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方法文章

基于酶标仪的荧光法评估线粒体耗氧量

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DOI：

10.3791/65760

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2024年4月12日

 ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Biology Department, Elon University

本文内容

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摘要

评估氧气消耗可提供有关线粒体功能的综合信息。利用磷光探针结合荧光酶标仪，无需专用设备即可轻松获得准确且可重复的数据。该检测方法使任何实验室均可测量分离线粒体的氧气消耗，并计算呼吸控制比。

摘要

线粒体具有多种重要功能，包括细胞呼吸、ATP生成、调控细胞凋亡，以及作为代谢通路的核心枢纽。因此，通过实验评估线粒体功能可揭示不同群体或疾病状态之间的差异。此外，评估分离得到的线粒体是否处于足够健康的状态以用于后续实验也具有重要意义。在不同样本之间比较线粒体功能时，常采用的一个指标是氧气消耗速率。无论是对完整细胞还是从组织中分离的线粒体，测定其氧气消耗速率并进一步计算呼吸控制比，均可实现上述三个目的。本研究利用从刷尾蜥蜴肝脏中分离的线粒体，结合一种对溶液中氧气浓度变化敏感的磷光探针，通过荧光酶标仪测定氧气消耗速率。该方法不仅快速高效，而且所需线粒体量少，无需特殊设备。本文所述的逐步操作方案可提高线粒体功能评估技术在科研人员中的可及性。

引言

线粒体是存在于真核细胞中、大小约与细菌相当的细胞器。它们是一类独特的细胞器，因其含有自身的DNA，并具有外膜和内膜两层膜结构。线粒体的外膜与内膜之间为膜间隙，而内膜向内折叠形成称为嵴的结构，围绕着最内层的腔室，即基质。这些嵴增大了内膜的表面积，使得多个依赖嵴进行的过程能够同时发生。尽管线粒体参与多种细胞功能，例如调控细胞凋亡以及承载多种代谢通路，但其在ATP生成中的关键作用对细胞存活至关重要。事实上，细胞90%的能量来源于线粒体1。ATP的生成涉及在外膜与内膜之间建立电化学梯度，这一电化学梯度被称为线粒体膜电位（Δψ），其产生机制是质子（H+）从基质被泵入膜间隙。ATP的生成最终通过还原当量的氧化过程实现，即电子在线粒体呼吸链（ETC）中的传递。该过程的最终电子受体是分子氧（O2）。随着氧气的消耗，H+浓度差逐渐增大至最大值，此时H+离子顺着浓度梯度从膜间隙穿过ATP合酶复合体进入基质。H+离子的流动引起ATP合酶的构象改变，使ADP与无机磷酸靠近并反应生成ATP。最终，ATP从线粒体基质转运至胞质溶胶，可被储存或用于驱动各种生化反应，因其磷酸键水解时可释放大量自由能。整个过程称为氧化磷酸化；由于该过程消耗氧气，因此称线粒体具有呼吸作用2。

Δψ的建立及其强度、被还原的O2量（称为耗氧量）以及ATP的生成均可作为细胞健康状况的指标。线粒体功能研究，例如Δψ、总ATP含量与生成量以及耗氧量的测定，既可通过传统的生化方法，也可通过基于微孔板的荧光和发光检测进行定量。例如，可使用特异性结合线粒体的荧光染料（如四甲基罗丹明乙酯）比较不同样品之间的线粒体膜电位。通过向反应体系中添加一种发光蛋白，其发光变化与ATP浓度相关，从而可监测ATP的生成。在氧化磷酸化（OXPHOS）过程中，对耗氧速率或绝对呼吸速率的定量有助于阐明线粒体功能和能量代谢差异的原因。耗氧量评估可用于计算呼吸控制比（RCR）。RCR值描述了线粒体响应ADP流入而生成ATP的能力，这正是线粒体的主要功能。RCR值反映了分离线粒体的整体状态，并可用于比较不同实验处理下的响应情况。RCR值的差异可能代表线粒体功能障碍，或提示从两个或多个不同来源分离的线粒体之间存在生物学差异。另一个评估分离线粒体功能的重要指标是线粒体效率，定义为每消耗1摩尔O2所合成的ATP摩尔数，即P/O比值3。

