本方案重点介绍通过酶消化法从牙髓中分离、培养和保存多能干细胞的方法。此外，还展示了这些细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能，强调了操作过程中精确性和一致性的关键作用。
本文内容
摘要
摘要
在再生医学与治疗应用领域，干细胞研究正迅速获得广泛关注。牙髓干细胞（DPSCs）存在于乳牙和恒牙中，因其易于获取、良好的适应性以及内在的分化能力，已成为重要的干细胞来源。DPSCs 提供了丰富且易得的间充质干细胞储备，展现出卓越的多能性与应用潜力，尤其在组织再生方面表现突出。尽管前景广阔，但其主要挑战在于如何高效地分离和鉴定 DPSCs，因为它们仅占牙髓细胞中的极小比例。同时，对这一宝贵细胞资源的妥善保存也至关重要。目前 DPSCs 分离的两种主要方法为酶消化法（ED）和组织外植块迁移法（OG），后者常被称为自发性生长法。本实验方案主要聚焦于酶消化法分离 DPSCs，详细阐述了从牙齿提取、实验室处理至细胞保存的完整操作步骤。除了提取与保存之外，本方案还深入探讨了 DPSCs 的分化能力。具体而言，文中描述了诱导这些干细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的实验流程，充分展示了其多向分化潜能。随后通过比色染色技术对分化结果进行准确的可视化观察与确认，从而验证所分离 DPSCs 的质量与功能特性。该综合性实验方案涵盖了牙髓干细胞提取、培养、保存及鉴定的全过程，为相关研究提供了系统性操作蓝图。本方案突显了 DPSCs 所蕴含的重大潜力，推动干细胞领域的深入探索，为未来再生医学与临床治疗的突破带来希望。
引言
由于干细胞在再生医学和组织工程中具有广阔的应用前景，干细胞研究在生物医学科学领域蓬勃发展。牙髓干细胞（DPSCs）来源于人类乳牙和恒牙的牙髓组织，因其易于获取和具有多向分化潜能而受到广泛关注1,2。大量研究已证实，这些细胞可分化为多种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞3。
近几十年来，干细胞的研究和治疗应用迅速增长。干细胞的巨大潜力要求拓展其来源渠道。多种因素会影响所选细胞的效率、存活率和干性。尽管目前已知的干细胞来源包括骨髓和脂肪组织等，但这些来源常因侵入性操作、取材部位的并发症以及伦理问题而限制了其广泛应用4,5。在众多干细胞来源中，牙源性干细胞因其易于获取、具有高度可塑性及广泛的应用前景而受到关注。其中，人牙髓干细胞尤其因其治疗潜力而被广泛研究6。牙齿通常作为医疗废弃物被丢弃，但实际上含有丰富的间充质干细胞7。保护这一宝贵的干细胞资源需要患者、牙科医生和临床医生的共同努力，以确保这些资源不被浪费，使每一例牙髓干细胞都能用于未来的再生医学需求。
牙髓来源的干细胞，例如成人牙髓干细胞（DPSCs）和脱落乳牙牙髓干细胞（SHED），位于牙髓的血管周围微环境。这些细胞被认为起源于颅神经嵴细胞，并表现出间充质干细胞（MSCs）和神经外胚层干细胞的早期标志物。DPSCs和SHED已显示出多向分化潜能以及再生多种组织类型的能力8。
牙源性干细胞的潜在来源包括健康的乳牙和恒牙。干细胞仅占牙髓总细胞群的约1%，这凸显了有效分离和扩增技术的重要性9。因此，这些干细胞的提取与扩增是牙髓干细胞（DPSC）分离过程中的关键步骤10。拔除或脱落的牙齿需保存在富含营养的运输培养基中，例如磷酸盐缓冲液（PBS）或亨克氏平衡盐溶液（HBSS）。
获取牙髓的方法因牙齿类型的不同而有所差异7,11对于牙根已吸收的乳牙，可进行拔除 通过 根尖。类似地，可使用无菌带刺根管锉从根尖孔未闭合的恒牙中获取牙髓组织。对于根部已完全发育的恒牙，需通过分离牙冠与牙根来进入牙髓腔。该操作可通过使用金刚砂片在釉质牙骨质交界处切割牙齿完成。此切口可暴露牙髓腔，从而便于获取牙髓组织12,13,14.
