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方法文章

代谢失活细菌的方法学 秀丽隐杆线虫 研究

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DOI：

10.3791/65775

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2023年7月28日

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

食物来源 秀丽隐杆线虫 在实验室中是活体的 大肠杆菌由于细菌具有代谢活性，它们在代谢和药物研究中会成为一个混杂变量 秀丽隐杆线虫 一种使用多聚甲醛对细菌进行代谢灭活的详细实验方案如下所述。

摘要

Caenorhabditis elegans 是遗传学、发育、衰老、代谢和行为研究中常用的一种模式生物。由于 C. elegans 以活细菌为食，其食物来源的代谢活性可能会干扰旨在探究各种干预措施对线虫直接效应的实验。为避免细菌代谢带来的混杂效应，C. elegans 研究人员已采用多种方法对细菌进行代谢失活，包括紫外线（UV）照射、热灭活和抗生素处理。紫外线处理通量相对较低，且不能用于液体培养，因为每块平板都需检测细菌是否被成功杀灭。第二种方法——热灭活，会负面影响细菌的质地和营养质量，导致 C. elegans 发育停滞。最后，抗生素处理除了抑制细菌生长外，还可能直接改变 C. elegans 的生理状态。本论文介绍了一种使用多聚甲醛（PFA）对细菌进行代谢失活的替代方法。PFA 处理可通过交联细菌细胞内的蛋白质来阻断其代谢活性，同时保持细胞结构和营养成分。该方法通量高，既可用于液体培养，也可用于固体平板；只需检测一批 PFA 处理细菌中的一个平板是否无菌生长，即可验证整批样品的有效性。通过 PFA 处理实现的代谢失活，可用于消除细菌代谢对药物或代谢物补充、应激抗性、代谢组学以及 C. elegans 行为研究中产生的混杂影响。

引言

Caenorhabditis elegans 于1965年首次被提出作为模式生物1，此后已广泛应用于遗传学、发育、行为、衰老和代谢研究2。由于其子代数量多且体壁透明，C. elegans 特别适用于使用荧光报告基因进行高通量筛选3。其较短的生命周期、雌雄同体的繁殖方式以及与人类基因的高度同源性，也使C. elegans 成为发育4和衰老生物学研究中的重要模型系统5。此外，C. elegans 易于培养，可在液体培养基或固体琼脂平板上生长，并以活的Escherichia coli OP50细菌为食4。

然而，活体食物来源的 秀丽隐杆线虫 可能影响对代谢、药物补充和行为的研究。由于活细菌具有自身的代谢活动，影响细菌的实验条件也会改变线虫可获取的营养物质和代谢物。例如，细菌中铁、氨基酸和叶酸浓度的差异会对线虫产生多种影响 秀丽隐杆线虫 发育、生理学与寿命6许多常见的实验室操作会引发OP50菌株营养成分和代谢产物的变化。特别是暴露于5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）——一种常用于抑制线虫繁殖的化合物——可导致此类变化 秀丽隐杆线虫，引起OP50基因表达的广泛变化，包括氨基酸生物合成通路7活细菌也可能干扰某些研究中的实验结果 秀丽隐杆线虫 通过添加小分子化合物来补充，因为细菌可能部分或完全代谢这些活性化合物。此外，这些小分子对细菌的作用反过来也可能改变 秀丽隐杆线虫 生理学效应，正如先前报道的延长寿命药物二甲双胍所显示的那样8最后，活细菌可通过分泌具有吸引力的气味物质等方式改变线虫的生活环境，从而影响其行为。9，产生外源性神经调节物质10，并在密集的细菌菌苔中建立氧气梯度11.

为了减轻细菌代谢对C. elegans研究的干扰，已开发出多种杀灭细菌的方法（表1）。杀灭OP50的三种常用策略包括紫外线照射、热灭活和抗生素处理。尽管这些方法操作简单且成本相对较低，但每种方法都可能对细菌和C. elegans产生不良影响。通过紫外交联仪进行紫外线灭菌12通量较低，其处理速度受限于紫外交联仪中可容纳的培养皿数量。此外，同一批次内不同培养皿间的紫外线灭菌效果可能存在差异，在大规模实验中对所有培养皿进行生长检测会变得困难。通过将菌液暴露于>60 °C高温来热灭活OP50则面临另一组挑战。高温可能破坏线虫所需的关键营养成分，并破坏细菌的细胞结构，导致食物质地变软，从而减少线虫在食物上的停留时间13。此外，该方法无法在整个C. elegans生命周期中使用，因为以热灭活细菌为食的线虫可能在发育早期即发生生长停滞13。抗生素处理是抑制细菌代谢的第三种常用方法14，但抗生素也可能改变线虫的生长和代谢过程15。

