使用基于读板器的荧光测定法评估线粒体耗氧量

Summary

耗氧量评估提供有关线粒体功能的完整信息。使用带有荧光读板机的磷光探针，无需专用设备即可轻松获得准确且可重现的数据。该测定使任何实验室都能测量分离线粒体的耗氧量并计算呼吸控制比率。

Abstract

线粒体具有许多重要功能，包括细胞呼吸、ATP 产生、控制细胞凋亡以及作为代谢途径的中心枢纽。因此，通过实验评估线粒体功能可以深入了解不同人群或疾病状态之间的差异。此外，评估分离的线粒体是否足够健康以进行实验也很有价值。通常用于比较不同样本中线粒体功能的一个特征是耗氧率。耗氧量和随后计算完整细胞或从组织中分离的线粒体中的呼吸控制比率可以用于所有三个目的。使用从刷蜥肝脏中分离的线粒体与对溶液氧浓度波动敏感的磷光探针，我们使用荧光读板器测量了耗氧量。这种方法不仅快速有效，而且可以用少量线粒体进行，并且不需要专门的设备。此处描述的分步协议增加了研究人员对线粒体功能评估的可及性。

Introduction

线粒体是在真核细胞中发现的细胞器，大小与细菌差不多。它们是独特的细胞器，因为它们含有 DNA 并有两层膜，一层外膜和内膜。线粒体的外膜和内膜由膜间隙隔开，内膜折叠成围绕最内层隔室（称为基质）的嵴结构。这些嵴增加了内膜的表面积，因此使用嵴的多个过程可以同时发生。虽然线粒体参与许多细胞功能，例如控制细胞凋亡和容纳多种代谢途径，但它们在 ATP 产生中的重要作用对于细胞存活至关重要。事实上，细胞 90% 的能量来自线粒体¹。ATP 的产生涉及跨外膜和内膜的电化学差异，称为线粒体膜电位 （Δψ），当 H⁺ 离子从基质泵入膜间空间时产生。ATP 的产生最终是通过电子通过线粒体呼吸链 （ETC） 的电子运动来氧化还原当量的。最后一个电子受体是分子氧 （O₂）。随着氧气的消耗，H⁺ 浓度差会累积到最大值，此时 H⁺ 离子通过通过 ATP 合酶复合物从膜间空间向下移动到基质。H⁺ 离子的运动导致 ATP 合酶的构象变化，ADP 与无机磷酸盐靠近反应并生成 ATP。最后，ATP 从线粒体基质转移到胞质溶胶中，由于其磷酸盐水解过程中释放的大量自由能，可以储存或用于促进反应。这整个过程称为氧化磷酸化，由于消耗了氧气，因此据说线粒体会呼吸²。

Δψ 的积累和强度、O₂ 减少的量（称为耗氧量）以及 ATP 的产生都可以用作细胞健康的指标。线粒体功能研究，例如 Δψ、总 ATP 含量和产生以及耗氧量的测量，可以通过传统的生化方法或基于板的测定中的荧光和发光来量化。例如，可以使用荧光染料（如与线粒体特异性结合的四甲基罗丹明乙酯）比较不同样品之间的线粒体膜电位。可以通过向反应中添加发光蛋白来监测 ATP 的生成，其变化与 ATP 浓度相关。在 OXPHOS 期间量化耗氧率或绝对呼吸率有助于阐明线粒体功能和能量代谢差异的原因。耗氧量评估可用于计算呼吸控制比率 （RCR）。RCR 值描述了线粒体响应 ADP 流入而制造 ATP 的能力，ADP 是线粒体的主要功能。RCR 值表示分离线粒体的整体状况，并允许比较对不同实验治疗的反应。RCR 值的差异可能代表线粒体功能障碍或表明从两个或多个来源分离的不同线粒体之间存在生物学差异。分离线粒体中另一个重要的功能指标是线粒体效率，定义为每摩尔 O 合成的 ATP 摩尔数₂，或 P/O 比³。

