本方案详细介绍了在新生小鼠中进行鞘内注射以实现基因编辑和药物递送的逐步操作步骤。
本文内容
摘要
摘要
鞘内注射是一种在儿科和成人临床实践中常用的给药方法，可有效递送药物和治疗制剂。通过将药物直接注入中枢神经系统的脑脊液中，该方法能够在靶部位实现较高的药物浓度，同时与静脉、皮下或肌肉注射等其他给药途径相比，减少全身性不良反应。鞘内注射的重要性不仅限于临床应用，在针对啮齿类动物及其他大型动物（包括非人灵长类）神经遗传性疾病治疗的临床前研究中也发挥着关键作用。然而，尽管该技术应用广泛，但在幼龄动物尤其是新生幼崽中实施鞘内注射仍面临显著的技术挑战，主要因其体型微小且身体脆弱。在新生小鼠中成功且可靠地实施鞘内注射需要极为细致的操作，并充分考虑多种影响因素。因此，亟需建立一套标准化操作规程，不仅提供具体操作步骤，还需强调关键的技术要点和良好的实验室操作规范，以确保操作的一致性以及实验动物的安全与福利。
为解决这一尚未满足的需求，本文提供了一种针对出生后第1天（P1）新生幼鼠进行鞘内注射的详细且全面的操作方案。通过遵循逐步说明，研究人员可自信地在新生幼鼠中实施鞘内注射，从而实现药物、反义寡核苷酸以及用于基因替代或基于基因组编辑治疗的病毒的精确递送。此外，本文强调了遵循良好实验室规范的重要性，以保障动物福利并确保实验结果的可靠性。该方案旨在解决新生小鼠鞘内注射相关的技术难题，最终推动神经遗传学研究领域的发展，助力潜在治疗干预手段的开发。
引言
鞘内注射（IT注射）是一种常见的临床操作，用于在儿科和成人患者中给药、采集脑脊液以及维持颅内压1,2给药 通过 鞘内注射是一种有效提高中枢神经系统（CNS）药物浓度同时最小化全身暴露的方法。因此，该方法可增强治疗效果并减少不良反应，尤其适用于对温度敏感且半衰期较短的药物。3.
在使用啮齿类动物模型进行新药和治疗方法的临床前研究中，必须采用一种可靠的给药方法，以提高精确性和结果的可重复性4,5。对于评估神经遗传性和神经发育障碍新疗法的临床前研究而言，早期治疗在初步概念验证研究中至关重要，因为通常预测早期干预将产生更有利的治疗效果6,7,8。
与传统的脑室内（ICV）注射相比，鞘内（IT）注射具有显著更低的风险，因为它避免了直接穿刺大脑皮层的需要。这一优势大大减少了对局部皮层组织及周围神经造成损伤的可能性。此外，IT注射可通过单次给药实现至少五倍以上的药物注射体积增加，显著提高了重复给药的可行性。然而，由于新生小鼠体型微小且身体脆弱，对新生幼鼠进行鞘内注射在技术上具有较高难度，需要特殊的操作技术、专用设备以及精细的操作手法。
本文提供了一项详细的实验方案，包含对出生后第1天（P1）新生幼鼠进行鞘内注射的逐步操作说明。文中强调了关键注意事项和良好的实验室操作规范，以确保给药过程的一致性，以及实验动物在操作期间的安全与福利。通过遵循本方案，研究人员能够以更高的精确性和可重复性自信地开展实验，同时将对动物可能造成的风险或不适降至最低。
方案
所述操作程序和方案均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的要求。此外，这些操作程序已获得耶鲁大学医学院动物护理与使用委员会的批准。本研究使用了新生的野生型（WT）C57BL/6J雄性和雌性小鼠，动物来自商业来源（见材料表）。
1. 实验区域的准备
- 首先准备以下物品：用于低温麻醉的湿冰、用于将仔鼠与母鼠分离的空鼠笼、解剖显微镜、光源、放置动物进行注射的洁净操作台、棉签、加热垫、25/10 µL 注射器以及 34 G/ 0.375"/ 12 DEG 针头（见材料表）。
注意：使用湿冰对新生小鼠进行低温麻醉是一个可选步骤，旨在便于操作、减少仔鼠活动并尽量降低动物可能的不适。该低温麻醉步骤还可能有助于降低颅内压，减少与体积相关的并发症9,10。 - 在操作过程中，将仔鼠转移至远离母鼠的另一个鼠笼中。
- 称量每只仔鼠的体重并记录数据。
- 使用纱布和乙醇擦拭小鼠背部。利用解剖显微镜确认椎间隙，或至少确认脊髓管的中线位置（在出生后第1天的仔鼠中，该位置应呈红色）（见补充视频1）。
2. 注射步骤
- 为麻醉一只幼鼠，将其轻轻放置在冰浴中的防水屏障上（如乳胶套或铝箔），持续 3-5 分钟。需注意避免让动物在冰上停留过长时间，否则可能导致低体温相关并发症的风险，包括心室纤维性颤动、组织缺氧和代谢性酸中毒。
注意：3-5 分钟的时长可根据具体情况有所调整。应通过评估麻醉体征（例如对脚趾夹捏无反应）来确定合适的麻醉时间。 - 在动物处于冰浴期间，用注射器吸取 10 µL 药物制剂、病毒悬液或对照用人工脊髓液等。
