已从以下内容更新：

8. 1小时后，将瓶子转移至生物安全柜中，在无菌条件下向培养基中加入1,600 µL无菌的1 M MgSO₄，并加入适当的抗生素。
   注意：对于利福平抗性菌株 PstDC3000 和 PstT1，使用溶解于二甲基甲酰胺中的利福平，终浓度为50 µg/mL。为防止平板上真菌生长，使用溶解于乙醇中的放线菌酮，终浓度为50 µg/mL。

至：

8. 1 小时后，将瓶子转移至生物安全柜中，在无菌条件下向培养基中加入 1,600 µL 无菌的 1 M MgSO₄，并加入适量抗生素。
   注意：对于利福平抗性菌株 PstDC3000 和 Pst19，使用溶解于二甲基甲酰胺中的利福平，终浓度为 50 µg/mL。为防止平板上真菌生长，使用溶解于乙醇中的放线菌酮，终浓度为 50 µg/mL。

方案部分的第 5.2 步已从以下内容更新：

2. 从甘油菌种中划线接种细菌（例如 PstT1）至含有适当抗生素的KB琼脂平板上（见第4部分）。

至：

2. 从甘油菌种中挑取细菌（例如 Pst19），划线接种至含有适当抗生素的KB琼脂培养基上（见第4节）。

方案部分的第 5.6 步已从以下内容更新：

6. 对于 PstT1，将KB平板在28 ˚C培养48小时，然后用于喷雾接种实验。

至：

6. 对于 Pst19，将KB平板在28 ˚C下孵育48小时，然后用于喷雾接种实验。

方案部分的第 6 步已从以下内容更新：

6. 准备PstT1 接种物

至

6. 准备 Pst19 接种物

方案部分的第 6.2 步已从以下内容更新：

2. 在生物安全柜中使用无菌的 10 mM MgCl₂ 溶液进行系列稀释。对于 PstT1，使用分光光度计制备起始浓度为 OD₆₀₀ = 0.1 的接种液。

至：

2. 在生物安全柜中使用无菌的 10 mM MgCl₂ 溶液进行系列稀释。对于 Pst19，使用分光光度计制备起始浓度为 OD₆₀₀ = 0.1 的接种液。

方案部分的第 6.3 步已从以下内容更新：

3. 对于 PstT1，将初始重悬液从 OD₆₀₀ = 0.1 进行 1/10 稀释，以获得浓度为 OD₆₀₀ = 0.01 的系列稀释液。

至：

3. 对于 Pst19，将初始重悬液从 OD₆₀₀ = 0.1 进行 1/10 稀释，以获得浓度为 OD₆₀₀ = 0.01 的系列稀释液。

方案部分的第 8.3 步已从以下内容更新：

3. 设置计时器为 3 分钟。量取 6 mL 的最终接种液（PstT1 OD₆₀₀ = 0.0075 [第 6 节] 或 PstDC3000 OD₆₀₀ = 0.005 [第 7 节]），并将 6 mL 接种液分别转移至含有 10 天龄幼苗的每个培养皿中。

至：

3. 设置计时器为 3 分钟。量取 6 mL 的最终接种液（Pst19 OD₆₀₀ = 0.0075 [第 6 节] 或 PstDC3000 OD₆₀₀ = 0.005 [第 7 节]），并将 6 mL 接种液转移至每个含有 10 日龄幼苗的培养皿中。

方案部分的第 8.11 步已从以下内容更新：

11. 接种PstDC3000后7–10天或接种PstT1后10–14天进行表型观察（第11节）。若进行细菌增殖测定，应在接种后4天采集叶片组织（第9和第10节），随后进行表型分析（第11节）。或者，可分别使用不同的植株组进行表型分析和细菌增殖测定。

至：

11. 接种PstDC3000后7–10天或接种Pst19后10–14天进行表型观察（第11节）。若进行细菌增殖测定，应在接种后4天采集叶片组织（第9和第10节），随后进行表型分析（第11节）。或者，可分别使用不同的植株组进行表型分析和细菌增殖测定。

方案部分的第 10.7 步已从：

7. 获得菌落数量后（图2B），将菌落数归一化至0.01 g组织（针对幼苗），并转换为细菌生长对数值（表1）。
   注：Moneymaker-PtoS 子叶的平均质量为0.01 g，该数值通过实验确定²²。