牙髓干细胞（DPSCs）可通过酶消化法（ED）或组织外植块迁移法（OG）分离获得，后者也称为自发性生长法。ED 方法主要使用胶原酶 I 和分散酶等酶类，将组织消化为单细胞悬液15,16。OG 方法操作更简单快捷，其步骤包括将牙髓组织切成小片段后直接接种于培养板中，使细胞从外植块中迁移生长出来17。研究人员已对这两种方法进行了应用与比较，以评估细胞增殖速率、分离所得干细胞特性的维持情况、分化潜能以及表面标志物的表达水平18。建立并标准化高效获取具有强干性牙髓干细胞的实验方案，将有助于推动安全有效的治疗策略发展19。本实验方案涵盖通过酶消化法提取 DPSCs、实验室处理、细胞保存，以及通过比色染色法检测成脂分化、成骨分化和成软骨分化能力。
本文所述方案提供了一套逐步操作流程，首先从牙齿中分离牙髓组织，随后在实验室中对牙髓干细胞（DPSCs）进行培养与传代维持，最后利用特定的干细胞标志物对其进行鉴定（图1）。文中还描述了诱导这些干细胞向不同细胞谱系分化的技术，以展示其多向分化潜能。
方案
本方案符合机构人体研究伦理委员会（IRB，Pushpagiri 研究中心，喀拉拉邦）的指导原则。提取牙齿的使用遵循伦理标准，以确保受试者的完整性、尊严和权利。本研究选取的受试者为年龄在30岁以下、因正畸治疗需要拔牙的健康个体。患有广泛性龋齿或重度牙周炎的个体被排除在研究之外。乳牙则采集自因滞留牙需要拔除的儿童。本研究还获得了所有受试者的书面知情同意。
1. 牙齿的提取与运输
- 乳牙和恒牙的收集
- 向参与者说明该操作的目的以及拔除牙齿用于科研的潜在用途。
- 在局部麻醉下进行牙齿拔除，即将麻醉剂注射至待拔除牙齿周围区域。本研究中，注射了1.75 mL含肾上腺素（见材料表）比例为1:200,000的利多卡因。优先选择无严重龋齿或牙周炎的牙齿20,21。
- 拔除牙齿的运输
注意：建议在无菌条件下操作，以避免污染。包括佩戴个人防护装备（如手套和实验服），并在无菌环境中操作，例如生物安全水平的层流罩内。- 牙齿拔除后，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，以去除血液和其他碎屑。使用无菌镊子和手术刀，小心清除牙齿表面附着的软组织残留物（图2A）。
- 将牙齿浸入消毒液（如70%乙醇）中10秒。消毒后，用无菌PBS冲洗牙齿，以去除残留的消毒剂。
- 将牙齿放入含有运输培养基的无菌容器中。
注意：运输培养基由Alpha-MEM组成，即一种添加了抗生素的商用培养基：100 U/mL青霉素/链霉素（见材料表）。该培养基为拔除牙齿内的细胞提供必要的营养，确保其在实验室处理前存活。抗生素用于抑制细菌生长。 - 运输过程中保持4 °C温度，以减缓细胞代谢活动并延缓细胞死亡。随后将牙齿运送至实验室，进行后续步骤，包括处理和分离牙髓干细胞。
2. 牙髓组织的采集
- 使用牙科镊子固定牙齿，确保其在操作过程中保持稳定。将金刚砂片安装在连接冷却水的牙科手机（参见材料表）上，对牙齿进行切割（图2B）。
注意：目的是暴露牙髓腔，同时避免对牙髓组织造成不必要的损伤。 - 使用牙科挖匙（参见材料表）去除牙髓组织。该器械可在不造成损伤的情况下取出牙髓，从而保持牙髓干细胞的活性（图2C）。
- 将获取的组织置于玻璃培养皿中，用磷酸盐缓冲液冲洗牙髓组织。
3. 肌肉组织的消化与细胞分离
- 组织切碎与消化
- 使用无菌手术刀将牙髓组织小心切碎成小片段（图2D），并将其放入含PBS的微型组织研磨器中，以获得均匀的混合物。此过程可增加组织的表面积，从而在消化过程中促进酶更高效地发挥作用。
- 将切碎的均质组织片段转移至15 mL离心管中，并使用含有3 mg/mL I型胶原酶和4 mg/mL分散酶的混合液进行酶解消化（见材料表）。这些酶溶解于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，以达到所需浓度。
