脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

Summary

该方案阐明了应用于天然牛肺组织的两种不同的脱细胞方法，全面介绍了它们各自的特征。

Abstract

细胞外基质（ECM）衍生的水凝胶在组织工程中的使用越来越受欢迎，因为它们可以在 体外模拟细胞的自然环境。然而，保持ECM的天然生化成分，实现机械稳定性，以及理解脱细胞过程对ECM水凝胶机械性能的影响是具有挑战性的。在这里，描述了使用两种不同方案对牛肺组织进行脱细胞的管道，下游表征脱细胞的有效性，制备重组的脱细胞肺ECM水凝胶以及评估其机械和细胞相容性。牛肺的脱细胞化采用物理（冻融循环）或化学（基于洗涤剂）的方法进行。进行苏木精和曙红染色以验证主要ECM成分的脱细胞和保留。为了评估脱细胞样品中残留的胶原和硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，分别采用天狼星红和阿尔新蓝染色技术。脱细胞肺ECM水凝胶的机械性能通过振荡流变学进行表征。结果表明，脱细胞的牛肺水凝胶可以通过保留大多数天然ECM成分，为商业ECM产品提供可靠的器官型 替代品。此外，这些发现表明，所选择的脱细胞方法显着影响凝胶动力学以及所得水凝胶的刚度和粘弹性。

Introduction

传统的单层培养条件不能忠实地表示天然组织微环境，并且缺乏提供具有指导性配体的三维 （3D） 支架的能力，这些配体可实现细胞-基质和细胞-细胞相互作用¹。细胞外基质 （ECM） 的组成和机械性能具有高度的组织特异性、时间依赖性，并且在病理条件下会发生变化。因此，需要仿生 3D 组织模型，以允许这些特征的可调性、细胞行为的调节以及实现所需的组织功能。天然 ECM 衍生的生物材料在组织工程中备受关注，能够直接使用组织特异性 ECM^{1、2、3、4、5}。基于ECM的载体已被用于从组织再生到疾病模型开发的许多应用中。它们被用作可注射或可植入的生物材料支架^4,5，在药物筛选应用^6,7中，在诱导细胞生长的材料^{开发中8,9,10}

Protocol

从当地屠宰场获得来自年轻（1-2岁）牛捐赠者的新鲜天然肺，并装在冰上的密封塑料容器中运送到实验室。动物祭祀是为一般肉类消费而进行的（肺作为废物丢弃），与研究无关或与研究无关。我们确认屠宰场符合国家动物祭祀法律法规。此外，我们确认我们只使用了废料，研究项目对牺牲的动物数量没有影响。

1. 器官采集和组织制备

1. 将新鲜获得的牛肺组织储存在-80°C直至实验。
2. 在实验当天，等待冷冻的肺组织在室温下解冻。
3. 用无菌手术刀和剪刀解剖组织以去除气管和软骨气道，并进一步切成小块（5mm³）。
4. 用含有 2% 青霉素/链霉素 （P/S） 的超纯水彻底清洗至少 3 次。

2. 组织脱细胞

注意:使用两种不同的方案对天然牛肺组织进行脱细胞化。

1. 冻融法
   1. 根据步骤1制备组织样本。将切碎的组织浸入无菌蒸馏水（dH_2O）的2%碘溶液中1分钟。在无菌dH₂O中连续洗涤两次。
   2. 将切碎的组织块转移到 50 mL 管中至 15 mL 液位，并使用便携式液氮容器进行五次手动冻融循环。用无菌dH₂O填充管顶部，并....

Results

脱细胞
牛肺组织的脱细胞化以产生可以概括天然肺微环境的 dECM 水凝胶已通过物理（冻融）和化学 （Triton-X-100） 方法实现。解剖后，用含dH₂O的抗生素洗涤组织片，以去除以后可能影响dECM水凝胶无菌性的病原体。采用冻融法在液氮至37 °C水浴之间交替进行5次循环，破坏细胞结构。在第二种脱细胞方法中，天然肺组织片在不断搅拌下用 1% Triton-X-100 溶液处理 3 天。在这两种方法中，将肺组织切成小块对于允许溶液扩散到核心区域以及核内容物的物理破坏至关重要。作为脱细胞的第一个视觉指标，组织的粉红色在两种方法中都经过重复循环而变成白色。去除残留的DNA也很重要，这是在该协议中通过DNase处理实现的。此外，在用两种方法脱细胞后，将组织在补充抗生素的 dH₂O 中广泛洗涤 3 天以保持组织的无菌性。要考虑的另一点是，在dECM消化物中和和缓冲到生理条件的过程中，所有溶液都经过过滤灭菌，同样是出于无菌目的，并保持在冰上以避免过早形成凝胶。然后在最后一步通过热凝胶形成肺dECM水凝胶（

Discussion

器官来源的水凝胶已成为有前途的模型，可以概括天然组织ECM并模拟器官型细胞功能。尽管脱细胞肺ECM经常用于组织工程，但对生物材料组成和机械性能的彻底表征将有助于更好地了解细胞-ECM相互作用如何被调节，以模拟体内平衡或疾病期间的生物过程。特别是，对重组水凝胶的机械性能（如刚度和粘弹性）的评估和控制具有重要意义，因为这些特性在调节多种细胞现象中已经隐含。因此，在生化含量和力学方面比较和评估用于生产dECM水凝胶的不同脱细胞方法^{至关重要20,23}。在这里，牛肺脱细胞化用两种不同的方法得到证明:冻融循环，主要基于机械破坏和去除DNA含量，以及使用普通洗涤剂Triton-X-100化学去除核含量（图1）。对于冻融方法，必须确保所有组织样品在液氮和水浴之间以自动化和重复的途径²⁴进行冷冻和适当解冻。为了实现这一点，可以将组织样本分成几个试管，然后沉入氮气容器中进行冷冻，然后进行水浴解冻。每 24 小时更换一次 Triton-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
无水乙醇	ISOLAB	64-17-5
乙酸	ISOLAB	64-19-7
阿尔新蓝溶液	Sigma-Aldrich	B8438
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 流变仪	TA Instruments
Entellan 封片剂	Merck	107960
曙红溶液	Bright-slide	2.BS01-105-1000
甲醛	电子显微镜科学	50-980-485
盐酸	Merck	100317
碘	Sigma-Aldrich	3002
氯化镁	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's 苏木精染色液	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T 化合物	Tissue-Tek	4583
青霉素/链霉素	Biowest	L0018-100
来自猪胃粘膜的胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	P6887
苦味酸	Polysciences	88-89-1
天狼星红	Polysciences	09400-25
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	默克	112298