方法文章

一种优化的小鼠胚胎干细胞反向多转染技术用于快速探索核酸比例

DOI：

10.3791/65766

⸱

2023年12月8日

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种在含有2i和LIF培养基的培养条件下对小鼠胚胎干细胞进行反向多转染的方法。与传统的正向转染方案相比，该方法具有更高的细胞存活率和转染效率，同时能够实现质粒比例的一锅法优化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于其相对简单且易于操作，核酸瞬时转染哺乳动物细胞系已成为生物医学研究中的常用技术。尽管大多数广泛使用的细胞系在贴壁的二维培养条件下已有成熟的转染方案，但这些方案通常难以适用于研究较少的细胞系，或具有非典型、难转染形态的细胞系。本方法以在2i/LIF培养基中培养的小鼠多能干细胞（再生医学中广泛使用的培养模型）为例，介绍了一种优化的快速反向转染方案，可实现更高的转染效率。利用该方案，可进行三质粒多重转染，借助高于常规的质粒递送效率，研究更宽范围的质粒化学计量比。这种反向多重转染方案提供了一种“单管式”实验方法，使用户能够在单个孔中优化质粒比例，而无需进行多个共转染实验。通过促进快速探索DNA化学计量比对递送遗传回路整体功能的影响，该方案显著减少了胚胎干细胞转染所需的时间和成本。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将DNA和RNA递送至哺乳动物细胞是生物医学研究的核心支柱之一1。将外源核酸（NA）导入哺乳动物细胞的常用方法是瞬时转染2,3。该技术依赖于将核酸与市售的转染试剂混合，利用这些试剂将核酸递送至受体细胞内。通常采用正向转染方式递送核酸，即贴附在二维表面的细胞接受转染复合物。尽管针对最常见的已建立细胞系，正向转染效果稳定且已有大量公开发表的实验方案，但形态非单层结构的特殊细胞类型难以有效转染，限制了可递送的核酸量以及成功摄取核酸的细胞数量。

多能干细胞（PSCs）因其能够无限增殖并分化为任何体细胞类型，成为研究发育机制和再生医学的理想模型。对于小鼠多能干细胞（mPSCs），常规 体外 含两种抑制剂和LIF的培养条件 (2i/LIF) 维持类似穹顶的集落形态，直接限制暴露于正向转染的细胞数量4,5,6为解决这一问题，可采用反向转染法：将细胞加入含有培养基和转染试剂的培养皿中，而不是将转染试剂添加到已贴壁的细胞上。7虽然这会增加暴露于试剂的细胞数量，但也要求细胞在传代的同时进行转染。

在超越简单的单核酸（NA）转染后，研究人员通常希望在体外将多个核酸构建体共同导入细胞群体中。in vitro。这通常通过共转染实现，即将不同核酸按特定比例（如1:1、9:1等）混合后，再与选定的转染试剂结合8。由此形成的核酸与试剂混合物保持了核酸之间的原始比例——尽管处理组中的细胞可能接收到不同量的该混合物，但所有细胞接收到的核酸比例相同9。当目标组分比例已知时，这种方法具有优势；但预先确定最佳比例往往耗时耗力，因为每个比例都构成一个独立的实验条件。一种替代方案是进行"多转染"，即各个核酸分别独立地与转染试剂混合9。通过将含有单一核酸的转染复合物进行组合（而非在形成复合物前先混合核酸），研究人员可在一次转染实验中探索广泛的核酸化学计量关系9。当多个核酸产物预期会相互作用时，该方法尤其有价值，例如在可诱导的转录系统或具有反馈机制的系统中1,10,11。然而，要有效实现多转染，需要较高的转染效率。事实上，随着转染的独特核酸种类数量增加，单个细胞同时获得所有目标核酸的概率呈指数级下降9, 12。