- 将牙髓组织在酶混合液中（步骤3.1.2）于37 °C孵育约2小时。孵育结束后，中和酶活性，并通过离心（步骤3.2.1）收集细胞，用于后续培养。
- 离心与重悬
- 孵育结束后，将消化后的组织转移至15 mL离心管中，在室温下以300 × g 离心5分钟，使细胞形成沉淀。该步骤可将细胞与未消化的组织碎片及酶分离。小心弃去上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
- 用新鲜培养基重悬细胞沉淀。该培养基为分离的细胞提供必要的营养和生长环境，以维持其存活与增殖。
4. 细胞培养
- 细胞接种与培养
- 将重悬的细胞小心转移至一个 25 cm² 的细胞培养瓶中。
注意：来自单个牙髓组织的所有材料均应转移至同一个 25 cm2 的细胞培养瓶中。加入 5–7 mL 培养基可确保细胞获得充分覆盖和充足的营养供应。牙髓干细胞（DPSCs）所用培养基应为添加了 10%–20% 胎牛血清（FBS）（见材料表）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），以提供必要的生长因子。此外，还需添加 1% 的青霉素/链霉素，以防止细菌污染。确保细胞在培养瓶中均匀分布，以促进均一性生长。 - 将培养瓶置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中进行培养。
- 将重悬的细胞小心转移至一个 25 cm² 的细胞培养瓶中。
- 更换培养基与监测细胞融合度
- 每 2–3 天更换一次培养基，以提供新鲜营养并清除代谢废物。操作时，使用无菌移液管小心吸除旧培养基，并更换为新鲜培养基。
- 定期在显微镜下观察细胞培养状态，以追踪细胞生长情况，并检查是否存在污染迹象。
- 持续进行上述操作，直至细胞达到 80%–90% 融合度，即细胞覆盖了培养瓶大部分表面区域但尚未过度拥挤的状态。
- 细胞消化传代或冻存
- 当细胞达到 80%–90% 融合度时，移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，以去除残留培养基及未贴壁细胞。
- 向培养瓶中加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使细胞从瓶壁脱离。于 37 °C 孵育 2–5 分钟，直至细胞完全脱落。
- 加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性，然后轻轻吹打细胞悬液，确保细胞完全解离。
- 将细胞悬液在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 将细胞重悬于新鲜培养基中，可选择重新接种（传代）以继续培养，或使用含有冷冻保护剂（如 DMSO）的冻存液进行冻存，以备后续使用。
5. DPSCs 的表征
- 流式细胞术分析
- 为确认分离细胞的间充质干细胞特性，进行流式细胞术分析22,23首先，按照步骤4.3所述进行胰蛋白酶消化并收集细胞。
- 使用台盼蓝染色排除法测定细胞活力。采用细胞活力分析仪进行分析（参见 材料表) 在第2个nd 和 8th 传代。进行表型分析 通过 3期间的流式细胞仪rd 和 7th 传代次数
- 孵育后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞以去除多余的抗体，并使用流式细胞仪分析细胞。
注意：流式细胞术缓冲液由磷酸盐缓冲液（1x PBS）、1%-2% 胎牛血清（FBS）和 0.1% 叠氮化钠（NaN₃）组成。3）。FBS 或 BSA 可阻断抗体的非特异性结合，而叠氮化钠则作为防腐剂。大部分细胞应表达间充质干细胞标志物，并不表达造血细胞标志物，从而确认其牙髓干细胞（DPSCs）的身份。24. - 消化DPSCs并使用免疫荧光抗体进行染色，用于流式细胞术分析。