注意：在学习阶段，可考虑将相同体积的 1% 快绿染料与递送材料混合后注射（见材料表）。这有助于观察注射过程，辅助学习并优化操作技术。注射了快绿染料或其他类似物质的幼鼠应在注射后根据批准的方案迅速实施安乐死，因为这些物质可能在动物体内引发炎症反应或其他不良反应。 - 当动物已完全麻醉（通过身体活动减少或消失确认）后，将其轻柔地置于显微镜下。
- 用左手的食指和拇指仔细触诊位于双侧骨盆带之间的中线椎间隙（补充视频 1）。可轻轻旋转尾部基部以帮助识别脊柱中线。
- 注射前将针尖斜面朝向动物头部。
- 小心插入针头，在凹陷交界处以 70°–80° 的轻微倾斜角度进针，同时确保注射器保持在正中矢状面内。当针尖接触骨骼时，逐渐将角度减小至约 30°，然后将针头向前推进约 2 mm 进入椎间隙。
注意：若针头能够轻微抬起整个身体，提示已成功进入硬膜内腔。 - 在 50–60 秒内缓慢注射最多 10 µL 的液体。注射完成后保持针头留置 10–20 秒。拔针时轻轻旋转针头以防止液体泄漏。
注意：拔针前小脑将呈现绿色。此外，缓慢推注至关重要，可防止递送过程中颅内压升高，并最大限度减少潜在并发症。根据我们对 500 多只幼鼠注射的经验，在 50–60 秒内递送 10 µL 体积为最佳方案。
3. 注射后处理
- 如果注射部位有液体渗漏或出血，应用棉签按压止住。
注意：大多数情况下不应出现渗漏或出血。根据我们的经验，有微量渗漏或出血的仔鼠仍可继续使用，但在数据分析时可能需要考虑减少药物或处理的剂量。 - 将仔鼠放置于加热垫上，使其充分恢复并回暖10–15分钟。在将其放回母鼠笼盒前，需仔细观察，确保仔鼠意识清醒且能主动活动。小鼠充分恢复的表现包括皮肤恢复粉红色、自发性身体活动增加，以及对触碰有反应。
- 将仔鼠放回原笼盒，并确保其被垫料、筑巢材料或两者共同覆盖。这可确保仔鼠能够获得母鼠提供的必要护理。
- 注射后至少连续三天每日评估仔鼠的一般外观和活动情况。若出现病态表现或活动减少，可能提示存在感染、治疗相关副作用或其他并发症等情况。必要时，请咨询兽医护理人员。
结果
成功的鞘内注射立即导致注射溶液在体内广泛分布，尽管实际的细胞摄取程度取决于所递送药物和材料的性质。在本研究中，我们使用快绿（Fast Green）来可视化野生型新生小鼠鞘内注射（IT）后的即时效果（图1A-K），并与传统的脑室注射（ICV）进行比较（图1L-N）。此外，通过递送基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统激活YFP报告小鼠，我们还检测了注射后10天的长期结果7。与未接受CRISPR/Cas9处理的小鼠相比，YFP表达在整只小鼠大脑中广泛分布（图2），在更高倍镜下观察到大多数细胞中均有YFP表达。本研究共对500多只新生小鼠进行了注射操作，超过98%的注射小鼠成功存活。未观察到对处理后小鼠长期存活及健康产生有害影响（补充图1）。
图 1：快绿染料在小鼠脑内的时序与空间分布。（A）鞘内注射后5分钟，注射组与未注射组小鼠的整体观察。（B）解剖前小鼠脑内快绿染料分布的可视化。（C-E）鞘内给药后5分钟，解剖脑组织中染料的分布。（F-H）鞘内给药后30分钟，解剖脑组织中染料的分布。（I-K）鞘内给药后60分钟，解剖脑组织中染料的分布。（L-N）作为对照，脑室内给药后40分钟，解剖脑组织中染料的分布。比例尺：1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：鞘内给予CRISPR/Cas9基因编辑的长期效应。 小鼠脑内鞘内注射CRISPR/Cas9基因编辑系统后，YFP报告基因广泛表达：小脑（A-F）、后部皮层（D-F）和前额叶皮层（G-I）。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图 1：鞘内 CRISPR 基因编辑后 Angelman 综合征小鼠的生存曲线。 该生存曲线显示了通过鞘内给药接受 CRISPR 基因编辑的 Angelman 综合征小鼠的存活结果，并与未治疗小鼠及野生型小鼠进行了比较。请点击此处下载该文件。
补充视频 1：新生小鼠鞘内注射操作。 本视频演示了对新生小鼠进行鞘内注射的操作过程。请点击此处下载该视频。
讨论
本文介绍了一种对新生小鼠（P1）进行鞘内注射的逐步操作流程，可实现药物在其脑内的广泛分布。与常用的向新生小鼠脑内给药的脑室内注射方法相比，后者需穿刺大脑皮层11，而鞘内注射避免了针头穿刺对新生小鼠脑组织造成的直接损伤。由于侵入性极小，鞘内注射可根据需要重复进行，从而在临床前研究中模拟人类临床环境下的多次给药过程12。