基因型1 第A列	组织重量 (g) 第B列	点样区域菌落数 第C列	点样稀释倍数2 第D列	校正后菌落数3 第E列	系列稀释倍数 第F列	总菌落数 第G列 (cfu/0.01 g)4	平均菌落数 (cfu/0.01 g) 第H列	平均对数生长量 (cfu/0.01 g (log10)) 第I列
样品 1	0.004 g	10	200	计算方法：(C2 × 0.01 g) / B2 = 25	1000	计算方法：(D2 × E2 × F2) = 5000000	样品1至最后一个样品的平均值：(例如，G1:G3的平均值) = 7000000	平均值的对数，即 log(H2) = 6.85
样品 2	0.003 g	15	200	50	1000	10000000
样品 3	0.002 g	6	200	30	1000	6000000
1数据显示3个样品
2基于将5 µL × 200点样至1 mL
3子叶过小无法取芯，因此菌落计数根据一个MoneyMaker-PtoS子叶的平均质量归一化至0.01 g组织（数据未显示）
4根据点样体积调整为每毫升数值

表1：幼苗细菌生长实验的示例计算。 示例计算展示了如何对细菌计数进行归一化处理，并确定细菌生长的对数值。

至：

7. 获得菌落数量后（图2B），将菌落数标准化为每0.1 g组织（针对幼苗），并转换为细菌生长对数值（表1）。
   注：一个Moneymaker-PtoS 子叶的平均质量为0.1 g，该数值为经验测定²²。

基因型1 列 A	组织重量 (g) 列 B	点样中菌落数量 列 C	点样的稀释倍数2 列 D	校正后菌落数量3 列 E	系列稀释的稀释倍数 列 F	总菌落数量 列 G (cfu/0.01 g)4	平均菌落数量 (cfu/0.01 g) 列 H	平均对数生长量 (cfu/0.1 g (log10)) 列 I
样本 1	0.04 g	10	200	计算方法：(C2 × 0.1 g) / B2 = 25	1000	计算方法：(D2 × E2 × F2) = 5000000	样本1至最后一个样本的平均值：(例如，G1:G3 的平均值) = 7000000	平均值的对数，即 log(H2) = 6.85
样本 2	0.03 g	15	200	50	1000	10000000
样本 3	0.02 g	6	200	30	1000	6000000
1数据显示为3个样本
2基于点样 5 µL × 200 得到 1 mL
3子叶过小无法取芯，因此菌落计数根据一个 MoneyMaker-PtoS 子叶的平均质量归一化至 0.1 g 组织（数据未显示）
4根据点样体积调整为每毫升数值

表1：幼苗细菌生长实验的示例计算。 示例计算展示了如何对细菌计数进行归一化处理，并确定细菌生长的对数值。

将方案部分的第 11.3 步更新为：

3. 在淹灌接种后10–14天观察感染PstT1的植株表型。

至：

3. 在浸润接种后10–14天观察感染Pst19的植株表型。

Protocol 部分中的图 4 已从以下内容更新：

图 4：不同遗传背景下幼苗抗性与死亡表型的示意图。（A）Rio Grande-PtoR 与近等基因系品种 Rio Grande-PtoS 的幼苗在用 PstDC3000（OD₆₀₀ = 0.005）+ 0.015% 表面活性剂浸润处理后第 7 天的表型如图所示。Rio Grande-PtoR 表现出稳定的抗性，而 Rio Grande-PtoS 表现出稳定的感病性，对 PstDC3000 感染具有明显且二元的表型差异。（B）野生材料（如 Solanum neorickii LA1329）的幼苗在用 PstT1（OD₆₀₀ = 0.0075）+ 0.015% 表面活性剂浸润处理后第 10 天的表型如图所示。这些幼苗表现出一定的表型变异，但仍被记录为二元表型。表型变异的程度以及表型记录方式（二元抗性或抗性谱）取决于所测试的具体材料。（C）通过将野生材料与感病品种杂交产生的定位群体，其 F2 分离群体可能表现出更广泛的表型谱。在此情况下，将幼苗表型记录为连续谱可能更为合适。在用 PstT1 处理后，定位群体中高度感病的幼苗最早在第 7 天即可观察到死亡表型，通常表现为顶端分生组织呈褐色、上胚轴几乎不伸长、无新绿色营养生长。感病幼苗的顶端分生组织可能在较长时间内保持绿色或浅褐色，上胚轴可能有轻微伸长，营养生长极少，并在第 10 天左右变褐并停止生长。可根据第 14 天时新产生的及持续进行的营养生长量，对单株幼苗进行抗性表型鉴定。随后可根据上述描述的表型将幼苗划分为不同的抗性等级，例如弱抗性、中等抗性或强抗性。请点击此处查看该图的放大版本。

