本方案重点介绍通过酶消化法从牙髓中分离、培养和保存多能干细胞的方法。此外，还展示了这些细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能，强调了操作过程中精确性和一致性的关键作用。
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摘要
摘要
在再生医学与治疗应用领域，干细胞研究正迅速获得广泛关注。牙髓干细胞（DPSCs）存在于乳牙和恒牙中，因其易于获取、良好的适应性以及内在的分化能力，已成为重要的干细胞来源。DPSCs 提供了丰富且易得的间充质干细胞储备，展现出卓越的多能性与应用潜力，尤其在组织再生方面表现突出。尽管前景广阔，但其主要挑战在于如何高效地分离和鉴定 DPSCs，因为它们仅占牙髓细胞中的极小比例。同时，对这一宝贵细胞资源的妥善保存也至关重要。目前 DPSCs 分离的两种主要方法为酶消化法（ED）和组织外植块迁移法（OG），后者常被称为自发性生长法。本实验方案主要聚焦于酶消化法分离 DPSCs，详细阐述了从牙齿提取、实验室处理至细胞保存的完整操作步骤。除了提取与保存之外，本方案还深入探讨了 DPSCs 的分化能力。具体而言，文中描述了诱导这些干细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的实验流程，充分展示了其多向分化潜能。随后通过比色染色技术对分化结果进行准确的可视化观察与确认，从而验证所分离 DPSCs 的质量与功能特性。该综合性实验方案涵盖了牙髓干细胞提取、培养、保存及鉴定的全过程，为相关研究提供了系统性操作蓝图。本方案突显了 DPSCs 所蕴含的重大潜力，推动干细胞领域的深入探索，为未来再生医学与临床治疗的突破带来希望。
引言
由于干细胞在再生医学和组织工程中具有广阔的应用前景，干细胞研究在生物医学科学领域蓬勃发展。牙髓干细胞（DPSCs）来源于人类乳牙和恒牙的牙髓组织，因其易于获取和具有多向分化潜能而受到广泛关注1,2。大量研究已证实，这些细胞可分化为多种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞3。
近几十年来，干细胞的研究和治疗应用迅速增长。干细胞的巨大潜力要求拓展其来源渠道。多种因素会影响所选细胞的效率、存活率和干性。尽管目前已知的干细胞来源包括骨髓和脂肪组织等，但这些来源常因侵入性操作、取材部位的并发症以及伦理问题而限制了其广泛应用4,5。在众多干细胞来源中，牙源性干细胞因其易于获取、具有高度可塑性及广泛的应用前景而受到关注。其中，人牙髓干细胞尤其因其治疗潜力而被广泛研究6。牙齿通常作为医疗废弃物被丢弃，但实际上含有丰富的间充质干细胞7。保护这一宝贵的干细胞资源需要患者、牙科医生和临床医生的共同努力，以确保这些资源不被浪费，使每一例牙髓干细胞都能用于未来的再生医学需求。
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方案
本方案符合机构人体研究伦理委员会（IRB，Pushpagiri 研究中心，喀拉拉邦）的指导原则。提取牙齿的使用遵循伦理标准，以确保受试者的完整性、尊严和权利。本研究选取的受试者为年龄在30岁以下、因正畸治疗需要拔牙的健康个体。患有广泛性龋齿或重度牙周炎的个体被排除在研究之外。乳牙则采集自因滞留牙需要拔除的儿童。本研究还获得了所有受试者的书面知情同意。
1. 牙齿的提取与运输
- 乳牙和恒牙的收集
- 向参与者说明该操作的目的以及拔除牙齿用于科研的潜在用途。
- 在局部麻醉下进行牙齿拔除，即将麻醉剂注射至待拔除牙齿周围区域。本研究中，注射了1.75 mL含肾上腺素（见材料表）比例为1:200,000的利多卡因。优先选择无严重龋齿或牙周炎的牙齿20,21。
- 拔除牙齿的运输
注意：建议在无菌条件下操作，以避免污染。包括佩戴个人防护装备（如手套和实验服），并在无菌环境中操作，例如生物安全水平的层流罩内。- 牙齿拔除后，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，以去除血液和其他碎屑。使用无菌镊子和手术刀，小心清除牙齿表面附着的软组织残留物（
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结果
成功执行所述方案后，获得了具有多向分化能力的牙髓干细胞（DPSCs），证明了其多能性。
细胞活力检测
在不同时间点采用台盼蓝排斥法检测DPSCs的细胞活力。结果显示，在整个培养期间细胞活力始终维持在较高水平（超过95%），表明本研究所采用的分离与培养方案具有良好的稳定性。
集落形成单位（CFU）实验
通过集落形成单位（CFU）实验评估牙髓干细胞（DPSCs）的自我更新能力。将单细胞悬液以低密度接种，并培养14天。随后对形成的集落进行染色并计数。结果显示存在大量集落，表明在DPSC群体中含有较高比例的具有自我更新能力的细胞。
细胞倍增时间
根据牙髓干细胞（DPSCs）的生长曲线计算细胞倍增时间。将细胞以特定密度接种，并定期计数以构建生长曲线，随后利用曲线的指数生长期计算倍增时间。结果显示出的倍增时间与间充质干细胞（MSCs）报道的倍增时间一致，表明细.......