注意：间充质干细胞（MSCs）流式细胞术分析中标志物的选择依据国际细胞治疗学会（ISCT）达成的共识，即MSCs应表达CD105、CD73和CD90，且不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19以及HLA II类分子。25. 这些标志物常用于牙髓干细胞研究26抗体染色的浓度可能因所用抗体的不同而有所差异，建议遵循生产商的说明书（参见 材料表用于抗体稀释和孵育条件25. - 建立分类标准27,28 对于CD标志物的表达水平，如前所述：低于10%为无表达；11%至40%为低表达；41%至70%为中等表达；高于71%为高表达。
- 此外，通过将另一份细胞等分试样与抗CD34和CD45抗体孵育，确认造血标志物的缺失。
6. 多向分化
注意：以下步骤概述了牙源性干细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的实验方案。首先，在纤连蛋白包被的组织培养板中，以每孔 1 × 105 个细胞的密度接种细胞，并加入完全培养基（CM）进行培养。持续观察细胞生长，直至细胞融合度达到 80%–90%，再开始进行目标分化方案。为评估牙髓干细胞（DPSCs）的多向分化潜能，将细胞接种于 24 孔板中，并分别置于相应的诱导分化培养基中，诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞方向分化。
- 成骨分化
- 在标准条件下，将DPSCs接种于常规生长培养基中培养，直至细胞融合度达到70%–80%。
- 移除细胞培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后向细胞中加入成骨分化培养基（ODM）。
注意：ODM由添加了10%胎牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B、50 µg/mL抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸钠和100 nM地塞米松的α-最小必需培养基（α-MEM）组成（参见材料表）。 - 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下，在成骨诱导培养基中孵育，每2–3天更换一次培养基。
注意：培养14至21天后，DPSCs应已分化为成骨样细胞。可通过检测成骨细胞特异性标志物（如碱性磷酸酶）表达水平的升高，或通过染色技术（如茜素红S染色）检测矿化基质的存在来确认分化效果。 - 将细胞在-20 °C下用70%预冷乙醇固定1小时。
- 在室温避光条件下，用40 nM茜素红S染色液（pH 4.2）对固定后的细胞染色10–15分钟，在显微镜下观察染色结果以确认成骨分化（图3）。通过茜素红S染色检测钙盐沉积，可进一步验证矿化现象，从而确认成骨分化29,30。
- 脂肪分化
- 如前所述，在37 °C、5% CO2的湿润环境中标准培养DPSCs。当细胞融合度达到约70%–80%时进行传代。
- 吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，弃去洗涤液后加入脂肪分化培养基。该培养基通常由DMEM、10% FBS、10 µg/mL胰岛素、1 µM地塞米松、200 µM吲哚美辛和0.5 mM IBMX组成（参见材料表）。
- 每3–4天更换一次分化培养基。约3周后，用PBS洗涤已进行脂肪分化的DPSCs，并在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟。
- 使用油红O染色（参见材料表）对固定细胞进行染色，以观察脂滴的积累情况（图4）。为进一步确认脂肪分化，可对脂肪分化标志物（如过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和脂联素）进行基因表达分析31,32。