以下报告描述了一种利用阳离子脂质转染试剂对mPSCs进行反向转染的实验方案，其中细胞与试剂-核酸混合物的接触时间最长为5分钟，以最大限度地提高细胞存活率，并减少细胞处于常规培养条件之外的时间。将该方案与这些细胞的标准正向转染方法相比较，结果显示反向转染具有更高的转染效率以及更多存活的转染细胞总数。通过将此反向转染方法与包含简单荧光报告基因的三质粒多质粒共转染相结合，展示了在高转染效率下筛选核酸比例的更广泛应用潜力。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mPSC 培养试剂的制备

  1. 配制 N2 添加剂。
    1. 在非无菌条件下，在化学安全通风橱中配制以下储存液（步骤 1.1.1.1）。将每种化学试剂的固体粉末加入已预先称重的 50 mL 锥形管中。加入粉末后再次称量各管，并加入适量溶剂以达到以下浓度。为配制一批培养基，至少准备下表所列最小体积。
      注意：以下试剂具有危险性，应根据当地化学品安全指南进行操作。操作时需穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内处理这些化学品的固体粉末形式，以防止吸入。
      1. 至少 0.05 mL 浓度为 0.518 mg/mL 的亚硒酸钠水溶液、0.5 mL 浓度为 160 mg/mL 的腐胺水溶液、0.165 mL 浓度为 0.6 mg/mL 的孕酮 100% 乙醇溶液（参见材料表）。
      2. 将上述溶液于 -20 °C 保存，最长可保存 2 年。
    2. 在生物安全柜（BSC）中，向 58.035 mL DMEM-F12 培养基中加入以下成分：
      1. 0.05 mL 浓度为 0.518 mg/mL 的亚硒酸钠溶液、0.5 mL 浓度为 160 mg/mL 的腐胺溶液、0.165 mL 浓度为 0.6 mg/mL 的孕酮溶液。
      2. 使用 0.22 µm 滤器对上述混合液进行过滤除菌。
    3. 仍在生物安全柜（BSC）中，配制 100 mg/mL 的去铁转铁蛋白溶液。
      1. 向 500 mg 去铁转铁蛋白中加入 5 mL DMEM-F12（参见材料表）。缓慢重悬并冲洗容器，避免产生气泡。
      2. 重悬后尽可能用 5 mL 溶液转移完全，然后将其加入硒酸盐/腐胺/孕酮混合液中。再取部分前述溶液冲洗去铁转铁蛋白瓶，尽可能回收残留物。
    4. 向该溶液中加入 5 mL 7.5% BSA 第五组分（参见材料表）。
    5. 充分混匀后，按每管 6.875 mL 分装。分装后于 -80 °C 保存，最长可保存 1 年。
    6. 使用上述 N2 分装液配制 N2B27 培养基时，取出所需分装液解冻，并向 6.875 mL N2 中加入 3.125 mL 浓度为 4 mg/mL 的胰岛素溶液（参见材料表），得到 10 mL 的 100 倍浓缩 N2 溶液。
  2. 配制 N2B27 基础培养基。
    1. 将 N2 和 B27 添加剂在 4 °C 冰箱中放置数小时或过夜解冻。
    2. 在生物安全柜（BSC）中，将 484.5 mL DMEM-F12 与 484.5 mL Neurobasal 培养基（参见材料表）混合于一个无菌的 1 L 瓶中。
    3. 向培养基中加入 10 mL B27 添加剂和 10 mL N2 添加剂。
    4. 加入 1 mL 55 mM β-巯基乙醇（参见材料表），再加入 10 mL 100 倍浓缩 GlutaMAX。通过轻轻旋转瓶子剧烈混匀。
    5. 按所需体积分装（通常为每份 100 mL），于 -80 °C 保存，最长可保存 1 年。解冻后若需使用，可于 4 °C 保存最多 3 周。
  3. 配制 NBiL 培养基。
    1. 将一份 100 mL 的 N2B27 基础培养基从 -80 °C 取出，在 4 °C 冰箱中解冻。
    2. 在生物安全柜（BSC）中，加入白血病抑制因子（LIF）（参见材料表），使其终浓度为 10 µg/L。
    3. 加入 CHIR99021（终浓度 3 µM）和 PD0325901（终浓度 1 µM）（参见材料表）。使用 50 mL 移液管充分混匀。于 4 °C 保存，最长可保存 2 周。
  4. 配制 0.2% 明胶溶液。
    1. 将 500 mL 双蒸水（H2O）转移至 1 L 玻璃瓶中。
    2. 称取 1 g 明胶（参见材料表）加入水中。通过摇动瓶子混合，直至大部分溶解。
    3. 在 15 psi、121 °C 条件下高压灭菌 35 分钟。冷却后，在生物安全柜（BSC）中使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。于 4 °C 保存。
  5. 配制洗涤培养基。
    1. 在生物安全柜（BSC）中，每 10 mL DMEM-F12 中加入 160 µL 7.5% BSA。
    2. 按比例放大配制大量溶液以便后续使用（例如，向 500 mL DMEM-F12 中加入 8 mL 7.5% BSA）。于 4 °C 保存。

