基于酶标仪的荧光法评估线粒体耗氧量

摘要

评估氧气消耗可提供有关线粒体功能的综合信息。利用磷光探针结合荧光酶标仪，无需专用设备即可轻松获得准确且可重复的数据。该检测方法使任何实验室均可测量分离线粒体的氧气消耗，并计算呼吸控制比。

摘要

线粒体具有多种重要功能，包括细胞呼吸、ATP生成、调控细胞凋亡，以及作为代谢通路的核心枢纽。因此，通过实验评估线粒体功能可揭示不同群体或疾病状态之间的差异。此外，评估分离得到的线粒体是否处于足够健康的状态以用于后续实验也具有重要意义。在不同样本之间比较线粒体功能时，常采用的一个指标是氧气消耗速率。无论是对完整细胞还是从组织中分离的线粒体，测定其氧气消耗速率并进一步计算呼吸控制比，均可实现上述三个目的。本研究利用从刷尾蜥蜴肝脏中分离的线粒体，结合一种对溶液中氧气浓度变化敏感的磷光探针，通过荧光酶标仪测定氧气消耗速率。该方法不仅快速高效，而且所需线粒体量少，无需特殊设备。本文所述的逐步操作方案可提高线粒体功能评估技术在科研人员中的可及性。

引言

线粒体是存在于真核细胞中、大小约与细菌相当的细胞器。它们是一类独特的细胞器，因其含有自身的DNA，并具有外膜和内膜两层膜结构。线粒体的外膜与内膜之间为膜间隙，而内膜向内折叠形成称为嵴的结构，围绕着最内层的腔室，即基质。这些嵴增大了内膜的表面积，使得多个依赖嵴进行的过程能够同时发生。尽管线粒体参与多种细胞功能，例如调控细胞凋亡以及承载多种代谢通路，但其在ATP生成中的关键作用对细胞存活至关重要。事实上，细胞90%的能量来源于线粒体¹。ATP的生成涉及在外膜与内膜之间建立电化学梯度，这一电化学梯度被称为线粒体膜电位（Δψ），其产生机制是质子（H⁺）从基质被泵入膜间隙。ATP的生成最终通过还原当量的氧化过程实现，即电子在线粒体呼吸链（ETC）中的传递。该过程的最终电子受体是分子氧（O₂）。随着氧气的消耗，H⁺浓度差逐渐增大至最大值，此时H⁺离子顺着浓度梯度从膜间隙穿过ATP合酶复合体进入基质。H⁺离子的流动引起ATP合酶的构象改变，使ADP与无机磷酸靠近并反应生成ATP。最终，ATP从线粒体基质转运至胞质溶胶，可被储存或用于驱动各种生化反应，因其磷酸键水解时可释放大量自由能。整个过程称为氧化磷酸化；由于该过程消耗氧气，因此称线粒体具有呼吸作用²。

Δψ的建立及其强度、被还原的O₂量（称为耗氧量）以及ATP的生成均可作为细胞健康状况的指标。线粒体功能研究，例如Δψ、总ATP含量与生成量以及耗氧量的测定，既可通过传统的生化方法，也可通过基于微孔板的荧光和发光检测进行定量。例如，可使用特异性结合线粒体的荧光染料（如四甲基罗丹明乙酯）比较不同样品之间的线粒体膜电位。通过向反应体系中添加一种发光蛋白，其发光变化与ATP浓度相关，从而可监测ATP的生成。在氧化磷酸化（OXPHOS）过程中，对耗氧速率或绝对呼吸速率的定量有助于阐明线粒体功能和能量代谢差异的原因。耗氧量评估可用于计算呼吸控制比（RCR）。RCR值描述了线粒体响应ADP流入而生成ATP的能力，这正是线粒体的主要功能。RCR值反映了分离线粒体的整体状态，并可用于比较不同实验处理下的响应情况。RCR值的差异可能代表线粒体功能障碍，或提示从两个或多个不同来源分离的线粒体之间存在生物学差异。另一个评估分离线粒体功能的重要指标是线粒体效率，定义为每消耗1摩尔O₂所合成的ATP摩尔数，即P/O比值³。