- 软骨分化
- 将DPSCs在37 °C、5% CO2的湿润环境中培养，用于软骨分化实验。当细胞融合度达到约70%–80%时进行传代。
- 吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，弃去洗涤液后加入软骨分化培养基。该培养基通常包含高糖DMEM、1% ITS、100 nM地塞米松、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸、40 µg/mL脯氨酸和10 ng/mL转化生长因子-β3（TGF-β3）（参见材料表）。
- 将细胞维持在软骨分化培养基中，每2–3天更换一次培养基。约三周后，DPSCs应已分化为软骨细胞样细胞。
- 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞20分钟。固定后，使用阿利新蓝染色（参见材料表）对细胞染色，并在显微镜下观察以确认软骨分化（图5）。
- 可通过阿利新蓝染色检测蛋白聚糖，或通过检测软骨分化标志物（如聚集蛋白聚糖、SOX9和II型胶原）的基因表达，来确认DPSCs向软骨细胞的分化33,34。
结果
成功执行所述方案后，获得了具有多向分化能力的牙髓干细胞（DPSCs），证明了其多能性。
细胞活力检测
在不同时间点采用台盼蓝排斥法检测DPSCs的细胞活力。结果显示，在整个培养期间细胞活力始终维持在较高水平（超过95%），表明本研究所采用的分离与培养方案具有良好的稳定性。
集落形成单位（CFU）实验
通过集落形成单位（CFU）实验评估牙髓干细胞（DPSCs）的自我更新能力。将单细胞悬液以低密度接种，并培养14天。随后对形成的集落进行染色并计数。结果显示存在大量集落，表明在DPSC群体中含有较高比例的具有自我更新能力的细胞。
细胞倍增时间
根据牙髓干细胞（DPSCs）的生长曲线计算细胞倍增时间。将细胞以特定密度接种，并定期计数以构建生长曲线，随后利用曲线的指数生长期计算倍增时间。结果显示出的倍增时间与间充质干细胞（MSCs）报道的倍增时间一致，表明细胞群体健康且具有良好的增殖能力（图6）。
流式细胞术分析
流式细胞术分析显示，绝大多数牙髓干细胞（例如，>95%）表达CD90、CD73和CD105，证实其具有间充质干细胞（MSCs）的特征（图7）。此外，少于2%的细胞表达CD45、CD34和HLA-DR，表明无明显的造血细胞或内皮细胞污染。
成骨分化
完成成骨分化后，细胞表现出矿化基质，可通过茜素红S染色观察到（图3）。染色细胞中出现红色表明矿化基质成功沉积，这是成骨分化的关键特征。若无法成功实现分化染色，可能与样本采集过程中遇到的困难有关。
成脂分化
在成脂分化过程中，牙髓干细胞（DPSCs）积累了脂滴，表明发生了成脂作用。可通过油红O染色观察到脂滴（图4）。成功的分化会导致细胞内出现橙红色染色的脂滴。
软骨向分化
最后，在软骨向分化后，牙髓干细胞（DPSCs）产生了糖胺聚糖——一种关键的软骨成分，可通过阿利新蓝染色进行确认，该染料可与糖胺聚糖结合。成功完成软骨向分化的细胞在染色后呈现蓝色（图5）。
在染色过程中未能表现出相应颜色变化的细胞，可能是由于分化效果不理想所致，这可能与分化培养基或DPSCs初始质量有关。确保培养基及其添加物的质量，以及所用DPSCs的细胞状态和传代次数，至关重要。DPSCs成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，证实了这些细胞的多能性，凸显了其在再生医学和治疗应用中的潜力。
