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推拿干预碘乙酸钠注射诱导的大鼠膝骨关节炎模型

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DOI：

10.3791/65770

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2024年1月12日

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1Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 6Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了推拿干预碘乙酸钠注射诱导的大鼠膝骨关节炎（KOA）模型的方法，为推拿在KOA动物模型中的应用提供了参考。本方案还研究了推拿治疗KOA的有效机制，研究结果将有助于推动其临床应用。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是慢性疼痛和功能障碍，可进展为关节不可逆的结构损伤。研究膝关节炎中关节软骨、肌肉、滑膜及膝关节周围其他组织之间的关联具有重要意义。目前，KOA 的管理包括生活方式调整、运动、药物治疗和手术干预；然而，对于 KOA 相关疼痛复杂机制的阐明仍显不足。因此，KOA 疼痛仍是临床治疗中的关键挑战和重点干预目标。推拿已被发现对运动系统、免疫系统和内分泌系统具有调节作用，这促使人们探索推拿是否能够缓解由炎症因子上调所引起的 KOA 症状，以及骨骼肌中的炎症因子是否可能加剧 KOA 的进展。

将32只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（180-220 g）随机分为四组，每组8只：抗PD-L1联合推拿组（A组）、模型组（B组）、推拿组（C组）和假手术组（D组）。对A、B、C组大鼠，向右膝关节腔内注射25 µL单碘乙酸钠（MIA）溶液（4 mg MIA溶于25 µL无菌生理盐水中）；D组则注射等量的无菌生理盐水。所有组别在注射前以及注射后第2、9、16天，依次采用从最不具应激性到最具应激性的测试方法进行评估，包括足底机械缩足阈值、热缩足潜伏期、右膝关节肿胀度、Lequesne MG评分和皮肤温度。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性骨关节炎，其特征是慢性疼痛和功能障碍，较严重的KOA将导致关节不可逆的结构损伤1。全球范围内KOA的高患病率已成为重大的公共卫生挑战2,3，严重影响患者的生活质量4,5。研究表明，全球有超过2.6亿人受KOA影响6。随着人口老龄化，中国40岁以上人群KOA的总患病率高达17.0%，给患者家庭带来沉重负担7,8。

根据中医理论，膝骨关节炎（KOA）属于"痹证"9范畴，《黄帝内经》将筋、骨、肉与痹证相联系。因此，在KOA中，我们需要关注软骨、肌肉、滑膜以及膝关节周围其他组织之间的关联。在现代医学中，肌肉和骨骼的炎症作为关节炎免疫稳态的主要组成部分，推动了KOA疼痛的进展。然而，大多数研究集中于骨关节的软骨炎症和滑膜炎症，关于骨骼肌中炎症现象的研究报道较少。因此，需要开展更多关于骨骼肌在炎症中作用的研究，以更全面地理解KOA，并为更有效的治疗策略提供思路。通过文献回顾，我们发现抑制免疫相关因子程序性死亡配体1（PD-L1）会加剧KOA的进展10,11，且KOA患者骨骼肌中IL-15和FOXO1存在差异表达12，终末期KOA患者还表现出显著的骨骼肌炎症，并与步态改变相关。已有研究表明，骨骼肌可分泌与炎症免疫密切相关的因子，如IL-6，而TNF-α也与PD-L1通路及KOA密切相关13,14,15。

目前，膝骨关节炎（KOA）的可用治疗方法包括体重控制、运动、药物治疗和手术，通常涉及关节腔内注射、镇痛药物、关节镜手术以及膝关节周围截骨术16。目前尚无法完全阻止或逆转KOA的疾病进展，且由于对KOA疼痛背后的复杂机制缺乏清晰认识，KOA患者存在镇痛药物过度使用及高发副作用的风险8。大多数治疗策略仅在短期内有效，且仅关注症状的暂时缓解，而非针对疾病的发病机制。因此，KOA疼痛仍是治疗中的重点和难点，构成了严峻的临床挑战。然而，在KOA治疗中，推拿可通过直接刺激受累关节周围的骨骼肌，提供一定的治疗益处。结合前述描述，推拿是研究骨骼肌组织在KOA中作用的理想疗法，明确骨骼肌组织在炎症中的作用也可为KOA的推拿治疗提供更充分的理论支持。