鉴于通过测量线粒体参数所能获取的信息量及其在多种研究场景中的应用潜力，高效获取功能数据的能力在众多不同研究领域中均具有重要价值。数十年来，线粒体耗氧量的测量依赖于特定仪器——如使用克拉克电极（Clark electrode），但该方法受限于测量所需样本量较大；近年来也出现了可同时测定线粒体呼吸及其他多个参数的先进仪器，但其高昂成本限制了广泛应用。本实验方案采用一种经改进的替代方法，利用氧敏感型磷光探针（MitoXpress）^4,5，通过酶标仪在时间分辨荧光模式下对信号进行随时间连续检测。相较于荧光，磷光在吸收光子与发射光子之间具有更大的能量差，因此更适合对信号变化进行持续监测。该方法使得几乎所有实验室均可开展此类测量，而不仅限于专注于线粒体代谢或具备高精尖设备的研究团队。本研究采用的模型系统为三种树蜥的分离线粒体，包括两个亲本物种及一个基因渗入种（即含有一个亲本物种的核DNA和另一亲本物种的线粒体DNA——杂交种）。选择这些蜥蜴是因为我们假设：当杂交个体的核DNA与线粒体DNA来源不同时，可能引发代谢和能量层面的后果。本研究使用市售的检测试剂盒结合多功能酶标仪，有助于提升更多研究人员及科研领域对此类检测技术的可及性。

方案

蜥蜴通过 CO₂ 根据动物实验室福利办公室及艾隆大学机构动物护理与使用委员会指南中所述政策，实施窒息后立即断头处死。

1. 线粒体的分离⁶

注意：所有溶液和样品在这些步骤中均需保持低温（表1），并置于冰上。

1. 取出肝脏，称重，然后用约 3 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（1x, -/-）冲洗。
2. 用新的剃须刀片在 1 mL L-MIB 中将肝脏组织切碎。
3. 将组织与 L-MIB 的总体积调至 2 mL，使用 Dounce 匀浆器机械破碎肝细胞，匀浆 4 次。
4. 在 300 × g 条件下离心（37 °C，10 分钟）。
5. 将上清液转移至新离心管中，并置于冰上。
6. 将沉淀重悬于 2 mL L-MIB 中，再次匀浆，然后在 300 × g 条件下离心（37 °C，10 分钟）。
7. 合并两次离心所得的上清液，并在 10,000 × g 条件下离心（37 °C，10 分钟）。
8. 将沉淀重悬于约 0.350 mL L-MIB 中。
9. 测定总蛋白含量（线粒体毫克数/mL L-MIB），作为线粒体含量的估算依据^4,5,6。

2. 氧消耗

1. 将后续步骤中使用的所有溶液（表1）在水浴中预热至 30 °C。
2. 根据步骤 1.9 中的蛋白浓度测定结果，用 LEB 将线粒体稀释至 6 mg/mL。
3. 在无菌黑色壁透明底的 96 孔板（表2）中设置检测反应：
   1. 向相应的孔中加入 50 µL 样品（L-EB 缓冲液或线粒体样品）。
   2. 加入 50 µL 处理液（L-EB、谷氨酸/苹果酸，或含 ADP 的谷氨酸/苹果酸）。
   3. 将探针原液用 L-EB 按 1:10 稀释，然后向每孔加入 100 µL 荧光探针。
   4. 轻轻向每孔加入 50 µL 重质矿物油，以隔绝环境中的氧气。
4. 在 45 分钟内，每隔 1.5 分钟从底部读取一次荧光值，激发/发射波长为 380/650 nm。使用动力学模式，时间延迟设为 30,000 µs，检测窗口设为 100 µs。

3. 数据分析

1. 从酶标仪计算机导出原始数据文件为 .xls 文件。
2. 打开文件，将原始数据复制并粘贴到一个新工作表中，并适当地标注行和列。
3. 将仅含 L-EB 缓冲液的对照样品与含 L-EB + G/M 的样品以相对荧光单位（RFU）对时间作图。
   注：由于不存在线粒体，因此不应检测到氧气浓度的变化，这些曲线应相对平坦。
4. 将含 L-EB + G/M 的样品值以相对荧光单位（RFU）对时间作图。
5. 确定对照组数据读数何时趋于稳定并变得平坦。
   注：实验样品的数据分析应从此时间点开始（如图1A中箭头所示）。反应可能需要 10–15 分钟才能趋于平稳并达到最大值。
6. 新建一个图表，仅包含第 3.5 步确定的时间点之后的数据（称为“截断”数据），并添加最佳拟合直线，以直观展示待分析的原始数据。
7. 计算截断后仅含缓冲液的对照组数据的平均 RFU 值（以黄色高亮显示）。该值在后续氧气浓度计算中用作最小 RFU 值，即基线。
8. 氧气消耗速率的计算（µM O₂/min）
   1. 复制并粘贴第 3.6 步原始数据中的线性区域（即截断后的数据），用于确定在 G/M + ADP 处理下每个时间点线粒体样品中的氧气浓度^7,8,9,10。
   2. 使用公式（1）⁵ 计算每个时间点的氧气浓度。[O₂]_a 表示空气饱和缓冲液中的氧气浓度（在 30 °C 时为 235 mM）。I(t)、Ia 和 Io 分别表示在时间 t 时样品与探针的荧光信号（例如，样品 + G/M + ADP）、第 3.7 步计算得到的空气饱和缓冲液中探针的平均信号，以及脱氧缓冲液中的最大信号（设定为可达到的最大信号值）。
           （1）
   3. 将第 3.8.2 步计算得到的 [O₂]_t 值对时间作图，并添加线性趋势线及最佳拟合直线的方程。
      注：将每条直线的斜率用作氧气消耗速率。任何样品的重复实验（双复孔或三复孔）数据可合并后用于消耗速率的比较。
9. 通过将含 ADP 的线粒体呼吸速率（状态 3）除以不含 ADP 的呼吸速率（状态 2），计算呼吸控制比（RCR）。

