脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

摘要

该方案阐明了应用于天然牛肺组织的两种不同脱细胞方法，并对其各自的表征进行了全面阐述。

摘要

细胞外基质（ECM）来源的水凝胶在组织工程中的应用日益广泛，因其能够模拟细胞的天然微环境 体外然而，维持细胞外基质（ECM）的天然生化成分、实现其机械稳定性，并充分理解脱细胞过程对ECM水凝胶机械性能的影响，仍具挑战性。本文描述了一种利用两种不同方案对牛肺组织进行脱细胞处理的流程，包括脱细胞效果的下游表征、重构脱细胞肺ECM水凝胶的制备，以及对其机械性能和细胞相容性的评估。牛肺组织的脱细胞处理采用物理方法（冻融循环）或化学方法（基于去垢剂）进行。通过苏木精-伊红染色验证脱细胞效果及主要ECM成分的保留情况。为评估脱细胞样本中残留的胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，分别采用天狼星红染色和阿利新蓝染色技术。脱细胞肺ECM水凝胶的机械性能通过振荡流变学进行表征。结果表明，脱细胞牛肺水凝胶可提供可靠的器官型 保留大部分天然细胞外基质成分，为商用细胞外基质产品提供了一种替代方案。此外，这些发现表明，所选用的脱细胞方法显著影响所得水凝胶的凝胶动力学以及硬度和黏弹性特性。

引言

传统的单层培养条件无法真实再现天然组织的微环境，且缺乏提供具有指导性配体的三维（3D）支架的能力，因而不能支持细胞-基质和细胞-细胞间的相互作用¹。细胞外基质（ECM）的组成和机械特性具有高度的组织特异性和时间依赖性，并在病理条件下发生改变。因此，亟需开发可模拟天然ECM的三维组织模型，以实现对这些特性的可调控性、细胞行为的调节以及目标组织功能的实现。来源于天然ECM的生物材料因其能够直接利用组织特异性的ECM，在组织工程领域受到广泛关注^1,2,3,4,5。基于ECM的载体已广泛应用于从组织再生到疾病模型构建的多个领域。它们被用作可注射或可植入的生物材料支架^4,5，用于药物筛选应用^6,7，用于促进细胞生长的材料开发^8,9,10，作为生物墨水^11,12,13，应用于微流控系统¹⁴，以及用于癌症组织模型的构建^{15,16,17,18,19}。

组织和器官的脱细胞化是生成模拟组织特异性细胞外基质（ECM）支架的常用方法。 将脱细胞化的组织和器官重构为水凝胶，可实现细胞在仿生三维组织模型中的包埋²⁰。脱细胞化技术主要致力于去除细胞成分，同时保留ECM的组成。常用的物理方法包括冻融循环，化学方法则包括Triton-X-100处理，这些方法被广泛 应用于组织脱细胞化。此外，通常采用DNase处理以清除残留DNA，从而在细胞包埋后最大限度地降低免疫反应。为优化脱细胞化工艺，关键在于实现细胞的最大程度去除和ECM的最小程度损伤²¹。 除上述因素外，对重构支架的生化和力学特性（包括黏弹性与刚度）进行表征，对于提升源自天然基质的工程化三维组织模型至关重要 ²⁰。

器官特异性细胞外基质在肺组织工程中可模拟肺部微环境，用于研究发育、稳态或病理过程 体外 在生理模拟环境中测试治疗方法^20,22,23先前的研究已证明去细胞化 来自多种物种的肺组织，如大鼠、猪和人类，但这些方法尚未被应用于牛等较少使用的物种。更深入地理解脱细胞过程的参数及其对重建的细胞外基质（ECM）支架在生化组成和力学性能方面的影响，将有助于更精确地调控这些特性，并为健康与疾病状态下更可靠的组织模型奠定基础。本研究明确描述了采用两种不同方法——冻融循环和Triton X-100处理——对牛肺组织进行脱细胞化的过程，并对所得脱细胞肺ECM（dECM）水凝胶进行了生化与力学分析。研究结果表明，两种方法均可实现有效的脱细胞并保留ECM配体。值得注意的是，方法的选择显著影响重建水凝胶的刚度和黏弹性。由牛dECM制备的水凝胶在生化特性上与人肺细胞外基质具有显著相似性，并表现出可靠的热诱导凝胶化特性²⁰如先前所述，这两种方法均适用于肺癌细胞、健康支气管上皮细胞以及患者来源的肺类器官的三维培养。²⁰.