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讨论
该方案概述了从人类乳牙和恒牙中分离、培养和鉴定牙髓干细胞（DPSCs）的步骤。内容包括这些细胞的保存与增殖方法，以及对其多能性特征的评估 体外 成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化潜能35.
Chen 等人36 证明，牙髓干细胞（DPSCs）可从多种来源获取，包括受牙周炎、牙根吸收、冠周炎和牙折等疾病影响的感染性活髓人牙，以及额外牙和错位牙。后续研究进一步证实，感染性活髓牙可作为 DPSCs 的潜在来源37,38,39,40。 然而，Bernardi 等人10指出，严重的牙根吸收可能对这些干细胞的存活率产.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢蒂鲁瓦朗达普拉姆普什帕吉里研究中心主任兼负责人Mathew Mazhavancheril博士，感谢他在记录该研究中心操作流程过程中提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63103 | I5879 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | AS001 | |
| 阿尔新蓝 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | RM471 | |
| 茜素红S染色液 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | GRM894 | |
| 碱性磷酸酶染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| α最低必需培养基（Alpha Minimum Essential Medium）α-MEM | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| α最低必需培养基（Alpha Minimum Essential Medium）α-MEM | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| Alpha-MEM，即Alpha最低必需培养基 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| Alpha-MEM，即Alpha最低必需培养基 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Gibco | |
| 抗生素/抗真菌素 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | P4333 | |
| 抗坏血酸-2-磷酸盐 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | 012-04802 | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | G9422-10G | |
| 生物安全柜-层流罩 | Labconco Corporation，密苏里州 64132-2696，美国 | ||
| CD90、CD105、CD73、CD34、CD45 和 HLA-DR | BioLegend, Inc.，加利福尼亚州 92121，美国 | ||
| 细胞滤网（70 µm | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TCP025 | 细胞筛 |
| 离心 | REMI Elektrotechnik Limited（REMI） | ||
| 离心 | HiMedia 实验室 有限公司，印度孟买 | 1101 | 1102 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| I型胶原酶 | Worthington Biochem. Corp.，新泽西州 08701，美国 | ||
| I型胶原酶 | Worthington Biochem. Corp.，新泽西州 08701，美国 | ||
| 完全培养基 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | AT006 | DMEM |
| 锥形管（15 或 50） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | 546021P/546041P | 15 mL 和 50 mL |
| 冷冻冻存容器 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | 15-350-50 | |
| 冷冻标签 | 标签印度： | ||
| 冻存管储存盒 | Cryostore 冻存盒 | ||
| 冻存管 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 冻存管（1.8 mL） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | PW1282 | 自支撑 |
| 培养瓶（25 cm²）²) | 康宁公司，纽约州 14831，美国 | ||
| 培养瓶 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TCG4/TCG6 | T25/T75 |
| 培养皿 | HiMedia 实验室 有限公司，印度孟买 | TCP129/TCP008 | 60 mm/100 mm |
| 牙科金刚砂片 | Komet SC 29730，美国 | 彗星 | |
| 牙科挖匙 | Brasseler, GA 31419, 美国 | 5023591U0 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | D4902-25MG | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63103 | D4902-25MG | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | D4902-25MG | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TC185 | |
| Dispase | 罗氏诊断，德国曼海姆 | ||
| Dispase | 罗氏诊断有限公司，曼海姆，德国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 乙醇（70%） | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | MB106 | |
| 70% 乙醇 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | Fisher Scientific | |
| 拔牙钳 | Dentsply Sirona，美国 | ||