至：

图4：不同遗传背景下幼苗抗性与死亡表型的示意图。（A）Rio Grande-PtoR 与近等基因系品种 Rio Grande-PtoS 的幼苗在用 PstDC3000（OD₆₀₀ = 0.005）+ 0.015% 表面活性剂浸润处理7天后的情况如图所示。Rio Grande-PtoR 表现出稳定的抗性，而 Rio Grande-PtoS 对 PstDC3000 感染表现出稳定的感性。这两个品系呈现出明显且为二元的表型。（B）野生材料（如 Solanum neorickii LA1329）的幼苗在用 Pst19（OD₆₀₀ = 0.0075）+ 0.015% 表面活性剂浸润处理10天后的情况如图所示。幼苗表现出表型变异性，但记录时仍归为二元表型。表型变异的程度以及表型记录方法（二元抗性或抗性谱）将取决于所测试的具体材料。（C）通过将野生材料与感性栽培品种杂交产生的作图群体，其F2分离群体可能表现出更广泛的表型谱。在这种情况下，以连续谱形式记录幼苗表型可能更为合适。在用 Pst19 处理时，作图群体中高度感性的幼苗最早在第7天即可表现出死亡表型，通常表现为顶端分生组织呈褐色、上胚轴几乎不伸长、无新绿色营养生长。感性幼苗的顶端分生组织可能在较长时间内保持绿色或浅褐色，上胚轴可能有轻微伸长，营养生长极少，至第10天时转为褐色并停止生长。可根据第14天时新产生的及持续进行的营养生长量，对单株幼苗进行抗性表型鉴定。随后可根据上述描述的表型将幼苗划分为不同的抗性等级，例如弱抗性、中等抗性或强抗性。请点击此处查看该图的放大版本。

代表性结果部分的第二段已从以下内容更新：

利用幼苗抗性测定法对野生种质资源进行表型筛选
图6展示了感病和抗病种质资源幼苗在接种PstT1后10–14天的代表性结果。感病种质资源包括RG-PtoR、S. pimpinellifolium LA1375和S. pimpinellifolium LA1606，抗病种质资源包括S. neorickii LA1329。10日龄幼苗分别用含10 mM MgCl₂和0.015%表面活性剂的溶液作为阴性对照，以及光学密度为0.0075、含0.015%表面活性剂的PstT1菌液进行淹水处理。接种后至少10天进行表型观察，因为PstT1感染的幼苗死亡速度比PstDC3000感染的幼苗更慢。模拟接种的幼苗呈现绿色、健康且持续生长。该对照至关重要，用于确保种质资源对表面活性剂浓度不敏感，并排除细菌污染的可能性。感病种质资源（Rio Grande-PtoR [n = 7]、S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7] 和 S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]）在接种PstT1后10–14天全部死亡，顶端分生组织呈褐色，且无新组织生长。相比之下，两个S. neorickii LA1329（n = 3）幼苗表现出大量新生绿色组织，并成功抵抗了PstT1感染（图6）。另有三株LA1329幼苗未萌发。通常，在初筛中每种种质资源检测5–7株个体，以确定群体中抗性性状的普遍程度。当对遗传背景较复杂的野生种质资源（如LA1329）接种PstT1时，其抗性表型在不同幼苗间的变异程度略高于经PstDC3000处理的Moneymaker-PtoR。然而，其表型变异通常仍低于F2作图群体中的变异水平。因此，对LA1329采用二元表型分类标准。

