本方案描述了一种在含有2i和LIF培养基的培养条件下对小鼠胚胎干细胞进行反向多转染的方法。与传统的正向转染方案相比，该方法具有更高的细胞存活率和转染效率，同时能够实现质粒比例的一锅法优化。
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摘要
摘要
由于其相对简单且易于操作，核酸瞬时转染哺乳动物细胞系已成为生物医学研究中的常用技术。尽管大多数广泛使用的细胞系在贴壁的二维培养条件下已有成熟的转染方案，但这些方案通常难以适用于研究较少的细胞系，或具有非典型、难转染形态的细胞系。本方法以在2i/LIF培养基中培养的小鼠多能干细胞（再生医学中广泛使用的培养模型）为例，介绍了一种优化的快速反向转染方案，可实现更高的转染效率。利用该方案，可进行三质粒多重转染，借助高于常规的质粒递送效率，研究更宽范围的质粒化学计量比。这种反向多重转染方案提供了一种“单管式”实验方法，使用户能够在单个孔中优化质粒比例，而无需进行多个共转染实验。通过促进快速探索DNA化学计量比对递送遗传回路整体功能的影响，该方案显著减少了胚胎干细胞转染所需的时间和成本。
引言
将DNA和RNA递送至哺乳动物细胞是生物医学研究的核心支柱之一1。将外源核酸（NA）导入哺乳动物细胞的常用方法是瞬时转染2,3。该技术依赖于将核酸与市售的转染试剂混合，利用这些试剂将核酸递送至受体细胞内。通常采用正向转染方式递送核酸，即贴附在二维表面的细胞接受转染复合物。尽管针对最常见的已建立细胞系，正向转染效果稳定且已有大量公开发表的实验方案，但形态非单层结构的特殊细胞类型难以有效转染，限制了可递送的核酸量以及成功摄取核酸的细胞数量。
多能干细胞（PSCs）因其能够无限增殖并分化为任何体细胞类型，成为研究发育机制和再生医学的理想模型。对于小鼠多能干细胞（mPSCs），常规 体外 含两种抑制剂和LIF的培养条件 (2i/LIF) 维持类似穹顶的集落形态，直接限制暴露于正向转染的细胞数量4,5,6为解决这一问题，可采用反向转染法：将细胞加入含有培养基和转染试剂的培养皿中，而不是将转染试剂添加到已贴壁的细胞上。7虽....
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方案
1. mPSC 培养试剂的制备
- 配制 N2 添加剂。
- 在非无菌条件下，在化学安全通风橱中配制以下储存液（步骤 1.1.1.1）。将每种化学试剂的固体粉末加入已预先称重的 50 mL 锥形管中。加入粉末后再次称量各管，并加入适量溶剂以达到以下浓度。为配制一批培养基，至少准备下表所列最小体积。
注意：以下试剂具有危险性，应根据当地化学品安全指南进行操作。操作时需穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内处理这些化学品的固体粉末形式，以防止吸入。- 至少 0.05 mL 浓度为 0.518 mg/mL 的亚硒酸钠水溶液、0.5 mL 浓度为 160 mg/mL 的腐胺水溶液、0.165 mL 浓度为 0.6 mg/mL 的孕酮 100% 乙醇溶液（参见材料表）。
- 将上述溶液于 -20 °C 保存，最长可保存 2 年。
- 在生物安全柜（BSC）中，向 58.035 mL DMEM-F12 培养基中加入以下成分：
- 0.05 mL 浓度为 0.518 mg/mL 的亚硒酸钠溶液、0.5 mL 浓度为 160 mg/mL 的腐胺溶液、0.165 mL 浓度为 0.6 mg/mL 的孕酮溶液。
- 使用 0.22 µm 滤器对上述混合液进行过滤除菌。
- 在非无菌条件下，在化学安全通风橱中配制以下储存液（步骤 1.1.1.1）。将每种化学试剂的固体粉末加入已预先称重的 50 mL 锥形管中。加入粉末后再次称量各管，并加入适量溶剂以达到以下浓度。为配制一批培养基，至少准备下表所列最小体积。
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结果
正向转染和反向转染均依赖于细胞膜与外源转染试剂-DNA复合物之间的相互作用，从而将核酸递送至受体细胞。这两种技术的区别在于递送时细胞的状态——在传统的正向转染中，DNA通常被递送至贴壁生长的单层细胞，而反向转染则是让试剂-DNA复合物在细胞处于单细胞悬液状态时与其相遇。当细胞不能形成均匀、平坦的单层，而是呈现更隆起或集落样形态（如小鼠多能干细胞mPSCs）时，这种差异可能尤为关键。此外，还可采用对传统转染方法的其他改进，例如使用多转染（poly-transfection）替代共转染（co-transfection）。该改进可改变特定处理中每种DNA组分的相对分布，使研究人员能够快速探究表型与质粒剂量之间的关系。在进行此类实验时，对流式细胞仪本身进行标准化和质量控制也至关重要。以下部分实验的荧光单位已根据既定方案13，归一化至荧光微球标准，以实现不同实验日期间的准确比较（补充图1）。细胞设门如图所示进行人工设定（补充图2）。