研究表明，按摩疗法、整骨手法治疗和脊柱操作有助于缓解疼痛并恢复身体功能17,18。这些手法可通过外部机械作用影响局部炎症，缓解痉挛和镇痛。它们可减轻全膝关节置换术后的疼痛，减少镇痛药物的使用，促进术后恢复，并改善生物力学平衡19。瑞典式按摩在治疗骨关节炎方面具有可行性，能够减轻压力并提高生活质量20。已有一定研究探讨了推拿对膝骨关节炎（KOA）的治疗效果。

在本实验中，我们的研究团队将基于大鼠MIA诱导的膝骨关节炎（KOA）模型，探讨骨骼肌中PD-L1及相关炎症因子的表达是否可诱导KOA并促进其发展。同时将实施推拿干预，观察其是否能够缓解因炎症因子表达升高所导致的KOA症状。推拿将与PD-L1抑制剂联合应用，以阐明推拿通过调控骨骼肌中PD-1通路影响KOA发展及疼痛的关联机制，为后续深入研究推拿干预KOA的多层面治疗机制奠定基础。

综上所述，本文从免疫炎症因子表达的角度，结合行为学相关指标，探讨并阐明了骨骼肌炎症在膝骨关节炎（KOA）及其疼痛发生发展中的作用机制，以及推拿对KOA的治疗效应，为推拿治疗KOA提供现代研究依据 "肌腱与骨的失衡" 中医理论

方案

所有实验均经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准并监督（批准编号：SYXK2018-0040），符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》的规定。

1. 动物准备

  1. 将32只8周龄、体重180-220 g的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠饲养于特定病原体阴性环境中，温度为24 ± 2 °C，湿度60%，光照周期为12 h明/12 h暗，并给予标准啮齿类颗粒饲料。所有动物实验操作均符合实验动物福利伦理及动物实验安全规范。
  2. 经过1周适应性喂养后，将大鼠随机分为四组，每组8只，分别为：抗PD-L1联合推拿组（A组）、模型组（B组）、推拿组（C组）和假手术组（D组）。

2. 膝关节内注射单碘乙酸钠（MIA）

注意：除D组外，所有组均通过向膝关节腔内注射MIA制备KOA大鼠模型。对于D组，向右侧膝关节腔内注射25 µL无菌生理盐水。

  1. 将大鼠置于麻醉箱中，通入2.5%异氟烷直至其完全麻醉。通过观察幼年大鼠仰卧、四肢停止活动，并对脚趾夹捏（屈肌反射）、眼睑反射及肌肉松弛无反应，确认其已完全麻醉。
  2. 为防止麻醉期间眼部干燥，需在麻醉后的幼年大鼠眼部涂抹宠物眼膏并滴加眼药水。
  3. 剃除大鼠右侧后肢的毛发，并用碘伏和75%乙醇交替消毒膝关节三次。
  4. 为保持实验条件标准化，需将膝关节屈曲精确固定在90°，确保髌韧带朝上。随后，将25 µL MIA溶液（含4 mg MIA溶于25 µL无菌生理盐水中）注入大鼠右侧膝关节腔。
    注：该注射操作使用专用微量注射器完成，以确保操作的准确性和一致性21,22,23。注射后将大鼠放回笼中，直至其苏醒。手术后的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
  5. 研究结束时，通过注射1%戊巴比妥钠（剂量为100 mg/kg）对大鼠实施安乐死。