至：

利用幼苗抗性测定法对野生种质资源进行表型筛选
图6 展示了感病和抗病种质资源幼苗在接种 Pst19 后10–14天的代表性结果。感病种质资源包括 RG-PtoR、S. pimpinellifolium LA1375 和 S. pimpinellifolium LA1606；抗病种质资源包括 S. neorickii LA1329。10日龄幼苗分别用含0.015% 表面活性剂的10 mM MgCl₂ 作为阴性对照，以及含0.015% 表面活性剂、光密度为0.0075的 Pst19 进行淹水处理。接种后至少10天进行表型观察，因为感染 Pst19 的幼苗死亡速度慢于感染 PstDC3000 的幼苗。模拟接种的幼苗保持绿色、健康并持续生长。该对照至关重要，可用于确认种质资源对表面活性剂浓度无敏感性，并排除细菌污染的可能性。感病种质资源（Rio Grande-PtoR [n = 7]、S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7] 和 S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]）在接种 Pst19 后10–14天已死亡，顶端分生组织呈褐色，且无新芽生长。相比之下，两株 S. neorickii LA1329（n = 3）表现出大量新生绿色组织，并成功抵御了 Pst19 感染（图6）。三株 LA1329 幼苗未萌发。通常，在初筛中每种种质资源检测5–7个个体，以评估群体中抗性表型的普遍程度。当对遗传背景更复杂的野生种质资源（如 LA1329）接种 Pst19 时，其个体幼苗间的抗性表型变异略大于经 PstDC3000 处理的 Moneymaker-PtoR，但通常仍小于F2作图群体中的变异程度。因此，对 LA1329 采用二元表型分类标准。

代表结果部分的图6已从以下内容更新：

图 6：野生种质材料在接种后 10–14 天的抗性或病害表型特征分析。 Rio Grande-PtoR、S. pimpinellifolium LA1606、S. pimpinellifolium LA1375 和 S. neorickii LA1329 番茄幼苗在 0.5x MS 培养基平板上生长 10 天后，用 PstT1（OD₆₀₀ = 0.0075）加 0.015% 表面活性剂进行浸润接种。图中显示了每种野生种质材料在测试总数中存活的幼苗数量。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

至：

图6：野生种质材料接种后10–14天的抗性或发病表型特征分析。 Rio Grande-PtoR、S. pimpinellifolium LA1606、S. pimpinellifolium LA1375 和 S. neorickii LA1329 番茄幼苗在0.5x MS培养基平板上生长10天后，用Pst19（OD₆₀₀ = 0.0075）+ 0.015% 表面活性剂溶液浸润处理。图中显示各野生种质材料在测试总数中存活幼苗的数量。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的高清版本。

代表性结果部分的第三段已从：

利用幼苗浸水法对细菌生长进行定量评估
为验证LA1329对PstT1所表现出的抗性是否导致细菌生长减少，我们在番茄幼苗中进行了细菌生长测定实验。在接种感染后第4天测定Moneymaker-PtoS和S. neorickii LA1329中PstT1的生长水平。Moneymaker-PtoS是一个近等基因系，其个体幼苗之间具有稳定的感病性。而野生种质资源如S. neorickii LA1329通常具有更复杂的遗传背景。LA1329在整个群体中对PstT1表现出约60%的抗性²²。由于幼苗在感染后可能会脱落子叶，因此每块培养板仅种植一株幼苗，以便将收获的子叶中细菌生长量与幼苗整体的存活或死亡表型相关联，该表型在浸水处理至少10天后通过表型观察确定。每株幼苗在第4天的细菌计数被标准化为每0.01 g组织，并转换为对数生长值（CFU/0.01 g（log₁₀））。将表型抗性LA1329幼苗（LA1329^RES）和表型感病幼苗（LA1329^SUS）的对数生长值分别归类汇总，并相互比较，同时与感病品种Moneymaker-PtoS进行比较。例如，LA1329^RES（对数值6.3）与LA1329^SUS（对数值8.0）之间的细菌生长差异为1.7个对数单位，LA1329^RES（对数值6.3）与Moneymaker-PtoS（对数值7.9）之间的差异为1.6个对数单位（图7）。因此，在幼苗测定实验中，表型抗性与定量抗性呈正相关。