鉴于通过测量线粒体参数所能获取的信息量及其在多种研究场景中的应用潜力，高效获取功能数据的能力在众多不同研究领域中均具有重要价值。数十年来，线粒体耗氧量的测量依赖于特定仪器——如使用克拉克电极（Clark electrode），但该方法受限于测量所需样本量较大；近年来也出现了可同时测定线粒体呼吸及其他多个参数的先进仪器，但其高昂成本限制了广泛应用。本实验方案采用一种经改进的替代方法，利用氧敏感型磷光探针（MitoXpress）4,5，通过酶标仪在时间分辨荧光模式下对信号进行随时间连续检测。相较于荧光，磷光在吸收光子与发射光子之间具有更大的能量差，因此更适合对信号变化进行持续监测。该方法使得几乎所有实验室均可开展此类测量，而不仅限于专注于线粒体代谢或具备高精尖设备的研究团队。本研究采用的模型系统为三种树蜥的分离线粒体，包括两个亲本物种及一个基因渗入种（即含有一个亲本物种的核DNA和另一亲本物种的线粒体DNA——杂交种）。选择这些蜥蜴是因为我们假设：当杂交个体的核DNA与线粒体DNA来源不同时，可能引发代谢和能量层面的后果。本研究使用市售的检测试剂盒结合多功能酶标仪，有助于提升更多研究人员及科研领域对此类检测技术的可及性。

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方案

蜥蜴通过 CO2 根据动物实验室福利办公室及艾隆大学机构动物护理与使用委员会指南中所述政策，实施窒息后立即断头处死。

1. 线粒体的分离6

注意：所有溶液和样品在这些步骤中均需保持低温（表1），并置于冰上。

  1. 取出肝脏，称重，然后用约 3 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（1x, -/-）冲洗。
  2. 用新的剃须刀片在 1 mL L-MIB 中将肝脏组织切碎。
  3. 将组织与 L-MIB 的总体积调至 2 mL，使用 Dounce 匀浆器机械破碎肝细胞，匀浆 4 次。
  4. 在 300 × g 条件下离心（37 °C，10 分钟）。
  5. 将上清液转移至新离心管中，并置于冰上。
  6. 将沉淀重悬于 2 mL L-MIB 中，再次匀浆，然后在 300 × g 条件下离心（37 °C，10 分钟）。
  7. 合并两次离心所得的上清液，并在 10,000 × g 条件下离心（37 °C，10 分钟）。
  8. 将沉淀重悬于约 0.350 mL L-MIB 中。
  9. 测定总蛋白含量（线粒体毫克数/mL L-MIB），作为线粒体含量的估算依据4,5,6。

2. 氧消耗

  1. 将后续步骤中使用的所有溶液（表1）在水浴中预热至 30 °C。
  2. 根据步骤 1.9 中的蛋白浓度测定结果，用 LEB 将线粒体稀释至 6 mg/mL。
  3. 在无菌黑色壁透明底的 96 孔板（表2）中设置检测反应：
    1. 向相应的孔中加入 50 µL 样品（L-EB 缓冲液或线粒体样品）。
    2. 加入 50 µL 处理液（L-EB、谷氨酸/苹果酸，或含 ADP 的谷氨酸/苹果酸）。
    3. 将探针原液用 L-EB 按 1:10 稀释，然后向每孔加入 100 µL 荧光探针。
    4. 轻轻向每孔加入 50 µL 重质矿物油，以隔绝环境中的氧气。
  4. 在 45 分钟内，每隔 1.5 分钟从底部读取一次荧光值，激发/发射波长为 380/650 nm。使用动力学模式，时间延迟设为 30,000 µs，检测窗口设为 100 µs。

3. 数据分析

  1. 从酶标仪计算机导出原始数据文件为 .xls 文件。
  2. 打开文件，将原始数据复制并粘贴到一个新工作表中，并适当地标注行和列。
  3. 将仅含 L-EB 缓冲液的对照样品与含 L-EB + G/M 的样品以相对荧光单位（RFU）对时间作图。
    注：由于不存在线粒体，因此不应检测到氧气浓度的变化，这些曲线应相对平坦。
  4. 将含 L-EB + G/M 的样品值以相对荧光单位（RFU）对时间作图。
  5. 确定对照组数据读数何时趋于稳定并变得平坦。
    注：实验样品的数据分析应从此时间点开始（如图1A中箭头所示）。反应可能需要 10–15 分钟才能趋于平稳并达到最大值。
  6. 新建一个图表，仅包含第 3.5 步确定的时间点之后的数据（称为“截断”数据），并添加最佳拟合直线，以直观展示待分析的原始数据。
  7. 计算截断后仅含缓冲液的对照组数据的平均 RFU 值（以黄色高亮显示）。该值在后续氧气浓度计算中用作最小 RFU 值，即基线。
  8. 氧气消耗速率的计算（µM O2/min）
    1. 复制并粘贴第 3.6 步原始数据中的线性区域（即截断后的数据），用于确定在 G/M + ADP 处理下每个时间点线粒体样品中的氧气浓度7,8,9,10。
    2. 使用公式（1）5 计算每个时间点的氧气浓度。[O2]a 表示空气饱和缓冲液中的氧气浓度（在 30 °C 时为 235 mM）。I(t)、Ia 和 Io 分别表示在时间 t 时样品与探针的荧光信号（例如，样品 + G/M + ADP）、第 3.7 步计算得到的空气饱和缓冲液中探针的平均信号，以及脱氧缓冲液中的最大信号（设定为可达到的最大信号值）。
      氧气浓度方程，动力学分析，化学过程公式，教学示意图。     （1）
    3. 将第 3.8.2 步计算得到的 [O2]t 值对时间作图，并添加线性趋势线及最佳拟合直线的方程。
      注：将每条直线的斜率用作氧气消耗速率。任何样品的重复实验（双复孔或三复孔）数据可合并后用于消耗速率的比较。
  9. 通过将含 ADP 的线粒体呼吸速率（状态 3）除以不含 ADP 的呼吸速率（状态 2），计算呼吸控制比（RCR）。