结果

使用含有磷光氧传感探针的检测试剂盒和标准荧光酶标仪，测定了三种不同蜥蜴线粒体的耗氧率和线粒体呼吸控制比（RCR）。先前的研究表明，该试剂盒中的探针与耗氧量直接相关，其中分子氧会淬灭磷光信号，而随着线粒体呼吸导致氧气水平下降，荧光信号则相应增强^7,11。分别记录对照组和实验组样品随时间变化的相对荧光单位（RFU）值，并进行分析。将对照孔（仅缓冲液、缓冲液加谷氨酸/苹果酸、缓冲液加谷氨酸/苹果酸 + ADP）的RFU读数对时间作图，以确认实验孔中荧光变化确实由线粒体的存在引起。此外，谷氨酸/苹果酸 + ADP对照组可用于确定数据采集期间的基线氧含量。含有分离线粒体的实验样品也与对照组一同绘制在同一图表上。

图1A 显示，来自分离线粒体样品的相对荧光单位（RFU）随时间逐渐增加，而对照组的RFU值则相对平稳。由于反应需要时间达到平衡，因此从数据集中剔除了前约10个读数，直至对照样品的读数不再出现明显波动并趋于平稳（补充表S1 和 补充图S1）。接下来，将经谷氨酸/苹果酸 + ADP处理的线粒体样品的剩余数值，利用公式（1）（见实验方案步骤3.2）转换为每个时间点的氧浓度，然后对时间作图。图1B 展示了 图1A 中实验样品的结果（叉号标记），其 R² 值非常接近1，且可计算出直线的斜率。该直线斜率为负，因为随着氧气被消耗，样品中的总氧浓度逐渐降低。对同一来源的线粒体样品在仅添加谷氨酸/苹果酸而不加ADP的条件下重复上述过程，以获得相应的氧消耗速率（补充表S2 和 补充图S2）。随后，分别代表状态3和状态2的有ADP与无ADP条件下的线粒体呼吸数据可用于计算每种样品类型的呼吸控制比（RCR）（补充图S2）。当并列比较时，三种不同类型树蜥的平均RCR结果显示，携带渗入型线粒体的杂交个体其RCR显著低于任一亲本类型（图1C）。杂交蜥蜴的线粒体氧消耗速率介于两个亲本类型之间（图2）。

图 1：氧气消耗检测示例结果。 （A）仅含缓冲液的对照反应以及含有经谷氨酸和苹果酸（G/M）处理的分离线粒体的反应的原始数据，部分反应额外添加了ADP。随时间监测荧光信号。随着氧气被消耗，荧光信号增强。仅含缓冲液的反应（G/M，以圆圈表示；G/M + ADP，以三角形表示）以及经G/M处理的线粒体（以方块表示）未显示变化。经G/M + ADP处理的线粒体（以加号表示）消耗了氧气。（B）根据（A）中G/M + ADP处理的线粒体原始数据计算得到的氧浓度随时间的变化。（C）在室温下测得的三种不同蜥蜴来源线粒体的RCR值。本图引自Haenel和Del Gaizo Moore¹²。统计分析使用R语言中的ANOVA进行。缩写：G = 谷氨酸；M = 苹果酸；RCR = 呼吸控制比。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：三种蜥蜴来源的线粒体耗氧速率。 箱形图中，中位数以横条表示，均值以圆点表示。Urosaurus graciosus 和 Urosaurus ornatus 两种亲本类型之间耗氧速率存在显著差异。渐渗型（杂交型）的耗氧速率介于两种亲本类型之间，且与任一亲本类型均无显著差异。本图引自 Haenel 和 Del Gaizo Moore¹²。缩写：Ug = Urosaurus graciosus；Uo = Urosaurus ornatus。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：本实验方案中所用溶液的组成。 请点击此处下载该表格。