鉴于可以通过测量线粒体参数收集的信息量以及可以利用这些信息的各种实例，有效收集功能数据的能力在许多不同的研究领域都很有用。几十年来，线粒体耗氧量测量一直使用非常特殊的仪器进行——使用 Clark 电极，这可能会受到进行测量所需的样本量的限制，最近，可以测量线粒体呼吸和多个其他参数但成本高昂的复杂仪器。该方案是一种使用氧敏感磷光探针 （MitoXpress） 的适应性替代方法^4,5。使用读板器在时间分辨荧光模式下检测探针信号，以便随时间进行连续测量。与荧光相比，磷光在吸收和发射的光子之间具有更大的能量差，因此更适合连续监测信号的变化。这使得几乎任何实验室都可以进行这些测量，而不仅仅是那些专注于线粒体代谢或能够负担得起高度专业化设备的实验室。我们使用的模型系统是从三只树蜥蜴中分离的线粒体，两种亲本物种和一种渗入物种（包含来自一个亲本物种的核 DNA 和来自另一个亲本物种的线粒体——杂交种）。选择这些蜥蜴是因为我们假设具有不同核和线粒体 DNA 来源的杂交种会产生代谢和能量后果。我们使用了带有多功能读板器的市售检测试剂盒，可以增加更多研究人员和研究领域对此类检测的访问。

Protocol

蜥蜴被 CO₂ 窒息安乐死，然后根据动物实验室福利办公室和 Elon 机构动物护理和使用委员会指南概述的政策立即斩首。

1. 线粒体的分离⁶

注意:在这些步骤中，保持所有溶液低温（表 1）并将样品置于冰上。

1. 取出肝脏，称重，然后用 ~3 mL 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （1x， -/-） 冲洗。
2. 用新鲜的剃须刀片在 1 mL L-MIB 中将肝脏切碎。
3. 将组织加 L-MIB 的总体积调至 2 mL，并使用 Dounce 匀浆器机械破坏肝细胞四次。
4. 将匀浆在 300 × g （37 °C，10 分钟）下旋转。
5. 将上清液转移到新管中，并将其置于冰上。
6. 将沉淀重悬于 2 mL L-MIB 中，重新匀浆，然后在 300 × g （37 °C，10 分钟）下再次离心。
7. 合并来自两个离心的上清液，并以 10,000 × g （37 °C，10 分钟）离心。
8. 将沉淀重悬于 ~0.350 mL 的 L-MIB 中。
9. 确定总蛋白的量（mg 线粒体/mL L-MIB）用作线粒体含量 ^4,5,6 的近似值。

2. 耗氧量

1. 将以下步骤中使用的所有溶液（表 1）在水浴中预热至 30 °C。
2. 根据步骤 1.9 中蛋白质浓度测定的结果，将 LEB 中的线粒体稀释至 6 mg/mL。
3. 在无菌的 96 孔黑壁透明底板中设置测定（表 2）。
   1. 将 50 μL 样品（L-EB 缓冲液或线粒体样品）添加到适当的孔中。
   2. 添加 50 μL 处理液（L-EB、谷氨酸/苹果酸或谷氨酸/苹果酸 w/ADP）。
   3. 在 L-EB 中以 1:10 的比例稀释探针储备液，然后向每个孔中加入 100 μL 荧光探针。
   4. 向每个孔中轻轻添加 50 μL 重矿物油以排除环境氧气。
4. 每 1.5 分钟以 380/650 nm 激发/发射从板底部读取荧光测量值，持续 45 分钟。使用时间延迟为 30,000 μs、测量窗口为 100 μs 的动力学模式。