鉴于mPSCs的克隆形态，传统的正向转染方法.......
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讨论
转染方案被广泛采用的一个关键原因是其可重复性和易操作性；然而，这些方案仍需根据不同实验条件进行优化。上述内容未提及的是，在首次尝试转染新的细胞系时，必须进行标准测试。首先，转染试剂的选择至关重要，因为市售的转染试剂并非适用于所有细胞类型，其在不同细胞中传递核酸（NA）的效率和细胞存活率存在差异。此外，还需通过实验确定核酸量和转染试剂的最佳用量及其最优比例。通常情况下，按照转染试剂供应商推荐的优化步骤进行操作，即可确定核酸和转染试剂的理想用量。
当某个转染实验失败时，首先应考虑所用试剂的适用性：需评估核酸是否经过验证并测序，细胞在转染前是否处于最佳的活力状态，转染试剂是否经过批次测试或与更适用于特定细胞类型的试剂进行过比较。通常情况下，一个关键的对照是使用在已验证启动子调控下表达GFP的载体，因为启动子常具有细胞类型特异性，在不同细胞系中的活性强度各不相同14。除操作技术误差外，一旦特定的转染方案和核酸已优化完成，实验结果出现较大差异通常可追溯至某一试剂本身存在的问题。
尽管多转染.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨向因篇幅限制未能在本文中引用的众多领域内贡献者，以及为本研究提供资助的机构表示感谢。 本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）的经费支持。K.M. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的硕士研究生奖学金（CGS-M）以及不列颠哥伦比亚大学凯拉姆博士奖学金。N.S. 获得了加拿大不列颠哥伦比亚省迈克尔·史密斯健康研究学者奖（Michael Smith Health Research BC Scholar Award）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| 转铁蛋白（无铁） | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 添加剂 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| β-巯基乙醇 | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| BSA 第 V 组分（7.5%） | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| 流式细胞术标准化微球 | Spherotech | URCP-38-2K | |
| 明胶 | MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX 添加剂 | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| 胰岛素 | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | 转染试剂 |
| Neurobasal 培养基 | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| 孕酮 | MilliporeSigma | P8783 | 化学品危险品——请查阅当地安全指南，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内操作固态粉末 |
| 腐胺 | MilliporeSigma | P6780 | 化学品危险品——请查阅当地安全指南，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内操作固态粉末 |
| 重组小鼠白血病抑制因子（mLIF） | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| 亚硒酸钠 | MilliporeSigma | S5261-25G | 化学品危险品——请查阅当地安全指南，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内操作固态粉末 |
| 胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
参考文献
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....
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