表2：氧气消耗测定的孔板布局。 每个样本至少预留6个孔（3个对照孔：仅L-EB、L-EB加G/M处理、L-EB加G/M和ADP处理；3个实验孔/样本：线粒体分别接受L-EB处理、L-EB加G/M处理、L-EB加G/M和ADP处理）。条件允许时，每个实验样本应设置重复或三复孔。缩写：G = 谷氨酸；M = 苹果酸；L-EB = 针对蜥蜴的特异性实验缓冲液。请点击此处下载该表格。

补充图 S1：数据图。（A）所有原始数据的对比图，用于样本与对照组的比较。（B）来自补充表 S1中高亮列的边缘化原始数据图，显示只有含有线粒体样本的孔位出现了明显的RFU升高。请点击此处下载该文件。

补充图S2：氧气消耗量与呼吸控制比 (A氧气消耗数据图 补充表 S1 通过拟合最佳直线方程来确定状态2和状态3的数值。B) 使用直线斜率计算 RCR 比值 (A), 代表状态2和状态3。 请点击此处下载此文件。

补充表 S1：原始数据的代表性示例。 标亮的列是用于图表绘制和计算的数据（即，经修剪后的数据）。请点击此处下载该文件。

补充表 S2：修剪后数据及后续耗氧量计算的代表性示例。 请点击此处下载该文件。

讨论

在比较不同样本时，测量线粒体功能具有重要意义，例如比较疾病状态与非疾病状态、同一动物的不同组织类型，或不同类型的样本之间。我们采用后一种比较方式来验证我们的假设，即线粒体发生基因渗入的杂交树蜥存在代谢后果。实验上评估线粒体功能的方法多种多样，包括测定膜电位（Δψ）、总ATP含量、ATP生成量、呼吸控制以及耗氧速率。分离线粒体的耗氧量测量可通过专用设备完成，例如克拉克电极或更先进的Seahorse XFe分析仪。然而，这些方法可能受限于实验所需样本量，或因成本过高而难以实施。能够检测荧光的多功能酶标仪已成为细胞生物学和生物化学实验室的标准设备。因此，一种替代性的定量分析线粒体耗氧量的方法是使用市售试剂盒结合荧光酶标仪进行检测。本逐步操作方案详细描述了如何测量耗氧量并完成相关计算，且该方法经济高效，适用于分离的线粒体。精确测量线粒体在提供ADP条件下生成ATP的能力（称为状态3呼吸），可实现样本间氧化磷酸化（OXPHOS）能力的直接比较，其差异可反映功能上的差别。此外，状态3呼吸还可反映所分离线粒体的质量，从而判断分离流程是否成功，以及样本是否适用于其他检测。呼吸控制比（RCR）值通过状态2（仅含谷氨酸和苹果酸，用于建立Δψ）和状态3（谷氨酸和苹果酸加ADP，使Δψ用于ATP合成）的数据计算得出，为比较线粒体功能及评估其健康状况提供了另一重要信息。本文展示的数据表明，本研究所提出的方法有助于解析不同类型样本之间的差异，并可在无需高度专业化设备的情况下测量耗氧速率和RCR值，从而使此类测量更易于实现。

在本实验方案中，我们从蜥蜴中新鲜分离线粒体，并根据制造商的说明书以及Hynes等⁴和Will等⁵的改进方法，使用MitoXpress Xtra Hs试剂盒测定氧气消耗。蜥蜴的总体重范围为3.3 g至5.1 g，每只蜥蜴平均获得0.170 g肝组织，可制备约0.350 mL浓缩的粗线粒体。分离得到的线粒体以6 mg/mL蛋白浓度用于氧气消耗测定。如果根据步骤1.7测定的线粒体蛋白浓度较低，则可将样品在10,000 × g条件下再次离心，并将沉淀重悬于较小体积的L-MIB中。此外需注意，当肝组织样本较小或无法获取全部肝脏时，我们已成功使用低至4 mg/mL的蛋白浓度进行实验。