至：

利用幼苗浸水法对细菌生长进行定量评估
为验证LA1329对Pst19表现出的抗性是否导致细菌生长减少，在番茄幼苗中进行了细菌生长测定实验。接种后第4天测定Pst19在Moneymaker-PtoS和S. neorickii LA1329中的生长水平。Moneymaker-PtoS是一个近等基因系，其个体幼苗间具有稳定的感病性。而野生种质资源如S. neorickii LA1329通常具有更复杂的遗传背景。LA1329在整个群体中对Pst19表现出约60%的抗性²²。由于幼苗在接种后可能脱落子叶，因此每块培养皿中仅种植一株幼苗，以便将收获的子叶中检测到的细菌生长量与幼苗整体的存活或死亡表型相关联，表型判定至少在浸水处理10天后进行。每株幼苗第4天的细菌计数均标准化为0.01 g组织，并转换为对数生长值（CFU/0.01 g（log₁₀））。表型抗性LA1329幼苗（LA1329^RES）和表型感病幼苗（LA1329^SUS）的对数生长值分别归类汇总，并相互比较，同时与感病品种Moneymaker-PtoS进行比较。例如，LA1329^RES（对数值6.3）与LA1329^SUS（对数值8.0）之间的细菌生长差异为1.7个对数单位，而LA1329^RES（对数值6.3）与Moneymaker-PtoS（对数值7.9）之间的差异为1.6个对数单位（图7）。因此，幼苗实验中的表型抗性与定量抗性呈正相关。

代表结果部分的图7已从以下内容更新：

x

图7：抗性Solanum neorickii LA1329幼苗中的细菌生长水平低于Moneymaker-PtoS或感病型S. neorickii LA1329。 接种PstT1后第4天测定S. neorickii LA1329（n = 14）和Moneymaker-PtoS（n = 10）幼苗的细菌数量，并以每0.01克组织为单位进行归一化处理。对于LA1329，分别观察并计数了两种表型群体：感病型（SUS）和抗性型（RES）。柱状图上方的星号*表示通过单因素方差分析确定的统计学显著差异。采用一般线性模型程序（p < 0.001），并使用Tukey事后检验进行均值多重比较。误差线表示标准误。该图展示了一次代表性实验的结果。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 7：抗性 Solanum neorickii LA1329 幼苗中的细菌生长水平低于 Moneymaker-PtoS 或感病型 S. neorickii LA1329。 接种后第 4 天测定感染 Pst19 的 S. neorickii LA1329（n = 14）和 Moneymaker-PtoS（n = 10）幼苗的细菌数量，并以每 0.1 g 组织为基准进行归一化处理。对于 LA1329，观察到两种表型群体——感病型（SUS）和抗性型（RES），并分别计数。柱状图上方的星号 * 表示通过单因素方差分析确定的统计学显著差异。采用一般线性模型程序（p < 0.001），随后使用 Tukey 事后检验进行均值多重比较。误差线表示标准误。该图展示了一次代表性实验的结果。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论部分的第一段已从以下内容更新：

一种用于淹水接种的方案 PstDC3000 或 Pst描述了一种经优化的T1方法，用于检测番茄幼苗对这些细菌菌株的抗性。幼苗抗性测定中获得最佳结果需控制多个关键参数，包括细菌浓度和表面活性剂浓度，这些参数均通过实验确定。²²。对于 PstDC3000，通过优化光密度以实现在含有抗性基因的抗性品种上的完全存活 Pto/Prf 在缺乏该基因的感病品种上形成簇状并完全致死 Pto/Prf 簇²²对于像这样的菌株 PstT1时期，由于尚无已知的抗性品种，通过优化使光密度降至最低，以确保植株完全且一致地死亡²². Uppalapati 等²⁴ 设计了一种番茄幼苗检测方法以研究病害发生机制 PstDC3000 及其毒力功能中的冠菌素。在此毒力测定实验中，感染过程使用浓度调整至 OD 的细菌进行₆₀₀ 0.1的²⁴，是我们耐药性检测所用菌株光密度的20倍。对 Pst番茄幼苗中携带的DC3000效应子AvrPto和AvrPtoB Pto/Prf 基因簇导致ETI和宏观的HR²²在强免疫反应（如ETI）背景下，使用了较低的细菌滴度 PstDC3000，以避免植物遗传抗性被过度激活 Pto/Prf 基因簇²²此外，这些结果表明，高浓度的细菌可能会压倒较弱的免疫反应，例如PTI或由多个基因共同决定整体表型的定量部分抗性。表面活性剂对于细菌黏附于叶片表面是必需的；然而，高浓度会导致叶片出现黄化现象。²²我们先前测试了一系列表面活性剂浓度，以通过实验确定10日龄番茄幼苗中的最佳浓度²²在测试对表面活性剂敏感性可能存在差异的新物种时，应优化表面活性剂浓度，以确定在无细菌条件下不会引起损伤或黄化的浓度。合适的测定条件需要优化表面活性剂浓度（不造成损伤）和细菌浓度（在所有易感对照中均引起病害）。