mPSC 多重转染试剂的制备

注意：以下数值适用于24孔板中的单个孔，可根据需要按比例放大或缩小。所有DNA/质粒的序列详见补充文件1。

  1. 计算每种处理所需的DNA溶液体积。
    1. 每个孔/条件准备500 ng DNA。
      1. 若转染单个质粒，且DNA溶液浓度为100 ng/µL，则准备一个含有5 µL DNA的离心管。
      2. 若同时转染两个质粒，每个质粒浓度均为100 ng/µL，则分别准备两个离心管，每管含2.5 µL DNA，对应各自质粒。
  2. 在生物安全柜中进行以下操作：针对每次500 ng DNA的转染处理（参见材料表），将25 µL OptiMEM分配至一个1.5 mL离心管中。
    1. 按比例相应调整——以上述示例为例，准备两个离心管，每管含250 ng DNA（2.5 µL）和12.5 µL OptiMEM。
  3. 将该处理所需体积的DNA加入离心管中的OptiMEM中。
  4. 对于每个含有500 ng DNA和OptiMEM的离心管，另配一个匹配的离心管，其中加入25 µL OptiMEM和1 µL阳离子脂质类转染试剂。
    1. 同样，这些数值必须按比例相应调整。以上述示例为例，准备两个离心管，每管含12.5 µL OptiMEM和0.5 µL转染试剂。
      ​注意：调整数值时，应依据所加入DNA的质量，而非该质量DNA所需的体积。含有转染试剂和DNA的反应体系可进行比例放大（例如，若需对5个孔转染相同DNA）。保持各试剂比例不变，但按需调整总体积（例如，1000 ng DNA : 50 µL OptiMEM : 2 µL转染试剂 : 50 µL OptiMEM）。

3. 转染前小鼠多能干细胞（mPSCs）的准备

注意：进行逆转染时，需在添加转染试剂前准备培养容器并直接传代mPSCs。进行正向转染时，应在转染前12-18小时对细胞进行传代和铺板，以使细胞有足够时间贴附于培养板上。

  1. 准备0.2%明胶包被的细胞培养容器。
    1. 规划转染所需的孔数（每个处理组/组使用24孔板中的一个孔）。
    2. 向24孔板中每个目标孔加入200 µL的0.2%明胶溶液。
    3. 轻轻摇晃培养板，使溶液均匀铺展，确保覆盖孔底的整个表面。
    4. 在室温下孵育至少15分钟，使孔板完成包被。
    5. 使用真空抽吸器小心地从各孔中移除残留的明胶溶液（倾斜培养板以确保完全去除液体，同时避免刮伤明胶层）。
    6. 向每个孔中加入0.5 mL NBiL培养基（见步骤1.3），并将培养板置于组织培养孵箱中预热。
  2. 传代mPSCs。
    1. 将30 mL洗涤培养基（见步骤1.5）分装至一个50 mL锥形管中。
    2. 吸除mESC组织培养皿中的旧培养基。
      ​注意：可采用多种吸除技术。无论选择何种方法，均需确保细胞不长时间暴露于干燥状态（最长约30秒）。
    3. 加入适量市售的细胞解离试剂（10 cm培养皿加1.5 mL，按比例调整，参见材料表）。
    4. 静置3–5分钟后，用P1000移液器反复吹打15–20次，以获得单细胞悬液。在显微镜下观察细胞，确认形成单细胞悬液。
    5. 将解离试剂中的细胞转移至含有洗涤培养基的50 mL离心管中。
    6. 在室温下以300 x g 离心5分钟。吸除洗涤培养基，确保管内无残留液体。
    7. 用少量洗涤培养基（约300 µL）重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，以确定细胞密度。