方案

从当地屠宰场获取年轻（1-2岁）牛供体的新鲜原代肺组织，并将其置于密封塑料容器中冰上运输至实验室。动物屠宰用于普通肉类消费（肺组织作为废弃物丢弃），与本研究无关，亦非因本研究而进行。我们确认该屠宰场遵守国家关于动物屠宰的法律法规。此外，我们确认仅使用了废弃材料，且本研究项目未对屠宰动物数量产生任何影响。

1. 器官收获与组织制备

1. 将新鲜获取的牛肺组织在 -80 °C 下保存，直至实验使用。
2. 实验当天，将冷冻的肺组织在室温下解冻。
3. 使用无菌手术刀和剪刀解剖组织，去除气管和软骨性气道，并进一步切成小块（5 mm³）。
4. 用含有 2% 青霉素/链霉素（P/S）的超纯水彻底清洗至少 3 次。

2. 组织脱细胞

注意：采用两种不同的方案对天然牛肺组织进行脱细胞处理。

1. 冻融法
   1. 按照步骤1准备组织样本。将剪碎的组织浸入无菌蒸馏水（dH₂O）中含2%碘溶液中1分钟。用无菌dH₂O连续洗涤两次。
   2. 将剪碎的组织块转移至50 mL离心管中，液面高度不超过15 mL，并使用便携式液氮容器进行五次手动冻融循环。用无菌dH₂O将离心管加满，在液氮中冷冻2分钟。2分钟后立即转移至37 °C水浴中解冻10分钟。此过程构成一次冻融循环。
   3. 将样本与30 mL DNase溶液（10 U/mL）在10 mM MgCl₂ 缓冲液（pH 7.5）中于37 °C孵育1小时，同时以100 rpm持续振荡。
   4. 在100 rpm持续振荡条件下，用无菌dH₂O进行为期3天的充分洗涤，每24小时更换一次溶液。
   5. 按如下方法进行冷冻干燥和低温研磨²⁰：将湿态dECM样本在-80 °C下冷冻24小时。将冷冻后的样本转移至冷冻干燥机中，在真空条件下干燥模式运行3至4天，直至完全干燥。冻干完成后，使用研磨装置和干冰将样本研磨成细粉。
      注：由于该细粉在后续消化过程中的溶解性更佳，因此认为达到此细粉状态十分必要。
2. Triton-X-100法
   1. 按照步骤1准备组织样本。将肺组织在4 °C下以1% Triton-X-100溶液轻柔旋转处理3天，每24小时更换一次溶液。
   2. 将样本在10 mM MgCl₂ 缓冲液（pH 7.5）中与DNase溶液（10 U/mL）于37 °C孵育1小时，同时持续振荡。
   3. 在轻柔旋转条件下，用无菌dH₂O进行为期3天的充分洗涤，每24小时更换一次溶液。
   4. 按照步骤2.1所述方法进行冷冻干燥，随后进行低温研磨。

3. 胃蛋白酶消化

1. 将粉末状 dECM 样品以 15 mg/mL（w/v）的浓度置于胃蛋白酶溶液（1 mg/mL 胃蛋白酶，0.01 M HCl，pH 2）中进行消化。在室温下持续搅拌消化 48 小时，并频繁调节溶液 pH 值以确保有效消化。
2. 将消化产物转移至离心管中，在5000 x g条件下离心 g 10 分钟
3. 收集上清液，并通过加入5 M NaOH和10×磷酸盐缓冲液（PBS）将其中和并调节至生理条件（pH 7，1×磷酸盐缓冲盐水（PBS））。
   注意：建议使用浓碱溶液来调节酸性消化液的pH值，因为这种方法可避免可能引起的不必要体积膨胀 对后续步骤中的凝胶化产生不利影响。
4. 将预凝胶消化产物于 −20 °C 保存，以备后续研究。

4. 组织学染色

1. 取少量（5 mm³）脱细胞组织样本，置于1 mL 3.7%甲醛溶液中，4 °C条件下固定过夜。
2. 将组织置于含有1 mL PBS配制的30%蔗糖溶液的离心管中，4 °C条件下缓慢摇动孵育12小时。
3. 为将组织包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，先向冷冻模具中加入1 mL OCT，将组织置于模具中央，再在组织上方覆盖2 mL OCT。
4. 将装有组织的冷冻模具置于干冰上，用液氮速冻。当OCT完全变为白色时即完成冷冻，通常需3分钟。将OCT包埋的组织储存于-20 °C，待用。
5. 在-25 °C条件下用恒冷切片机切取10 µm厚的组织切片，置于多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，转移至室温使组织切片在载玻片上融化。切片储存于-20 °C，待用。
6. 为确认脱细胞后细胞核的去除情况，按以下步骤进行苏木精-伊红（H&E）染色。
   1. 室温孵育载玻片10分钟。将载玻片浸入PBS中，随后在染色缸中用50 mL即用型苏木精溶液染色3分钟，再用自来水冲洗3分钟。
   2. 将载玻片浸入95%乙醇中，在染色缸中用50 mL 0.5%醇溶性伊红溶液染色45秒。
7. 进行天狼星红染色以显示脱细胞后胶原成分的保留情况。
   1. 用PBS水化载玻片，随后在染色缸中用50 mL含0.1%天狼星红的苦味酸饱和水溶液染色1小时。
   2. 用0.5%乙酸溶液冲洗载玻片5秒，并依次将所有载玻片浸入70%、95%和100%乙醇中各1分钟，进行逐级脱水。
8. 为分析组织样本中的硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，按以下步骤进行阿利新蓝染色。
   1. 在染色缸中用50 mL含1%阿利新蓝的3%乙酸溶液（pH 2.5）染色30分钟。用流动自来水冲洗载玻片2分钟。
   2. 依次将所有载玻片浸入70%、95%和100%乙醇中各1分钟，进行逐级脱水。 
9. 在样本上滴加0.1 mL封片剂，使用10倍物镜的光学显微镜观察结果。