3. 数据分析

1. 将 Plate Reader 计算机的原始数据文件导出为 .xls 文件。
2. 打开文件，然后将原始数据复制并粘贴到新选项卡中，并相应地标记行和列。
3. 将仅 L-EB 缓冲液绘制到对照样品和 L-EB + G/M 作为相对荧光单位 （RFU） 与时间的关系。
   注意:这些线应该是相对平坦的，因为不存在线粒体，因此，不应检测到氧浓度的变化。
4. 将 L-EB + G/M 样本值绘制为 RFU 与时间的关系。
5. 确定读数在哪些地方变得更加一致，并为控件变平。
   注意:这是实验样品数据分析应该开始的地方（ 在图 1A 中用箭头标记）。反应可能需要 10-15 分钟才能趋于平缓并达到最大值。
6. 制作一个仅包含步骤 3.5 中建立的时间点之后的数据（称为"修剪"数据）的新图，并添加最适合的线以可视化要分析的原始数据。
7. 计算修剪的仅控制缓冲区数据的平均 RFU 值（以黄色突出显示）。该值用作最小 RFU 值，作为下面氧气计算中的基线。
8. 耗氧率的计算 （μM O₂/min）
   1. 复制并粘贴步骤 3.6 中原始数据的线性区域（即修剪后的数据），以确定每个时间点 ^7,8,9,10 中 G/M + ADP 处理中线粒体样品中的氧浓度。
   2. 使用等式 （1）⁵ 确定每个时间点的氧浓度。[注₂]_a 是空气饱和缓冲液中的氧浓度（30 °C 时为 235 mM）。I（t）、Ia 和 Io 分别是样品 + 探针在时间 t 的荧光信号（例如，样品 + G/M + ADP）、步骤 3.7 中计算的探针在空气饱和缓冲液中的平均信号，以及脱氧缓冲液中的最大信号（设置为可实现的最大信号）。
      （1）
   3. 绘制步骤 3.8.2 中计算的 [O₂]_t 值与时间的关系图，并添加一条线性趋势线以及最佳拟合线的方程。
      注意: 使用每条线的斜率作为耗氧率。任何样品的重复或三重复都可以汇总并用于比较消耗率。
9. 通过将有和没有 ADP 的线粒体呼吸除以分别代表状态 3 和 2 来计算 RCR。

Results

使用带有磷光氧传感探针和标准荧光读板器的检测试剂盒，从三种不同蜥蜴的线粒体中测定耗氧率和线粒体 RCR。先前的研究确定，该试剂盒中的探针与耗氧量直接相关，其中磷光被分子氧淬灭，并且荧光信号随着线粒体呼吸引起的氧水平降低而增加 ^7,11。随着时间的推移，记录对照和实验样品的 RFU 值，然后进行分析。对照孔（仅缓冲液、用谷氨酸/苹果酸处理的缓冲液和用谷氨酸/苹果酸 + ADP 处理的缓冲液）的 RFU 读数随时间作图，以确定实验样品孔中荧光的任何变化都是由于线粒体的存在。此外，谷氨酸/苹果酸 + ADP 对照允许在数据收集期间获得基线氧气量。含有分离线粒体的实验样品也绘制在与对照相同的图表上。

图 1A 表明，与对照相对平坦的 RFU 值相反，分离线粒体样本的 RFU 随时间增加。由于反应需要时间来平衡，因此从数据集中删除前 10 个左右的读数，直到对照样品读数没有那么嘈杂且趋于平稳（补充表 S1 和 补充图 S1）。接下来，使用等式 （1） 将用谷氨酸/苹果酸 + ADP 处理的线粒体样品的剩余值转化为每个时间点的氧气浓度（参见方案步骤 3.2），然后绘制与时间的关系图。 图 1B 显示了 图 1A （交叉）中所示实验样品的结果，其中 R² 值非常接近 1，并且可以计算出线的斜率。线的斜率为负，因为随着氧气的消耗，该样品中的总氧浓度会降低。对于用不含 ADP 的谷氨酸/苹果酸处理的相同线粒体样品，重复相同的过程以获得耗氧率（补充表 S2 和 补充图 S2）。然后，分别代表状态 3 和 2 的有和没有 ADP 的线粒体呼吸可用于计算每种样品类型的 RCR（补充图 S2）。当并排比较时，三种不同类型的树蜥蜴的平均 RCR 表明，具有渗入线粒体的杂交种的 RCR 显着低于任何一种亲本类型的 RCR（图 1C）。杂交蜥蜴线粒体的耗氧率介于两种亲本类型中（图 2）。

图 1:耗氧量测定结果示例。 （A） 来自仅缓冲液对照反应和反应的原始数据，包括用谷氨酸和苹果酸 （G/M） 处理的分离线粒体，添加或不添加 ADP。随着时间的推移监测荧光。随着氧气的消耗，荧光增加。仅缓冲液反应 （G/M，用圆圈表示，G/M + ADP，用三角形表示） 和经过 G/M 处理的线粒体 （用方块表示） 显示没有变化。用 G/M + ADP（用加号表示）处理的线粒体消耗氧气。（B） 根据 A 中所示的 G/M + ADP 处理的线粒体的原始数据计算的氧浓度随时间的变化。（C） 在室温下测量的三种不同类型蜥蜴的线粒体的 RCR 值。这个数字复制自 Haenel 和 Del Gaizo Moore¹²。使用 R 中的方差分析进行统计分析。缩写:G = 谷氨酸;M = 苹果酸;RCR = 呼吸控制比。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:三种蜥蜴的线粒体耗氧率。箱线图以条形表示耗氧量中位数，以点表示均值。亲本类型，Urosaurus graciosus 和 Urosaurus ornatus，彼此之间有显著差异。渗入形式 （Hybrid） 介于亲本类型中，与任何一种类型都没有显着差异。这个数字复制自 Haenel 和 Del Gaizo Moore¹²。缩写: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus。请点击这里查看此图的较大版本。