至：

一种用于淹水接种的方案 PstDC3000 或 Pst19 种用于检测番茄幼苗对这些细菌菌株抗性的优化方法已被描述。幼苗抗性测定中获得最佳结果的关键参数包括细菌浓度和表面活性剂浓度，这些参数均通过实验确定。²²。对于 PstDC3000，通过优化光密度以在含有抗性基因的抗性品种上实现完全存活 Pto/Prf 在缺乏该基因的感病品种上形成菌落并导致完全死亡 Pto/Prf 簇²²对于像这样的菌株 Pst19，在无已知抗性品种的情况下，将光密度优化至尽可能低，以确保植株一致且完全死亡²². Uppalapati 等人²⁴ 设计了一种番茄幼苗测定方法，用于研究病原菌的致病机制 PstDC3000 及冠菌素的毒力功能。在此毒力测定中，感染实验使用浓度为 OD 的细菌进行₆₀₀ 0.1²⁴，是我们耐药性检测所用菌株光密度的20倍。对 Pst番茄幼苗中携带的DC3000效应子AvrPto和AvrPtoB Pto/Prf 基因簇导致ETI和宏观的HR²²在强烈的免疫反应（如ETI）背景下，使用了较低的细菌滴度 PstDC3000以避免植物遗传抗性被过度激活 Pto/Prf 基因簇²²此外，这些结果表明，高浓度的细菌可能会压倒较弱的免疫反应，例如PTI或由多个基因共同决定整体表型的定量部分抗性。表面活性剂对于细菌黏附于叶片表面是必需的；然而，高浓度会导致叶片出现黄化现象。²²我们先前通过实验测试了一系列表面活性剂浓度，以确定10日龄番茄幼苗中的最佳浓度²²在测试对表面活性剂敏感性可能存在差异的新物种时，应优化表面活性剂浓度，以确定在无细菌条件下不会引起损伤或黄化的浓度。合适的测定条件需要优化表面活性剂浓度以避免造成损伤，同时优化细菌浓度，使其能在所有易感对照植株中引发病害。

讨论部分的第三段已从：

Pst 是一种叶部病原菌，优先定植于番茄幼苗的地上部分，包括子叶²⁴（图3）。因此，幼苗浸水接种实验中的定性表型分析主要关注幼苗地上部分的生长状况和病害症状，而用于细菌生长测定的组织样本也取自子叶以进行定量分析。浸水接种后，幼苗可能在接种 PstDC3000 后 7–10 天内或接种 PstT1 后 10–14 天内死亡，具体如第11节所述。幼苗死亡表现为顶端分生组织变褐、上胚轴伸长停滞和/或营养生长停滞。若使用不同的细菌菌株，其致病时间需通过实验确定。此外，应从浸水处理后开始每日监测对照植株的病害发展进程，直至明确从症状出现到幼苗死亡的一致时间范围。根据浸水实验中所用的基因型和处理方式，幼苗表型可记录为二元表型或按病害严重程度谱进行分级（图4）。当对野生番茄材料与感病栽培品种杂交后产生的F2作图群体进行浸水接种时，可能观察到更广泛的表型谱（图4C）。根据幼苗死亡速度以及新生营养生长和分枝的程度，对分离群体采用病害严重程度谱进行表型鉴定可能是更优的选择（图4C）。幼苗浸水接种实验还可与幼苗细菌生长实验联合使用，以定量评估单株幼苗中与定性表型相关的细菌增殖水平（图7）。与感病栽培品种相比，野生材料抗病幼苗中细菌生长量显著降低（即约降低3个对数级）或表现出强抗性，提示其抗性遗传基础可能源于效应子触发的免疫反应（ETI）²²。而细菌生长量较小幅度的降低（即约降低1.7个对数级），如在LA1329幼苗中所观察到的情况，可能归因于数量性状位点和/或模式分子触发的免疫反应（PTI）所提供的较弱抗性。因此，幼苗生长实验可作为进一步表征野生番茄品系抗病性的关键工具。