5. 力学性能表征

1. 使用配备平行板几何结构的流变仪进行振荡流变学测量。
2. 将预冷（4 °C）下板上保持在冰上的 250 µL 预凝胶溶液倒入下板，以避免快速凝胶化。
3. 降低 20 mm 平行板，直至预凝胶溶液形成一个两板之间间隙宽度为 1 mm 的圆盘状液层。
4. 立即开始测量。在将下板加热至 37 °C 持续 30 分钟以观察凝胶动力学的同时，以固定频率和应变连续测量储能模量和损耗模量。采用 0.5 Hz 的固定频率和 0.1% 的应变。
5. 当储能模量值停止上升并达到平台期后，进行蠕变-恢复测试。
6. 对水凝胶施加 1 Pa 的剪切应力持续 15 分钟，测量应变，随后解除样品上的应力，并记录接下来 15 分钟内应变值的变化。
7. 绘制应变随时间变化的曲线图，以展示应力松弛行为。对三种不同的脱细胞细胞外基质（dECM）消化液分别进行三次重复测量。

结果

脱细胞化
通过物理（冻融）和化学（Triton-X-100）方法已成功实现牛肺组织的脱细胞化，以制备能够模拟天然肺微环境的脱细胞外基质（dECM）水凝胶。解剖后，组织块用含有抗生素的去离子水（dH₂O）清洗，以去除可能影响dECM水凝胶无菌性的病原体。在冻融法中，共进行五次从液氮到37 °C水浴的循环处理，以破坏细胞结构。在第二种脱细胞化方法中，将天然肺组织块置于1% Triton-X-100溶液中，在持续搅拌条件下处理3天。在这两种方法中，将肺组织切成小块至关重要，这有助于溶液扩散至组织核心区域，并促进细胞核内容物的物理性破坏。作为脱细胞化的首个可视化指标，在两种方法中经过多次循环处理后，组织的粉红色逐渐转变为灰白色。此外，去除残留DNA也极为关键，本方案中通过DNase处理实现该步骤。并且，在两种方法完成脱细胞化后，组织均在添加抗生素的dH₂O中充分洗涤3天，以维持组织的无菌状态。另一个需要注意的要点是，在将dECM消化物中和并缓冲至生理条件的过程中，所有溶液均经过滤除菌以确保无菌性，并置于冰上以防止水凝胶过早形成。最终，肺dECM水凝胶通过热诱导...

讨论

器官来源的水凝胶已成为有前景的模型，可重现天然组织的细胞外基质（ECM）并模拟器官特异性细胞功能。尽管脱细胞肺ECM已常用于组织工程，但对生物材料成分和机械性能进行系统表征，将有助于更深入理解细胞-ECM相互作用在稳态或疾病过程中如何被调控。特别是，对重构水凝胶的机械性能（如刚度和黏弹性）进行评估与控制具有重要意义，因为这些特性已被证实可调节多种细胞行为。因此，从生化成分和机械性能两个方面，比较和评估不同脱细胞方法在制备脱细胞ECM（dECM）水凝胶中的效果至关重要。^20,23此处展示了两种不同的牛肺脱细胞方法：冻融循环法，主要基于机械性破坏及DNA含量的去除；以及使用常用去污剂Triton-X-100进行细胞核内容物的化学去除。图1）。对于冻融法，必须确保所有组织样本在液氮和水浴之间通过自动化且重复的流程进行充分冷冻和适当解冻²⁴为了实现这一点，可将组织样本分装至多个管中，浸入液氮容器内进行冷冻，随后放入水浴中解...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	ISOLAB	64-17-5
乙酸	ISOLAB	64-19-7
阿利新蓝溶液	Sigma-Aldrich	B8438
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 流变仪	TA Instruments
Entellan 封片介质	Merck	107960
伊红溶液	Bright-slide	2.BS01-105-1000
甲醛	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
盐酸	Merck	100317
碘	Sigma-Aldrich	3002
氯化镁	Sigma-Aldrich	7786-30-3
梅氏苏木精染色液	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583
青霉素/链霉素	Biowest	L0018-100
猪胃黏膜来源胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	P6887
苦味酸	Polysciences	88-89-1
天狼星红	Polysciences	09400-25
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
吐温-100	Merck	112298