图1：牙髓干细胞的分离、鉴定与分化概述。 本图展示了牙髓干细胞（DPSCs）分离、鉴定和分化的工作流程示意图。该过程始于牙齿（或牙齿群）的提取，随后分离牙髓组织，并从中获取DPSCs。分离后，DPSCs需经过多种鉴定检测，以确认其干细胞特性，并评估其活力、增殖速率及其他关键属性。本示意图中所示的最后阶段为诱导分化，即通过特定因子处理DPSCs，引导其转化为特定类型的细胞，如成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：从拔除牙齿中获取牙髓组织。（A）用于牙髓组织提取的拔除牙齿。（B）使用金刚砂钻头对拔除牙齿进行切开。（C）从牙髓腔中取出牙髓组织。（D）使用手术刀片将牙髓组织切碎。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过茜素红S染色（40倍）显示牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化。 明亮的红色染色表明矿化基质的沉积，这是成骨细胞的典型特征，证实了成骨分化的成功。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：通过油红O染色显示牙髓干细胞（DPSCs）的成脂分化。 明亮的红色脂滴表明脂质积聚，这是脂肪细胞的典型特征，证实了成脂分化成功。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：通过阿利新蓝染色法显示牙髓干细胞（DPSCs）的软骨向分化（40倍放大）。 深蓝色表明存在富含蛋白聚糖的细胞外基质，这是软骨细胞的特征，证实了软骨向分化的成功。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：牙髓干细胞（DPSCs）的细胞倍增时间。 本图展示了DPSCs随时间变化的生长曲线。细胞最初以特定密度接种，并在规定时间间隔（横轴表示）进行细胞计数，以监测其增殖速率。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：DPSC培养物中干细胞表面标志物的表达。 本图展示了DPSCs上特定细胞表面标志物的表达情况。间充质干细胞标志物CD44、CD90和CD105呈现高水平表达，表明这些细胞具有间充质特性。相反，造血系标志物（CD34和CD45）以及主要组织相容性复合体II类分子（HLA-DR）的表达几乎可以忽略不计，证实了培养物中不存在造血系细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该方案概述了从人类乳牙和恒牙中分离、培养和鉴定牙髓干细胞（DPSCs）的步骤。内容包括这些细胞的保存与增殖方法，以及对其多能性特征的评估 体外 成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化潜能35.
Chen 等人36 证明，牙髓干细胞（DPSCs）可从多种来源获取，包括受牙周炎、牙根吸收、冠周炎和牙折等疾病影响的感染性活髓人牙，以及额外牙和错位牙。后续研究进一步证实，感染性活髓牙可作为 DPSCs 的潜在来源37,38,39,40。 然而，Bernardi 等人10指出，严重的牙根吸收可能对这些干细胞的存活率产生不利影响。该过程中的一大难题是细胞的保存及其降解的防止，因为降解在牙齿拔除或自然脱落之后即刻开始。此外，需特别注意，患有根尖脓肿、肿瘤或囊肿等严重病变的牙齿不应用于干细胞的提取40,41。
牙髓干细胞可通过酶消化法（ED）或组织外植块迁移法（OG，也称为自发性生长法）获取14,15. 研究人员利用这些策略来研究细胞增殖的效率或分离干细胞形态学和表型特征的维持情况17. 研究发现，分离得到的干细胞 通过 OG方法显示出较慢的增殖速率以及较弱的干细胞标志物表达18. 相反，通过ED法分离的牙髓干细胞（DPSCs）在增殖速度、分化能力以及多种表面标志物的表达水平上均高于采用OG法分离获得的细胞。有趣的是，利用OG技术从乳牙牙髓中提取的未成熟牙髓干细胞（IDPSCs）在培养过程中表现出选择性增殖的倾向，从而抑制了早期分化。42.