推拿的实施

注意：推拿的实施将由相关理论指导 "对于肌腱与骨骼失衡的患者，需先处理肌腱问题"A组和B组均在模型成功评估后的第一天开始干预，两组均每天操作一次，持续14天。其余两组在14天内仅进行观察，不施加任何干预措施。操作人员在实验前必须接受严格培训，以确保操作力度、频率和节奏的一致性。

  1. 准确定位大鼠的穴位，包括 EX-LE4、ST35、SP10、ST34、SP9 和 GB34（图1 和 表1），使用实验性针灸法进行指揉操作24。
  2. 将大鼠固定于俯卧位的固定装置上。
  3. 待大鼠安静且下肢放松后，用拇指和食指同时揉按患侧肢体的 EX-LE4 和 ST35 穴位，持续 4 分钟，频率为 120–140 次/分钟。
  4. 用拇指和食指揉按患侧肢体前侧及内外侧肌群，持续 3 分钟，频率为 120–140 次/分钟，重点作用于 SP10、ST34 及膝关节附近的肌肉。对僵硬的肌肉进行重点操作，力度以大鼠不挣扎为宜。
  5. 用拇指、食指和中指自上而下揉按患侧小腿后侧肌群，持续 3 分钟，频率为 120–140 次/分钟。为充分暴露治疗区域，可用无名指和小指固定患肢踝关节，并轻柔牵拉患肢。重点作用于 SP9、GB34 及膝关节附近的肌肉，针对僵硬肌群施以适当力度，以大鼠不挣扎为宜。

4. 行为指数的测量

  1. 足底机械痛阈值的测定
    注意：在MIA注射前1天以及注射后2、9和16天测定足底机械痛阈值。
    1. 将大鼠置于安静、室温（22 ± 2）°C环境下，底部为不锈钢网格、笼身为塑料材质的足底测试室中，适应30分钟。
    2. 使用直径为0.8 mm的塑料测试针的电子机械痛觉测试仪，垂直刺激大鼠右后足中央区域。均匀且逐渐增加刺激强度，直至大鼠出现缩足和回避反应。
    3. 记录电子屏幕上的读数，作为大鼠右足底机械痛阈值。
    4. 每只大鼠连续测量5次，每次间隔5分钟。
    5. 从5个数值中去除最大值和最小值，采用截尾均值法取中间三个数值的平均值作为结果（表2）。
  2. 足爪机械缩足阈值的测定
    注意：在MIA注射前1天以及注射后2、9和16天测定足爪机械缩足阈值。
    1. 将大鼠置于安静、室温（22 ± 2）°C环境下，底部加热至30 °C的玻璃平台、笼身为塑料材质的足底测试室中，适应30分钟。
    2. 使用光源加热装置，以65 °C的刺激温度刺激右后足底中心区域，直至大鼠出现缩足和回避反应。
    3. 记录电子屏幕上的时间读数，作为大鼠右足底热痛阈值。
    4. 每只大鼠连续测量5次，每次间隔5分钟。
    5. 从5个数值中去除最大值和最小值，采用截尾均值法取中间三个数值的平均值作为结果（表3）。

5. 右膝关节肿胀程度的测量

注意：在 MIA 注射前 1 天以及注射后 2、9 和 16 天，测量大鼠右膝关节的肿胀程度。

  1. 将大鼠放入麻醉箱中，用2.5%异氟烷麻醉，直至完全麻醉。
  2. 将大鼠平放在手术台上。
  3. 使用游标卡尺测量右侧膝关节的宽度（图2 和 Table 4）。

6. Lequesne MG 评分的测量

注意：在注射MIA后的第2、9和16天测量大鼠的Lequesne MG评分。Lequesne等人开发了一种用于评估髋关节骨关节炎严重程度的指数（ISH），可用于评价治疗干预措施的有效性。我们考虑以下四个参数：疼痛刺激、步态改变、关节活动度和关节肿胀。