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 胎牛血清（FBS） | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | RM9954 | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | F2442-500ML | |
| 纤连蛋白包被的组织培养板 | 美国纽约州康宁市康宁公司，邮编 14831 | ||
| 流式细胞仪 | BD 生物科学，加利福尼亚州 95131，美国 | ||
| 流式细胞术缓冲液 | BD 生物科学，加利福尼亚州 95131，美国 | ||
| 22 x 22 mm 玻璃盖玻片 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TCP017 | |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Lonza Group Ltd，4002 巴塞尔，瑞士 | ||
| 高速牙科手机 | 日本东京 NSK有限公司 8216 | Ti-Max Z 系列 | |
| 马血清 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| IBMX，或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | ||
| 吲哚美辛 | 辉瑞公司，美国纽约 10017 | ||
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | I5523 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | I5523 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）预混液 | 康宁公司，马萨诸塞州 01876，美国 | ||
| 倒置显微镜 | 奥林巴斯公司，日本东京 163-0914 | ||
| 异丙醇（60%） | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | I9516 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | MB063 | |
| 层流罩 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 利多卡因与肾上腺素混合液 | DENTSPLY，北卡罗来纳州 28277，美国 | Citanest | |
| 液氮 | 法国巴黎，75007，液化空气集团 | ||
| 液氮储存罐 | Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd. | ||
| 微量移液器 | Eppendorf AG，22339 汉堡，德国 | 30020 | Accupipet-2-20 µL |
| 微型组织研磨器 | 美国加利福尼亚州 94547，伯乐实验室股份有限公司 | ReadyPrep 微型研磨器 | |
| -80℃ 冰箱 | Blue Star Limited | ||
| 血细胞计数板 | 德国马里恩费尔德上阿克海登费尔德 | ||
| 油红O染色 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | 1024190250 | |
| 成骨分化培养基（ODM） | STEMCELL Technologies Inc.，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市，V5Z 1B3 | ||
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TCL119 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco-赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 不含钙的磷酸盐缓冲液（PBS）++ 和 Mg++ | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | TS1101 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | Gibco | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国 | Gibco | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国 | P3813-1PAK | 1× PBS，pH 7.4 |
| 脯氨酸 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | ||
| 15号手术刀片 | Swann-Morton有限公司，谢菲尔德，S6 2BJ，英国 | BDF-6955C | |
| 次氯酸钠 | HiMedia Laboratories 有限公司，印度孟买 | AS102 | 4% w/v 溶液 |
| 无菌离心管 | Tarsons Products Pvt. Ltd. | ||
| 无菌容器 - 20 mL | 美国明尼苏达州3M中心，邮编 55144-1000 | 3 M | |
| 无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich，美国 | P3813-1PAK | 1× PBS，pH 7.4 |
| 无菌移液管（2、5 和 10 mL） | Eppendorf AG，22339 汉堡，德国 | ||
| 无菌移液管和吸头 | Eppendorf 印度有限公司 | ||
| 手术刀柄 | Becton, Dickinson and Co., NJ, 美国 | 371030 | BP手柄3 |
| 转化生长因子-β3（TGF-β3) | R&D Systems, Inc.，明尼苏达州 55413，美国 | ||
| 转化生长因子-β3（TGF-β3) | R&D Systems, Inc.，明尼苏达州 55413，美国 | ||
| 台盼蓝 0.4% | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | ||
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TCL046 | |
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103 | TCL046 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州 02451，美国 | ||
| 水浴锅 | Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州 02451，美国 | BSW-01D |
参考文献
- Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
- Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S.
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