牙髓干细胞（DPSCs）的纯化对于获得高再生能力的细胞至关重要，且需要特定的细胞标志物。细胞筛选可通过荧光激活细胞分选或磁珠激活细胞分选方法进行。由于牙髓干细胞（DSCs）具有异质性，除上述标志物外，还使用大量其他表面抗原43。然而，目前尚未发现能够区分其亚群的单一标志物。
与来自骨髓的间充质干细胞相比，牙髓干细胞（DPSCs）因其多向分化潜能而被认为是一种极具前景的多能细胞来源44。 这种干性特征可能源于其来源组织相对未成熟，因为智齿通常是获取DPSCs的来源，而智齿是最后发育的恒牙，因此其成熟度低于骨髓45。 本实验方案通过诱导牙髓干细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化，成功验证了其多向分化潜能。值得注意的是，在成骨条件下培养时，DPSCs是唯一能够上调DSPP表达的细胞类型，表明其具有向成牙本质细胞分化的潜力46。
从不同来源分离的牙源性干细胞展现出强大的增殖和分化潜能47。体外（in vitro）系统取得的重大进展已深刻影响了干细胞生物学及治疗学的发展。尽管如此，在将干细胞疗法从实验室推向临床应用的过程中仍面临诸多挑战。必须特别关注干细胞的存活率与稳定性，以确保保存技术不会损害这些细胞的活力。虽然牙源性干细胞研究在动物模型中已取得令人鼓舞的成果，但迫切需要将这些发现拓展至人体临床试验。通过持续推动严谨的研究与开发，牙源性干细胞有望在推动干细胞储存领域发展中发挥重要作用。
尽管酶消化法被广泛使用，但在分离牙髓干细胞（DPSCs）时仍存在若干局限性。首先，该过程可能影响细胞活力，因为胶原酶和分散酶等酶类可能意外损伤细胞膜，导致存活干细胞数量减少17。 此外，该方法常导致关键的细胞外基质（ECM）降解，而细胞外基质对于维持干细胞的固有特性至关重要48。 该操作还可能改变细胞表面标志物，阻碍对DPSCs的准确鉴定与表征43。 除了这些生物学限制外，该方法耗时较长，由于在37 °C下长时间孵育，增加了微生物污染的风险。此外，不同批次酶之间的不一致性可能导致结果波动，影响分离过程的可重复性。不容忽视的是经济负担，适用于组织消化的高纯度酶价格昂贵49。 再者，消化后可能残留酶活性，进而对细胞培养产生不利影响，干扰细胞的健康状态、增殖能力及分化潜能。最后，酶消化法可能优先分离某些DPSC亚群而忽略其他亚群，从而无意中使最终获得的细胞群体发生偏倚，影响其治疗潜力50。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢蒂鲁瓦朗达普拉姆普什帕吉里研究中心主任兼负责人Mathew Mazhavancheril博士，感谢他在记录该研究中心操作流程过程中提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63103 | I5879 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | AS001 | |
| 阿尔新蓝 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | RM471 | |
| 茜素红S染色液 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | GRM894 | |
| 碱性磷酸酶染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| α最低必需培养基（Alpha Minimum Essential Medium）α-MEM | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| α最低必需培养基（Alpha Minimum Essential Medium）α-MEM | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| Alpha-MEM，即Alpha最低必需培养基 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| Alpha-MEM，即Alpha最低必需培养基 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| 抗生素/抗真菌素 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | P4333 | |
| 抗坏血酸-2-磷酸盐 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | 012-04802 | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | G9422-10G | |
| 生物安全柜-层流罩 | Labconco Corporation，密苏里州 64132-2696，美国 | ||
| CD90、CD105、CD73、CD34、CD45 和 HLA-DR | BioLegend, Inc.，加利福尼亚州 92121，美国 | ||
| 细胞滤网（70 µm | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TCP025 | 细胞筛 |
| 离心 | REMI Elektrotechnik Limited（REMI） | ||
| 离心 | HiMedia 实验室 有限公司，印度孟买 | 1101 | 1102 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| I型胶原酶 | Worthington Biochem. Corp.，新泽西州 08701，美国 | ||
| I型胶原酶 | Worthington Biochem. Corp.，新泽西州 08701，美国 | ||
| 完全培养基 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | AT006 | DMEM |
| 锥形管（15 或 50） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | 546021P/546041P | 15 mL 和 50 mL |
| 冷冻冻存容器 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | 15-350-50 | |
| 冷冻标签 | 标签印度： | ||
| 冻存管储存盒 | Cryostore 冻存盒 | ||
| 冻存管 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 冻存管（1.8 mL） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | PW1282 | 自支撑 |
| 培养瓶（25 cm²）²) | 康宁公司，纽约州 14831，美国 | ||
| 培养瓶 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TCG4/TCG6 | T25/T75 |
| 培养皿 | HiMedia 实验室 有限公司，印度孟买 | TCP129/TCP008 | 60 mm/100 mm |
| 牙科金刚砂片 | Komet SC 29730，美国 | 彗星 | |
| 牙科挖匙 | Brasseler, GA 31419, 美国 | 5023591U0 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | D4902-25MG | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63103 | D4902-25MG | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | D4902-25MG | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TC185 | |