  1. 将大鼠置于室温（22 ± 2）°C 的安静环境中进行操作平台处理。
  2. 由两名彼此盲法的操作人员分别测量局部疼痛刺激反应、步态变化、关节活动度及关节肿胀情况。
    1. 用塑料测试针刺激右侧膝关节外侧，根据反应按 0–3 分进行评分：0 分为无反应；3 分为反应良好；1 分为患肢收缩；2 分为患肢收缩并伴有痉挛，同时出现轻微的全身反应，如颤抖、舔舐和吮吸。
    2. 将大鼠放置于操作台上，观察其右侧后肢的步态。根据反应按 0–3 分进行评分：0 分为患肢运动无异常，奔跑正常且步伐有力；3 分为患肢无法参与行走，不能触地或踏地；1 分为奔跑时有轻度跛行但踏地有力；2 分为患肢参与行走，但大鼠运动障碍（跛行）明显。
    3. 用手被动屈伸大鼠右侧膝关节，观察关节活动度。根据反应按 0–3 分进行评分：0 分为关节活动角度大于 90°；3 分为关节活动角度小于 15°；1 分为关节活动角度在 45°–90°之间；2 分为关节活动角度在 15°–45°之间。
    4. 触摸大鼠右侧膝关节，并与正常大鼠反应进行比较。根据反应按 0–2 分进行评分：0 分为无明显肿胀且可见骨性标志；2 分为明显肿胀且骨性标志不可见；1 分为轻度肿胀且表浅骨性标志可见。
    5. 将上述各项评分相加，得到每只大鼠的 Lequesne MG 评分，并采用截尾法计算平均值（表 5）。

7. 皮肤温度的测量

注意：在注射 MIA 前 1 天以及注射后 9 天和 16 天测量皮肤温度。

  1. 将大鼠放入麻醉箱中，通入异氟烷，直至大鼠完全麻醉。
  2. 将大鼠置于手术台上的侧卧位，室温保持在 (22 ± 2) °C。
  3. 用手轻轻握住大鼠右后肢足部，伸直右膝关节。使用Flir红外相机拍摄，以确定皮肤温度。
  4. 使用配套的图像编辑软件读取大鼠膝关节及周围区域的皮肤温度。在踝关节和膝关节处设置控制点，这些位置的温度呈逐渐下降趋势。

8. 统计分析

  1. 使用统计软件将实验数据表示为四分位数。
  2. 采用截尾均值法处理离群值。行为学测试的结果以均值 ± 均值标准误表示。
  3. 采用独立样本t-检验进行组间比较。使用双因素重复测量方差分析（ANOVA）分析行为学数据，随后进行Bonferroni多重比较检验。若数据不符合正态性或方差齐性，采用非参数检验（Kruskal-Wallis k样本检验）。
    注意：P < 0.05 表示差异具有统计学意义。所有数据均满足所应用统计检验的前提假设。

结果

该方案在中国上海岳阳中西医结合医院的临床环境中实施。图1展示了在大鼠身上按压的各个穴位的确切位置，表1列出了刺激这些穴位的常见益处。表2和表3提供了有力证据，表明即使在未抑制PD-1通路的情况下，推拿治疗仍可实现显著的镇痛效果。表4、表5以及图2中的研究结果进一步说明了推拿治疗与膝骨关节炎（KOA）进展之间的相关性，提示手法治疗可能作为辅助手段，用于改善大鼠KOA症状的管理。我们对手法治疗联合抗PD-L1（MTA）组的每只大鼠在MIA诱导骨关节炎3天后，注射200 µg剂量的抗PD-L1抗体以阻断该通路。随后，在骨关节炎造模后第3天起，每隔2天对大鼠的穴位（包括EX-LE4、ST35、SP10、ST34、SP9和GB34）进行一次手法治疗，采用指揉法，持续2周。