4. mPSCs 的逆转录转染

  1. 根据步骤2准备多转染试剂。
  2. 根据步骤3准备细胞培养容器并传代mPSCs。
  3. 将NBiL培养基每管200 µL分装至1.5 mL离心管中，每个处理组一管。
  4. 向DNA:OptiMEM混合物中加入26 µL的OptiMEM:转染试剂混合液，通过移液器快速吹打约10次充分混匀。室温孵育5分钟。
  5. 根据细胞密度，从300 µL细胞悬液中取适量体积的细胞加入200 µL NBiL管中，使每管含有25,000个细胞。
  6. Lipofectamine 2000（L2K，转染试剂）与DNA混合物室温孵育5分钟后，将其加入含细胞的1.5 mL离心管中，用移液器充分混匀。室温下继续孵育细胞5分钟。
  7. 室温下以300 x g 离心5分钟，吸除上清液，每管残留约50 µL。
  8. 用100 µL NBiL培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至培养板中，并将培养板放入培养箱。24小时后更换为新鲜的NBiL培养基。

5. mPSCs 的正向转染

  1. 转染前12-18小时，按照步骤3准备细胞培养容器并传代mPSCs。
  2. 根据细胞密度，从300 µL细胞混合液中转移所需体积，使每孔接种25,000个细胞。将培养板放入培养箱中。
  3. 转染前1小时，吸除所有孔中的培养基，并更换为0.5 mL NBiL培养基。将培养板放入培养箱中。
  4. 在转染时，按照步骤2配制mPSC多转染试剂。
  5. 将26 µL OptiMEM:转染试剂混合液加入DNA:OptiMEM混合液中。通过移液器快速剧烈吹打约10次使试剂充分混匀。室温孵育5分钟。
  6. 将混合液逐滴加入各孔中。将培养板放入培养箱中。24小时后更换培养基。

6. 流式细胞术

  1. 转染后48小时，吸去转染后的24孔板中的培养基。
  2. 向每孔加入200 µL胰蛋白酶，轻轻晃动混匀，并在37 °C孵育30秒。轻敲培养板侧壁，然后加入200 µL预冷的FACS缓冲液（含2% FBS的PBS）。
  3. 打开一个V型底96孔板并进行标记，从A1孔开始。用P200移液器吹打混匀转染板各孔中的内容物，使细胞充分解离成单细胞悬液，然后将每孔200 µL细胞悬液转移至96孔板对应的孔中。
  4. 向50 mL试剂储液槽中加入15 mL FACS缓冲液。将96孔板在室温下以300 × g离心5分钟。通过快速而平稳地将96孔板倒置在水槽中，弃去上清液。
  5. 使用多通道移液器将96孔板中的细胞沉淀重悬于试剂储液槽中的150 µL FACS缓冲液。重复步骤6.4–6.5两次。将96孔板置于装有冰块且避光的容器中。
  6. 通过流式细胞仪检测样品，获取荧光报告分子的细胞群体分布。
    1. 确保流式细胞仪的激光器和滤光片组合适用于即将进行的实验（例如，若无法激发或检测远红光谱，则不应使用红外荧光报告分子）。
    2. 额外加入标准荧光微球样品，以便在数据分析时进行MEFL单位转换。确保每个样品收集到足够数量的细胞，以满足适当的统计学分析要求9。
  7. 将流式细胞仪原始数据文件中的荧光信号单位进行转换，并使用多种方法之一进行数据分析，例如基于Python或MATLAB的分析流程，或商用软件9,13。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