表 1:协议中使用的溶液组成。请点击此处下载此表格。

表 2:用于耗氧量测定的板图。 对于每个样品，至少留出 6 个孔（3 个对照孔:仅 L-EB，G/M 处理的 L-EB，G/M + ADP 处理的 L-EB;3 个实验孔/样品:L-EB 处理的线粒体，L-EB + G/M 和 L-EB G/M +ADP 处理）。如果可能，请一式两份或一式三份运行每个实验样品。缩写:G = 谷氨酸;M = 苹果酸;L-EB = 蜥蜴特异性实验缓冲液。 请点击此处下载此表格。

补充图 S1:数据图。 （A） 绘制所有原始数据以比较样品和对照。（B） 补充表 S1 中突出显示列的镶边原始数据图，表明只有包含线粒体样品的孔的 RFU 明显增加。 请点击此处下载此文件。

补充图 S2:耗氧量和呼吸控制比率。 （A） 来自补充表 S1 的耗氧量数据图，通过查找最佳拟合线的方程来确定状态 2 和状态 3 值。（二）使用 （A） 中代表状态 2 和状态 3 的线的斜率计算 RCR 比率。请点击此处下载此文件。

补充表 S1:原始数据的代表性示例。 突出显示的列是用于数字和计算的数据 （即修剪后的数据）。 请点击此处下载此文件。

补充表 S2:修整数据和后续耗氧量计算的代表性示例。请点击此处下载此文件。

Discussion

在比较不同的样本时，测量线粒体功能很有用，例如疾病与非疾病状态、同一动物的不同组织类型或不同样本类型之间的比较。我们使用后面的比较来检验我们的假设，即渗入线粒体的杂交树蜥蜴有代谢后果。有多种方法可以通过实验确定线粒体功能，包括 Δψ、总 ATP 含量、ATP 产生以及呼吸控制和耗氧率的定量。分离线粒体的耗氧量测量可以使用专用设备进行，例如 Clark 电极或更复杂的 Seahorse XF。然而，这些方法可能受到进行测量所需的样本量的限制，或者成本高昂。可以读取荧光的多功能读板机已成为细胞生物学和生物化学实验室的标准设备。因此，定量分析线粒体耗氧量的另一种方法是使用带有荧光读板器的市售试剂盒。本分步协议描述了如何测量耗氧量以及进行计算。在经济上属于孤立的线粒体。精确测量线粒体在提供 ADP（称为状态 3 呼吸）时制造 ATP 的能力，可以直接比较样品之间的 OXPHOS，差异可以表示功能差异。此外，状态 3 呼吸还表明分离的线粒体的质量，这可以确定分离程序是否有效和/或样品是否足够好，可用于其他检测。RCR 值是使用状态 2（仅谷氨酸和苹果酸，以构建 Δψ）和状态 3 值（谷氨酸和苹果酸加 ADP，以允许 Δψ 用于 ATP 产生）计算的，提供了另一条信息用于比较和关于分离的线粒体的健康状况。提供的数据表明，本文提供的方法可以帮助破译不同样品类型之间的差异，并测量耗氧率和 RCR 值，而无需高度专业化的设备，从而使这些类型的测量更容易获得。

在该方案中，我们从蜥蜴中新鲜分离出线粒体，并按照制造商的方案使用 MitoXpress Xtra Hs 测定法测定耗氧量，并根据 Hynes 等^{人4 和} Will 等人 5 进行修改蜥蜴的总体质量为 3.3 克至 5.1 克，平均肝组织/蜥蜴为 0.170 克， 产生了 ~0.350 mL 的浓缩粗线粒体。分离的线粒体用于 6 mg/mL 蛋白质的耗氧量测定。如果在方案步骤 1.7 中确定的线粒体蛋白浓度较低，则可以以 10,000 × g 的速度重新旋转样品，并将沉淀重悬于较小体积的 L-MIB 中。还应注意的是，我们已经成功地将低至 4 mg/mL 的样品用于小规模肝脏样品或无法获得整个肝脏的情况。