大鼠穴位示意图，显示大鼠模型上穴位GB34、ST35、SP9的示意图。
图1：大鼠穴位位置示意图。 请点击此处查看本图的高清版本。

膝骨关节炎肿胀比较；箱线图；统计分析；治疗效果
图2：大鼠膝关节不同程度的肿胀。 可通过推拿控制肿胀。在阻断 PD-L1 通路之前，测量右膝关节直径（注射 MIA 的膝关节）（1月19日）th）并在1周后再次测量。在PD-L1阻断后，推拿控制膝关节肿胀的效果变得不再显著。***代表 P < 0.0001，** 代表 P < 0.01，* 表示 P < 0.05). 请点击此处以查看此图的放大版本。

穴位功能
EX-LE4缓解膝部肿胀和疼痛
ST35缓解关节屈伸不利
SP10缓解股内侧疼痛
ST34干预关节瘫痪
SP9缓解膝痛
GB34缓解下肢瘫痪

表1：刺激这些位点的效果。

基线1周2周
实验组A58.0129.6127.9
(抗PD-L1 + 推拿)
实验组B31.762523.52
(模型组)
实验组C34.1532.4537.53
(推拿组)
实验组D40.2643.9351.3
(假手术组)

表2：各组在基线期（PD-L1阻断当天）、成功诱导后1周及2周时的机械痛阈值比较 表中的数据为当天各组测量值的平均值。 P 任意两组之间的值为 <0.05，但以下情况除外 P A组与B组之间的数值差异。

基线1周2周
A组9.676.727.82
(抗PD-L1 + 推拿)
B组7.57.256.39
(模型组)
C组11.678.639.26
(推拿组)
D组12.810.810.14
(假手术组)

表3：成功诱导后基线、1周及2周时各组热痛阈值的比较 表中的数据为当天各组测量值的平均值。 P 任意两组之间的值为 <0.05，但以下情况除外 P A组与B组之间的数值差异。

基线1周2周
A组10.9611.6810.56
(抗PD-L1 + 推拿)
B组11.312.1811.79
(模型组)
C组11.7510.8810.35
(推拿组)
D组10.811.2310.49
(假手术组)

表4：各组在成功诱导后基线、1周及2周时膝骨关节炎肿胀程度的比较 表中的数据为当天各组测量值的平均值。 P 任意两组之间的值为 <0.05，但以下情况除外 P A组与B组之间的数值差异

基线1 周2 周
实验组 A3.134.253.88
(抗PD-L1 + 推拿)
实验组 B2.634.54.75
(模型组)
实验组 C2.751.882.25
(推拿组)
实验组 D000
(假手术组)

表5：成功诱导后基线、1周及2周时各组间Lequesne MG指数的比较 表中的数据为当天各组测量值的平均值。 P 任意两组之间的值 <0.05，除非另有说明 P A组与B组之间的数值差异。

讨论

本研究旨在通过标准化的行为学指标评估推拿干预对膝骨关节炎（KOA）的改善效果，并探讨推拿治疗KOA的作用机制以及骨骼肌与KOA之间的关联。与药物和手术治疗不同，推拿对运动系统、免疫系统和内分泌系统具有积极的调节作用。推拿可通过作用于不同靶点缓解疾病引起的炎症和疼痛。例如，通过调控TLR4通路和miRNA，推拿可抑制胶质细胞的活化，调节异常的脑功能，调控下游炎症性细胞因子，并抑制外周炎症反应25,26,27同时，推拿还可干预慢性疼痛疾病中功能失调的自主神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴，从而有助于恢复自主神经系统的稳态，并触发免疫内分泌反应，通过调节内分泌和生理过程缓解疼痛。28,29,30此外，当推拿对外部肌肉进行刺激时，可引起副交感神经兴奋31和血管外压力 体外 引起骨骼肌收缩和血管扩张，从而促进充血反应并增强代谢32,33因此，作为一种非药物、非手术治疗手段，推拿是缓解膝骨关节炎（KOA）症状的一种有前景的疗法。