颅内压的变化通常与鞘内注射相关13，可能会导致母鼠因幼鼠行为改变而拒绝哺育。然而，尚未观察到注射后幼鼠出现急性行为变化或存活率降低的情况。同样，成年动物中也未发现与鞘内注射相关的异常或不寻常行为（数据未显示）。
一些技术要点可能有助于实验成功，值得强调。较慢的注射速度可能是一个重要因素。此外，在注射前使用低温麻醉可能降低颅内压，减少鞘内注射过程中的回流及其他并发症。最后，注射位点的精准性也可能影响实验成功率。
为了达到最佳效果 通过 鞘内给药，幼崽出生后应尽快进行该操作。所给予的药物及其他物质 通过 鞘内注射进入蛛网膜下腔，即包绕脑和脊髓的脑膜中蛛网膜与软脑膜之间的腔隙。因此，给药的药物可直接递送至该区域 通过 经鞘内注射穿过脑膜的这些层次12在啮齿类动物中，与人类相似，脑膜由三层组成：硬脑膜、蛛网膜和软脑膜14这些膜在胚胎发育期间形成，并在出生后第2天（P2）完全成熟15因此，建议采用快速基因分型方案，在数小时内即对仔鼠进行实验分组，尤其是在涉及动物基因型的实验中（如基因编辑实验）。仔鼠接受注射的时间越早，实验效果越好。通常应在出生后3小时内完成注射。这一时间窗口允许注射药物随脑脊液流入脑实质，此时室管膜层尚未成熟，药物颗粒大小对其影响较小。需要注意人类与小鼠之间的发育差异：出生第1天（P1）的小鼠相当于人类大脑发育的晚期妊娠阶段。16P1期新生小鼠实验的结果可作为重要的概念验证依据，但在转化研究设计中将这些结果外推至人类时应谨慎对待。
该技术受限于给药时间窗口较窄，且要求操作人员具备高超的实验技能。如果操作者缺乏经验，实验过程可能导致较高的死亡率。然而，由于时间窗口狭窄，要求在实验内部及不同实验之间具备更高的精确性和可重复性。此外，通过充分练习，该方法的操作熟练度和成功率可显著提高。
如果注射操作正确，注射后仔鼠的存活主要受母鼠护理情况的影响。建议为实验目标准备寄养母鼠配对。若在注射当天下午，目标仔鼠腹部未出现乳斑，则应立即将其转移至寄养母鼠处。雌性小鼠通过气味识别自己的幼崽，因此在操作过程中及操作后，必须避免将实验人员或无关母鼠的陌生气味带入仔鼠。然而，是否使用寄养母鼠应根据具体实验情况进行评估。建议在通风良好的房间内进行操作，最好在生物安全柜中进行。将仔鼠与母鼠的垫料及排泄物混合也有助于提高接受度。在完成术后初次检查后，建议至少3天内尽量减少对母鼠的干扰，以降低其应激反应。与任何外科操作一样，应考虑术后感染的风险，因此在注射过程中必须严格遵守无菌操作的优良实验室规范。需要注意的是，鞘内压力高于外部环境，可提供天然的抗感染保护。经验表明，注射后感染的发生率极低。但建议在注射后至少3天内每日监测仔鼠的一般外观和活动情况，以及时发现感染或其他并发症的迹象。在特殊情况下，可考虑咨询兽医服务，而非直接对出现严重并发症的仔鼠实施安乐死。
披露
YHJ 是 Couragene 的联合创始人，但本项目不存在利益冲突。
致谢
XNL 得到安格曼综合征治疗基金会（FAST）博士后奖学金的支持。YHJ 还得到 FAST 以及美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01HD110195 和 R01MH117289 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 平衡 | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| 数码显微镜 | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| 快绿 | Sigma | F7252-5G | |
| 加热垫 | 真实世界数据 | 69020 | |
| 针头 | Hamilton | 6PK (34/0.375)”/4/12DEG)S | |
| 注射器 | Hamilton | 1702RN | |
| 注射器滤器 | Sigma | SLGVM33RS |
参考文献
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077(2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863(2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680(2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
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