为确保实验开始时样品的气体和温度达到平衡，第2部分方案中使用的所有溶液均应在水浴中预先加热至30 °C。在第3部分方案中，各样品溶解氧的变化速率（mM/min）通过其溶解氧浓度下降曲线的初始斜率外推获得（方案步骤3.3；补充表S1和补充图S1）。样品+谷氨酸/苹果酸（G/M）处理组的速率代表线粒体呼吸状态2，而样品+谷氨酸/苹果酸+ADP（G/M + ADP）处理组的速率代表线粒体呼吸状态3。因此，各样本的呼吸控制比（RCR）通过将其状态3的数值除以状态2的数值计算得出（补充表S2）。

可在此处所示的不同样本之间比较耗氧量，也可在同一样本的不同处理之间进行比较。在后一种情况下，可能需要额外的对照，例如含或不含线粒体的仅载体对照，以排除化学处理本身与磷光探针发生相互作用的可能性。此外，所获得的耗氧量和呼吸控制比（RCR）数据可与其他检测方法从同一样本中获得的数据结合使用。一旦分离出线粒体，便可将其用于多种检测，以更全面地评估其功能¹²。膜电位（Δψ）、总ATP含量以及ATP转换速率的测定是已成功结合使用的部分检测方法。此外，在检测中联合使用电子传递链（ETC）、氧化磷酸化（OXPHOS）和ATP合酶抑制剂，可对不同类型的线粒体样本获得更全面的理解，从而增强基于实验数据所得结论的可靠性。

另一个可以在分离的线粒体中测量的参数是线粒体效率，其定义为每消耗1摩尔O₂所合成ATP的摩尔数，即P/O比值³。P/O比值可通过本实验方案的延伸步骤进行计算：先让处于State 3的线粒体耗尽反应体系中提供的ADP，随后加入一定量的ADP底物，再通过添加寡霉素（oligomycin）抑制ATP合酶活性。这些额外步骤可用于测定State 4呼吸状态。State 4发生在ATP合酶被抑制后，此时线粒体仍持续消耗氧气并维持较强的膜电位Δψ，该状态可提供有关线粒体质子漏（proton leak）的信息——即H⁺离子是否在未通过ATP合酶的情况下回流至基质，从而导致Δψ耗散，最终反映线粒体功能障碍。此外，State 4的测量还可揭示ADP/ATP转位酶的功能状态，该转运蛋白负责将新合成的ATP从基质中运出，同时将ADP底物运入；也可检测是否存在ADP和ATP跨膜泄漏的现象。加入寡霉素（可抑制ATP合酶）是一种对照手段，用于判断线粒体质子漏是否由真正的功能障碍引起。尽管在本研究中，我们并未测量State 4以计算P/O比值，因为该数据不在三种线粒体样本类型比较所需信息的范围之内，但这一参数仍是评估线粒体功能的重要指标，可作为本实验方案的拓展内容加以实施。最后值得指出的是，线粒体可从培养细胞以及小鼠或大鼠的不同组织（如肝脏、心脏、脊髓等）中分离获得。根据具体组织类型，可能需要对MIB和EB缓冲液的配方以及分离流程进行相应调整^{4,13,14,15,16}。此外，根据试剂盒说明书，该检测也可直接用于完整的全细胞。因此，本文所述方法不仅限于蜥蜴或肝脏线粒体，适用于多种科学子领域中的广泛实验模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔黑色/光学底板	赛默飞世尔科技	265301	未处理的黑色侧壁透明底板
ADP	Sigma	A2754	稀释100倍 µ使用前立即用EB稀释M储备液。
BSA	赛默飞世尔科技	BP1600-100	将蛋白检测试剂配制成2 mg/mL的水溶液作为储备液。
Dulbecco's 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	确保 PBS 中不含 Mg2+ 或 Ca2+ 离子
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-谷氨酸	Sigma	G1251
L-谷氨酸钾盐	Sigma	S372226
L-苹果酸	Sigma	M8304
L-苹果酸单钾盐	Sigma	49601
MitoXpress 氧消耗检测试剂盒	安捷伦	MX-200-4	试剂盒包含探针原液和HS矿物油。
MOPS	Sigma	M3183
蛋白测定染料（5倍浓缩）	BioRad	500-0006	可使用任何蛋白质检测方法替代。
R 版本 3.3	R Core Development Team 2016
Thermomax 微孔板读数仪、EnSpire 多模式微孔板读数仪及配套软件	PerkinElmer		标准荧光酶标仪
Trisma碱	Sigma	T6066	可使用任何版本的Tris碱。