一种基于小鼠胚胎干细胞的优化反向多转染技术，用于快速探索核酸比率

Summary

本方案描述了一种在用2i和LIF培养基培养过程中对小鼠胚胎干细胞进行反向多转染的方法。与传统的正向转染方案相比，该方法具有更高的活力和效率，同时还能够实现质粒比率的一锅优化。

Abstract

由于其相对简单和易用性，用核酸瞬时转染哺乳动物细胞系已成为生物医学研究的支柱。虽然大多数广泛使用的细胞系在贴壁二维培养物中具有可靠的转染方案，但这些方案通常不能很好地转化为研究较少的细胞系或具有非典型、难以转染形态的细胞系。该方法使用在2i/LIF培养基中生长的小鼠多能干细胞（一种广泛用于再生医学的培养模型），概述了一种优化的快速逆转录转染方案，能够实现更高的转染效率。利用该方案，进行三质粒多转染，利用质粒递送中高于正常效率的效率来研究范围更广的质粒化学计量。这种反向多转染方案允许采用一锅实验方法，使用户能够在单个孔中优化质粒比率，而不是在多个共转染中优化质粒比率。通过促进快速探索DNA化学计量对递送遗传回路整体功能的影响，该协议最大限度地减少了胚胎干细胞转染的时间和成本。

Introduction

将 DNA 和 RNA 递送至哺乳动物细胞是生物医学研究的核心支柱¹.将外源核酸 （NA） 引入哺乳动物细胞的常用方法是瞬时转染 ^2,3。该技术依赖于将 NA 与能够将其递送至受体细胞的市售转染试剂混合。通常，NA 通过正向转染递送，其中粘附在二维表面的细胞接受转染复合物。虽然对最常见的已建立细胞系进行正向转染是稳健的，并且实验方案已广泛发表，但更多具有非单层形态的利基细胞类型不容易转染，从而限制了可递送的 NA 量和接收它的细胞数量。

多能干细胞 （PSC） 是理解发育的有吸引力的模型，也是再生医学的工具，因为它们能够无限分裂并产生任何身体细胞类型。对于小鼠 PSC （mPSC），具有 2 种抑制剂和 LIF （2i/LIF） 的常规体外培养条件保持圆顶状集落形态，直接限制暴露于正向转染的细胞数量 ^4,5,6。为了解决这个问题，可以进行反向转染:将细胞加入含有培养基和转染试剂的培养皿中，而不是将转染试剂添加到贴壁细胞^{中 7}

Protocol

1. mPSC培养试剂的制备

1. 准备 N2 补充剂。
   1. 在非无菌条件下，在化学安全通风橱中制备以下储备溶液（步骤1.1.1.1）。将每种化学品的固体粉末加入预先称量的 50 mL 锥形管中。加入粉末后称量每管，加入适量溶剂，达到以下浓度。对于一批培养基，请准备列出的最小量。
      注意:以下试剂是危险的，应按照当地的化学品安全指南进行处理。处理时确保适当的个人防护装备，并且仅在化学通风橱中使用这些化学品的固体粉末形式，以防止吸入。
      1. 0.05 mL 亚硒酸钠在 0.518 mg/mL 的水溶液中，0.5 mL 腐胺在 160 mg/mL 的水溶液中，0.165 mL 黄体酮在 0.6 mg/mL 的 100% 乙醇溶液中（见 材料表）。
      2. 将溶液储存在-20°C长达2年。
   2. 在生物安全柜 （BSC） 中，将以下内容添加到 58.035 mL DMEM-F12 中。
      1. 0.05 mL 0.518 mg/mL 亚硒酸钠溶液、0.5 mL 160 mg/mL 腐胺溶液、0.165 mL 0.6 mg/mL 黄体酮溶液。
      2. 过滤器 用 0.22 μm 过滤器对上述混合物进行灭菌。
   3. 仍在 BSC 中，制备 100 mg/mL 脱脂转铁蛋白溶液。
      1. 将 5 mL DMEM-F....

Results

正向和反向转染都依赖于细胞膜与传入的转染试剂-DNA 复合物之间的相互作用，从而允许将 NA 递送至受体细胞。这些技术的不同之处在于细胞递送时的状态 - 在传统的正向转染中，DNA通常递送至贴壁细胞单层，而反向转染则依赖于试剂-DNA复合物在单细胞悬浮液中与细胞相遇。在细胞不以均匀、扁平的单层形式生长，而是采用更圆顶或菌落状形态的情况下，这种差异尤其重要，就像 mPSC 一样。可以采用传统转染的其他变体，例如进行多转染而不是共转染。这种修饰改变了给定治疗中每种DNA物种的相对分布，使研究人员能够快速探索表型与其质粒剂量之间的关系。在进行这些实验时，对细胞仪本身进行标准化和质量控制也很重要。根据既定方案¹³，以下几个实验的荧光单元已归一化为荧光珠标准品，以便跨实验日进行准确比较（补充图1）。如图所示，手动对细胞进行门控（补充图2）。

鉴于mPSC的集落形态，传统的正向转染方法将受到直接暴露于周围培养基的细胞数量的限制。与反向转染相比，正向转染的标记物阳性细胞比例显著降低.......

Discussion

转染方案被广泛采用的一个关键原因是其可重复性和可及性;然而，这些协议确实需要跨实验环境进行优化。上述未提及的是首次尝试转染新细胞系时所需的标准测试。首先，转染试剂的选择是关键，因为市售试剂不是万能的，而且不同细胞类型的NA递送活力效率会有所不同。此外，要找到NA和转染试剂的理想量及其最佳比例，还需要进行测试。通常遵循转染试剂供应商推荐的优化步骤就足以达到NA和转染试剂的理想量。

当给定的转染失败时，首先应考虑所用试剂的适用性:考虑 NA 是否经过验证和测序，细胞在转染前是否处于最佳存活状态，转染试剂是否经过批次测试或与其他细胞特异性试剂进行比较。通常，关键对照是在经过测试和验证的启动子的控制下包含表达 GFP 的载体，因为启动子通常具有细胞特异性，在不同的细胞系中具有不同的强度¹⁴。除了用户技术错误之外，一旦对给定的转染方案和NA进行了优化，实验结果的较大偏差通常可以追溯到给定试剂的问题。

虽然使用多转染可以进行传统共转染无法实现的几种类型的单罐实验，但它并不总是明确的最佳选择。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
载铁蛋白	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 补充剂	赛默飞世尔科技
β-巯基乙醇	ThermoFisher Scientific
BSA 组分 V （7.5%）	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
流式细胞术标准化微珠	Spherotech	URCP-38-2K
明胶	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX 添加剂	赛默飞世尔科技
胰岛素	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	转染试剂
Neurobasal 培养基	ThermoFisher Scientific
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
黄体酮	MilliporeSigma	P8783	化学危害 - 查阅当地安全指南，确保佩戴适当的 PPE，并仅在化学通风橱中使用固体粉末形式
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	化学危害 - 查阅当地安全指南，确保穿着适当的 PPE，并且仅在化学通风橱
中使用固体粉末形式重组 mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
亚硒酸钠	MilliporeSigma	S5261-25G	化学危害 - 查阅当地安全指南，确保穿着适当的个人防护装备，并且仅在化学通风橱中处理固体粉末
胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher Scientific