正向转染和反向转染均依赖于细胞膜与外源转染试剂-DNA复合物之间的相互作用，从而将核酸递送至受体细胞。这两种技术的区别在于递送时细胞的状态——在传统的正向转染中，DNA通常被递送至贴壁生长的单层细胞，而反向转染则是让试剂-DNA复合物在细胞处于单细胞悬液状态时与其相遇。当细胞不能形成均匀、平坦的单层，而是呈现更隆起或集落样形态（如mPSCs）时，这一差异可能尤为关键。此外，还可采用对传统转染方法的其他改进，例如使用多转染（poly-transfection）替代共转染（co-transfection）。这种改进可改变特定处理中每种DNA组分的相对分布，使研究人员能够快速探究表型与质粒剂量之间的关系。在进行此类实验时，对流式细胞仪本身进行标准化和质量控制也至关重要。以下部分实验的荧光单位已根据既定方案13，归一化至荧光微球标准，以实现不同实验日期间的准确比较（补充图1）。细胞设门如图所示进行人工设定（补充图2）。

鉴于mPSCs的克隆形态，传统的正向转染方法会受到直接暴...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

转染方案被广泛采用的一个关键原因是其可重复性和易操作性；然而，这些方案仍需根据不同实验条件进行优化。上述内容未提及的是，在首次尝试转染新的细胞系时，必须进行标准测试。首先，转染试剂的选择至关重要，因为市售的转染试剂并非适用于所有细胞类型，其在不同细胞中传递核酸（NA）的效率和细胞存活率存在差异。此外，还需通过实验确定核酸量和转染试剂的最佳用量及其最优比例。通常情况下，按照转染试剂供应商推荐的优化步骤进行操作，即可确定核酸和转染试剂的理想用量。

当某个转染实验失败时，首先应考虑所用试剂的适用性：需评估核酸是否经过验证并测序，细胞在转染前是否处于最佳的活力状态，转染试剂是否经过批次测试或与更适用于特定细胞类型的试剂进行过比较。通常情况下，一个关键的对照是使用在已验证启动子调控下表达GFP的载体，因为启动子常具有细胞类型特异性，在不同细胞系中的活性强度各不相同14。除操作技术误差外，一旦特定的转染方案和核酸已优化完成，实验结果出现较大差异通常可追溯至某一试剂本身存在的问题。

尽管多转染...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者谨向因篇幅限制未能在本文中引用的众多领域内贡献者，以及为本研究提供资助的机构表示感谢。 本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）的经费支持。K.M. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的硕士研究生奖学金（CGS-M）以及不列颠哥伦比亚大学凯拉姆博士奖学金。N.S. 获得了加拿大不列颠哥伦比亚省迈克尔·史密斯健康研究学者奖（Michael Smith Health Research BC Scholar Award）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accutase MilliporeSigmaSCR005
转铁蛋白（无铁） MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 添加剂 ThermoFisher Scientific 17504044
β-巯基乙醇ThermoFisher Scientific 21985023
BSA 第 V 组分（7.5%）Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
流式细胞术标准化微球SpherotechURCP-38-2K
明胶 MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX 添加剂 ThermoFisher Scientific 35050061
胰岛素 Gibco12585-0014
Lipofectamine 2000 Invitrogen11668-019转染试剂
Neurobasal 培养基ThermoFisher Scientific 21103049
OptiMEM Invitrogen31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
孕酮MilliporeSigmaP8783化学品危险品——请查阅当地安全指南，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内操作固态粉末
腐胺MilliporeSigmaP6780化学品危险品——请查阅当地安全指南，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内操作固态粉末
重组小鼠白血病抑制因子（mLIF） BioTechne8878-LF-500/CF
亚硒酸钠 MilliporeSigmaS5261-25G化学品危险品——请查阅当地安全指南，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），且仅可在化学通风橱内操作固态粉末
胰蛋白酶-EDTAThermoFisher Scientific 25200056

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
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DNA Lipofectamine

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