| Dispase | 罗氏诊断，德国曼海姆 | ||
| Dispase | 罗氏诊断有限公司，曼海姆，德国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 乙醇（70%） | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | MB106 | |
| 70% 乙醇 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Fisher Scientific | |
| 拔牙钳 | Dentsply Sirona，美国 | ||
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 胎牛血清（FBS） | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | RM9954 | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 纤连蛋白包被的组织培养板 | 美国纽约州康宁市康宁公司，邮编 14831 | ||
| 流式细胞仪 | BD 生物科学，加利福尼亚州 95131，美国 | ||
| 流式细胞术缓冲液 | BD 生物科学，加利福尼亚州 95131，美国 | ||
| 22 x 22 mm 玻璃盖玻片 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TCP017 | |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Lonza Group Ltd，4002 巴塞尔，瑞士 | ||
| 高速牙科手机 | 日本东京 NSK有限公司 8216 | Ti-Max Z 系列 | |
| 马血清 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| IBMX，或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | ||
| 吲哚美辛 | 辉瑞公司，美国纽约 10017 | ||
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | I5523 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | I5523 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）预混液 | 康宁公司，马萨诸塞州 01876，美国 | ||
| 倒置显微镜 | 奥林巴斯公司，日本东京 163-0914 | ||
| 异丙醇（60%） | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | I9516 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | MB063 | |
| 层流罩 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 利多卡因与肾上腺素混合液 | DENTSPLY，北卡罗来纳州 28277，美国 | Citanest | |
| 液氮 | 法国巴黎，75007，液化空气集团 | ||
| 液氮储存罐 | Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd. | ||
| 微量移液器 | Eppendorf AG，22339 汉堡，德国 | 30020 | Accupipet-2-20 µL |
| 微型组织研磨器 | 美国加利福尼亚州 94547，伯乐实验室股份有限公司 | ReadyPrep 微型研磨器 | |
| -80℃ 冰箱 | Blue Star Limited | ||
| 血细胞计数板 | 德国马里恩费尔德上阿克海登费尔德 | ||
| 油红O染色 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | 1024190250 | |
| 成骨分化培养基（ODM） | STEMCELL Technologies Inc.，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市，V5Z 1B3 | ||
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TCL119 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco-赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 不含钙的磷酸盐缓冲液（PBS）++ 和 Mg++ | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TS1101 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | Gibco | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国 | Gibco | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | P3813-1PAK | 1× PBS，pH 7.4 |
| 脯氨酸 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | ||
| 15号手术刀片 | Swann-Morton有限公司，谢菲尔德，S6 2BJ，英国 | BDF-6955C | |
| 次氯酸钠 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | AS102 | 4% w/v 溶液 |
| 无菌离心管 | Tarsons Products Pvt. Ltd. | ||
| 无菌容器 - 20 mL | 美国明尼苏达州3M中心，邮编 55144-1000 | 3 M | |
| 无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich，美国 | P3813-1PAK | 1× PBS，pH 7.4 |
| 无菌移液管（2、5 和 10 mL） | Eppendorf AG，22339 汉堡，德国 | ||
| 无菌移液管和吸头 | Eppendorf 印度有限公司 | ||
| 手术刀柄 | Becton, Dickinson and Co., NJ, 美国 | 371030 | BP手柄3 |
| 转化生长因子-β3（TGF-β3) | R&D Systems, Inc.，明尼苏达州 55413，美国 | ||
| 转化生长因子-β3（TGF-β3) | R&D Systems, Inc.，明尼苏达州 55413，美国 | ||
| 台盼蓝 0.4% | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | ||
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TCL046 | |
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TCL046 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 水浴锅 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | BSW-01D |
参考文献
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