为确保在测定开始时样品的气体和温度平衡，方案第 2 部分中使用的所有溶液应在水浴中预热至 30 °C。在方案第 3 节中，溶解氧的变化率 （mM/min） 是从每个样品的氧浓度下降曲线的初始斜率推断出来的（方案步骤 3.3; 补充表 S1 和 补充图 S1）。样本 + G/M 处理率代表状态 2 线粒体呼吸，而样本具有 G/M + ADP 处理率代表状态 3 线粒体呼吸。因此，通过将状态 3 值除以每个样本的状态 2 值来计算每个样本的 RCR（补充表 S2）。

可以比较不同样品之间的耗氧量，如此处所示，也可以比较一个样品中的不同处理。在后一种情况下，可能需要额外的控制，例如有和没有线粒体的仅载体控制，以排除化学处理本身不与磷光探针相互作用的可能性。此外，收集的耗氧量和 RCR 数据可以与从相同样品中收集的数据与其他检测结合使用。一旦分离出线粒体，它们就可以用于多种分析，以更全面地了解其功能¹²。Δψ、总 ATP 含量和 ATP 周转率的测量是一些已组合的测定。此外，在检测中使用 ETC、OXPHOS 和 ATP 合酶抑制剂可以更全面地了解不同的线粒体样品类型，从而加强从生成的数据中得出的任何结论。

可以在分离的线粒体中测量的另一个参数是线粒体效率，其定义为每摩尔 O₂³ 合成的 ATP 摩尔数的 P/O 比。在该方案的扩展中，可以通过允许状态 3 线粒体耗尽反应中提供的 ADP，然后添加等分试样的 ADP 底物，然后通过添加寡霉素来抑制 ATP 合酶，从而计算 P/O 比率。这些额外的步骤允许计算状态 4，当线粒体继续消耗氧气并保持强 Δψ 以产生最大的 ATP 时，就会发生这种情况，提供有关线粒体泄漏的信息（如果 H⁺ 离子在不使用 ATP 合酶的情况下穿越回基质，因此消散 Δψ），最终表明线粒体功能障碍。此外，状态 4 测量还可以揭示 ADP/ATP 转运体（从基质中移动新形成的 ATP，同时将 ADP 底物带入）是否有效，以及 ADP 和 ATP 是否发生跨膜泄漏。添加抑制 ATP 合酶的寡霉素是确定线粒体是否由于实际功能障碍而渗漏的对照。虽然测量状态 4 以便计算 P/O 比率超出了我们寻求在三种线粒体样本类型之间进行比较的信息范围，但它是关于线粒体功能的另一条数据，可以作为该协议的扩展来完成。最后，值得注意的是，线粒体可以从培养细胞和小鼠或大鼠的不同组织（例如肝脏、心脏、脊髓）等中分离出来。可能需要调整 MIB 和 EB 配方以及分离方案 4,13,14,15,16。此外，根据制造商的说明，可以使用完整的完整细胞进行该检测。因此，所提出的方法不仅限于蜥蜴或肝脏线粒体，使其适用于许多不同科学子学科的广泛实验模型。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisher	96 孔黑色/光学底板	265301	未经处理的黑色壁板，底部透明。
ADP	Sigma	A2754	稀释 100 &微量;M 原液，含 EB。
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	在水中制备 2 mg/mL 储备液用于蛋白质测定。
Dulbeccos 1x PBS （-/-）	Sigma	D8537	PBS 不含 Mg2+ 或 Ca2+ 离子。
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-谷氨酸	Sigma	G1251
L-谷氨酸钾盐		Sigma S372226
L-苹果酸	Sigma	M8304
L-苹果酸单钾盐	Sigma	49601
MitoXpress 耗氧量套件	Agilent	MX-200-4	试剂盒包含探针原料和 HS 矿物油。
MOPS	Sigma	M3183
Protien 检测染料 （5x）	BioRad	500-0006	任何蛋白质检测都可以替代。
R 版本 3.3	R Core 开发团队 2016
Thermomax 微孔板检测仪 EnSpire 多功能酶标仪和软件	PerkinElmer		标准荧光酶标仪
Trisma 底座	Sigma	T6066	可以使用任何版本的 Tris 底座。