我们还综述了有氧运动、中医药（TCM）及电针疗法对碘乙酸钠（MIA）诱导的膝骨关节炎（KOA）模型治疗作用的相关文献。有氧运动可通过调节TRPV5的表达来抑制软骨细胞凋亡，而有氧运动联合盐酸氨基葡萄糖胶囊可能具有更显著的疗效34,35从中药中提取的化合物（如蔓荆子素和香草酸）可减轻膝骨关节炎滑膜炎症及疼痛相关行为/介质 体内从中药中提取的化合物，例如蔓荆子黄素和香草酸36可减轻膝骨关节炎中 KOA 滑膜炎症及疼痛相关行为/介质 体内此外，香草酸可通过抑制NLRP3炎症小体的活化来保护膝关节37此外，电针已被证明能够抑制NLRP3炎症小体并减少细胞焦亡，从而保护软骨组织并治疗膝骨关节炎（KOA）38.

与中医（TCM）不同，推拿在临床治疗中需要运用多种形式的操作手法，结合多种技术及患者的被动运动，这往往使初学者在选择适当的手法、作用部位和施力强度时面临困难。此外，推拿治疗后疗效的评估是手法治疗中的主要挑战，因为目前大多局限于患者的主观描述，缺乏客观数据来评价治疗方法与实践效果。因此，本研究旨在探讨骨骼肌炎症在膝骨关节炎（KOA）发生发展及疼痛形成中的作用机制，并基于MIA诱导的大鼠KOA模型，结合行为学及炎症相关因子指标，考察推拿对KOA的治疗效果。同时，由于推拿是以理论为指导的 "对于肌腱与骨骼失衡的患者，应先处理肌腱问题"因此，将采用《实验针灸学》中的大鼠穴位定位列表，精确定位 EX-LE4、ST35、SP10、ST34、SP9 和 GB34 穴位，并实施指揉法。操作人员在干预前须接受严格培训，以确保手法的力度、频率和节律保持一致。

表2 和 表3 提供了证据，表明推拿在未阻断PD-1通路的情况下显著缓解了疼痛。表4、表5 以及 图2 的结果进一步揭示了推拿实施与膝骨关节炎（KOA）进展之间的关系，提示手法治疗可作为KOA的辅助治疗手段，以改善大鼠的KOA症状。因此，推拿治疗可能是对抗KOA进展的一种有效干预措施；然而，仍需更深入的研究来阐明其作用机制。

此外，本实验方案存在一些局限性。首先，由于存在过度活跃或活动较少的大鼠，且机械性疼痛的测量可能存在一定误差，因此每次测量需要定时进行，并在每次测量之间保持规律的时间间隔。其次，本实验设计旨在研究MIA诱导的膝骨关节炎（KOA）大鼠模型，推拿治疗的临床疗效仍需进一步研究加以阐明。然而，我们团队重点关注KOA对骨骼肌的影响、推拿对肌肉及KOA的改善作用及其与PD-1通路的关系，旨在探讨推拿干预KOA的作用机制。未来，我们将致力于提升手法治疗的可行性、安全性和有效性，并进一步开展推拿对骨骼肌临床疗效的研究。在研究肌腱与骨骼关联、KOA发病机制以及手法治疗干预机制的同时，我们也希望将本研究的成果和思路应用于其他疾病的研究中。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（编号：82105042，82205302）；上海市“超级博士后”激励计划（编号：2020371）；中国博士后科学基金（编号：2021M692156）；上海市扬帆计划（编号：20YF1450900）；上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院科研基金（编号：2021yygq03）资助。资助方在研究的设计、实施及撰写过程中均未发挥任何作用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗PD-L1抗体Abcam, Cambridge, MA, USAab80276
电动von Frey感觉计 IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USAALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0GraphPad Software用于统计分析的软件
单碘乙酸钠Sigma-Aldrich IncI9148溶于生理盐水用于注射
戊基巴比妥钠Sigma-Aldrich IncP3761
雄性Sprague Dawley (SD) 大鼠上海吉辉实验动物养殖有限公司编号 SCXK (沪) 2017-0012
热痛觉测试仪IITC/Life Science型号 390

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