至：

Pst 是一种叶部病原菌，优先定植于番茄幼苗的地上部分，包括子叶²⁴（图3）。因此，幼苗浸水接种实验中的定性表型分析主要关注幼苗地上部分的生长状况和病害症状，而用于细菌生长测定的组织样本则取自子叶，以进行定量分析。在浸水接种后，幼苗可能在接种 PstDC3000 后 7–10 天内死亡，或在接种 Pst19 后 10–14 天内死亡，如第 11 节所述。幼苗死亡表现为顶端分生组织变褐、上胚轴伸长停滞和/或营养生长停滞。若使用不同的细菌菌株，其死亡时间需通过实验确定。此外，应每天监测对照植株的病害发展进程，直至明确从症状出现到幼苗死亡的一致时间范围。根据浸水实验中所用的基因型和处理方式，幼苗表型可记录为二元表型或按病害连续谱进行分级（图4）。当对野生番茄材料与感病栽培品种杂交产生的 F2 作图群体进行浸水接种时，可能观察到更广泛的表型谱（图4C）。根据幼苗死亡速度以及新产生的营养生长和分枝程度，对分离群体采用病害连续谱进行表型鉴定可能是更合适的方法（图4C）。幼苗浸水接种实验还可与幼苗细菌生长实验结合使用，以定量评估单株幼苗定性表型所对应的细菌增殖水平（图7）。与感病栽培品种相比，野生材料抗性幼苗中若出现极显著的细菌生长抑制（即约降低 3 个对数级）或强抗性，提示其抗性遗传基础可能源于效应子触发的免疫反应（ETI）²²。而较小程度的细菌生长抑制（即约降低 1.7 个对数级），如在 LA1329 幼苗中所观察到的情况，可能归因于数量性状位点和/或模式分子触发的免疫反应（PTI）所提供的较弱抗性。因此，幼苗生长实验可成为进一步表征野生番茄品系抗性的重要工具。

讨论部分的第四段已从以下内容更新：

通常，为了鉴定野生番茄种质中对P. syringae的抗性遗传基础，遗传筛选是在4至5周龄的成年番茄植株上进行的^20,21。成年番茄植株需要更长的生长时间，在培养室中占用更多空间，且植株体积较大，因此通常每种品系只能筛选少量个体。幼苗浸润法为鉴定野生番茄种质中P. syringae抗性提供了一种强有力的替代方法。在幼苗阶段进行筛选可测试更大的样本量，这在检测遗传背景复杂的群体中的抗性时尤为有利。减少对培养室空间和生长时间的需求，有助于实现高通量筛选，并快速发现野生种质对新发病原菌的天然抗性。此外，本实验中在幼苗阶段鉴定出的P. syringae抗性并不局限于特定发育阶段。S. neorickii LA1329和S. habrochaites LA1253最初在幼苗阶段被鉴定出具有抗性，其在成年植株中也表现出对PstT1的抗性，如先前研究所述²²。

至：

通常，为了鉴定野生番茄种质中对P. syringae的抗性遗传基础，遗传筛选是在4至5周龄的成年番茄植株上进行的^20,21。成年番茄植株需要更长的生长时间，在培养箱中占用更多空间，且植株体积较大，因此通常每株系只能筛选较少个体。幼苗浸润法为鉴定野生番茄种质中P. syringae抗性提供了一种强大而替代性的方法。在幼苗阶段进行筛选可测试较大的样本量，这在检测遗传背景复杂的群体中抗性时尤为有利。减少的培养箱空间需求和生长时间有助于实现高通量筛选，并快速发现野生种质对新发病原菌的天然抗性。此外，本实验中在幼苗阶段鉴定出的P. syringae抗性并不局限于特定发育阶段。S. neorickii LA1329和S. habrochaites LA1253最初在幼苗阶段被鉴定出具有抗性，其在成年植株中同样表现出对Pst19的抗性，如先前所述²²。