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结果

使用含有磷光氧传感探针的检测试剂盒和标准荧光酶标仪，测定了三种不同蜥蜴线粒体的耗氧率和线粒体呼吸控制比（RCR）。先前的研究表明，该试剂盒中的探针与耗氧量直接相关，其中分子氧会淬灭磷光信号，而随着线粒体呼吸导致氧气水平下降，荧光信号则相应增强7,11。分别记录对照组和实验组样品随时间变化的相对荧光单位（RFU）值，并进行分析。将对照孔（仅缓冲液、缓冲液加谷氨酸/苹果酸、缓冲液加谷氨酸/苹果酸 + ADP）的RFU读数对时间作图，以确认实验孔中荧光变化确实由线粒体的存在引起。此外，谷氨酸/苹果酸 + ADP对照组可用于确定数据采集期间的基线氧含量。含有分离线粒体的实验样品也与对照组一同绘制在同一图表上。

图1A 显示，来自分离线粒体样品的相对荧光单位（RFU）随时间逐渐增加，而对照组的RFU值则相对平稳。由于反应需要时间达到平衡，因此从数据集中剔除了前约10个读数，直至对照样品的读数不再出现明显波动并趋于平稳...

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讨论

在比较不同样本时，测量线粒体功能具有重要意义，例如比较疾病状态与非疾病状态、同一动物的不同组织类型，或不同类型的样本之间。我们采用后一种比较方式来验证我们的假设，即线粒体发生基因渗入的杂交树蜥存在代谢后果。实验上评估线粒体功能的方法多种多样，包括测定膜电位（Δψ）、总ATP含量、ATP生成量、呼吸控制以及耗氧速率。分离线粒体的耗氧量测量可通过专用设备完成，例如克拉克电极或更先进的Seahorse XFe分析仪。然而，这些方法可能受限于实验所需样本量，或因成本过高而难以实施。能够检测荧光的多功能酶标仪已成为细胞生物学和生物化学实验室的标准设备。因此，一种替代性的定量分析线粒体耗氧量的方法是使用市售试剂盒结合荧光酶标仪进行检测。本逐步操作方案详细描述了如何测量耗氧量并完成相关计算，且该方法经济高效，适用于分离的线粒体。精确测量线粒体在提供ADP条件下生成ATP的能力（称为状态3呼吸），可实现样本间氧化磷酸化（OXPHOS）能力的直接比较，其差异可反映功能上的差别。此外，状态3呼吸还可反映所分离线粒体的质量，从而判断分离流程是否成功，以及样本是否适用于其他检测。呼吸控制比（RCR）值通过状态2（仅含谷氨酸和苹果酸，用于建立Δψ）和状态3（谷氨...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国国家科学基金会（NSF CHE-1229562，VDGM）以及伊隆大学教师研究与发展委员会（VDGM 和 GH）和本科生研究项目（AJ）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔黑色/光学底板赛默飞世尔科技265301未处理的黑色侧壁透明底板
ADPSigmaA2754稀释100倍 µ使用前立即用EB稀释M储备液。
BSA赛默飞世尔科技BP1600-100将蛋白检测试剂配制成2 mg/mL的水溶液作为储备液。
Dulbecco's 1x PBS (-/-)SigmaD8537确保 PBS 中不含 Mg2+ 或 Ca2+ 离子
EGTASigmaE3889
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
L-谷氨酸SigmaG1251
L-谷氨酸钾盐SigmaS372226
L-苹果酸SigmaM8304
L-苹果酸单钾盐Sigma49601
MitoXpress 氧消耗检测试剂盒安捷伦MX-200-4试剂盒包含探针原液和HS矿物油。
MOPSSigmaM3183
蛋白测定染料（5倍浓缩）BioRad500-0006可使用任何蛋白质检测方法替代。
R 版本 3.3 R Core Development Team 2016
Thermomax 微孔板读数仪、EnSpire 多模式微孔板读数仪及配套软件PerkinElmer标准荧光酶标仪
Trisma碱SigmaT6066可使用任何版本的Tris碱。

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

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线粒体功能耗氧率呼吸控制比分离线粒体细胞呼吸磷光探针ATP生成

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