一种在保留细菌结构和必需营养成分的同时消除活菌代谢效应的方法是使用多聚甲醛（PFA）灭活OP5016。PFA是甲醛的聚合物，可使细胞内蛋白质发生交联17，从而阻止细菌复制，同时不破坏细胞内结构（如细胞质膜）18。由于细胞内部结构得以保留，经PFA处理的细菌不再具有生长能力或代谢活性，但仍可作为秀丽隐杆线虫（C. elegans）可食用且富含营养的食物来源16。 本文提供了一项详细实验方案，介绍如何使用多聚甲醛对细菌进行代谢失活。

方法所需材料是否可扩展？是否具有营养性？对线虫的影响
紫外线（UV）紫外交联仪受限于：是在NGM培养基上对寿命具有可变影响12, 23, 24
紫外交联仪中可容纳的培养板数量在含氟脱氧尿苷（FUdR）的培养基上对寿命具有可变影响24, 26, 27
每块培养板的照射时间降低摄食偏好16
检查每块培养板上细菌生长状况的能力8
加热>60 °C 恒温培养箱是否：破坏细胞壁，降低营养价值导致发育停滞13
降低摄食偏好13
在NGM培养基上延长寿命31
抗生素抗生素（卡那霉素、羧苄青霉素等）是是延缓生长与发育15
在液体培养基中延长寿命19
在NGM培养基上延长寿命15
多聚甲醛（PFA）0.5% 多聚甲醛是是子代数量轻微减少16
发育时间轻微延长16
降低摄食偏好16

表1. OP50灭活方法的比较。 紫外线灭活、加热灭活、抗生素处理和多聚甲醛（PFA）处理对细菌的营养状态以及饲喂经处理细菌的线虫健康状况具有不同的影响。这些用于复制性失活E. coli的方法在所需材料和可扩展性方面也存在差异。

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方案

1. 细菌接种

  1. 通过将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠（NaCl）溶解于 950 mL 蒸馏水中，制备 LB 培养基（Luria broth）。
  2. 加入 5 M 氢氧化钠（NaOH）将 LB 培养基的 pH 调至 7.0。此过程通常仅需约 0.2 mL NaOH。
  3. 将 pH 调整后的 LB 培养基在液体循环条件下于 15 psi 压力下高压灭菌 45 分钟。待溶液冷却后，室温保存。
  4. 在 500 mL 锥形瓶中的 100 mL LB 培养基中接种单个细菌菌落，并于 37 °C 摇床培养箱中过夜培养。
  5. 根据细菌菌落的生长状态、锥形瓶的大小以及摇床转速的不同，细菌生长所需时间可能有所差异。约 14 小时后，测定细菌在 600 nm 处的光密度（OD）（OD600）。
  6. 当 OD600 达到 3.0（1 × 109 菌落形成单位（CFU）/mL）时，从摇床上取出细菌。若 OD600 低于 3.0，则将锥形瓶放回摇床培养箱中继续培养，直至达到目标 OD 值。
  7. 将细菌分装至 50 mL 离心管中，于 4 °C 保存或直接进行下一步操作。

2. 使用多聚甲醛

注意：所使用的多聚甲醛（PFA）浓度及处理时间可能因气候、地点和所处理细菌种类的不同而有所变化。对于OP50菌株，建议起始条件为0.5% PFA处理1小时，而对于HT115菌株，0.25% PFA处理1小时可能已足够。

  1. 制备32% PFA储备液，或使用市售的32% PFA溶液。操作PFA时应佩戴适当的个人防护装备（PPE），并戴手套和护目用具。
  2. 在通风良好的化学通风橱内添加PFA。含有PFA的洗涤液和移液枪头应丢弃至通风橱内专用的化学危险品容器中。

3. 使用多聚甲醛处理细菌

  1. 当细菌达到 OD600 为 3.0 时，使用血清移液管将 50 mL 转移至新的 250 mL 锥形瓶中。剩余部分保存用于活菌对照、模拟处理对照（见步骤 4），或根据需要同样用 PFA 处理。
  2. 避免将液体从一个锥形瓶直接倾倒至另一个锥形瓶，并注意不要使细菌溅到新锥形瓶的瓶壁上。附着在瓶壁上的菌落可能接收到较低剂量的 PFA。
  3. 在化学通风橱中，向 50 mL 细菌液中加入 781 µL 的 32% PFA，使终浓度达到 0.5%。将使用过的枪头丢弃至固体废弃物化学危险品容器中。
  4. 用铝箔覆盖锥形瓶，并放回 37 °C 摇床培养箱中孵育 1 小时。孵育 1 小时后，从培养箱中取出锥形瓶，进入步骤 5。

4. 模拟处理对照

  1. 当细菌达到 OD600 为 3.0 时，使用刻度移液管将 50 mL 细菌转移至一个 50 mL 锥形管中。
  2. 进行步骤 5.3，完成与 PFA 处理组类似的洗涤步骤。

5. 洗涤细菌以去除残留的PFA

  1. 在化学通风橱中，使用血清移液管将经过处理的细菌从锥形瓶转移至50 mL离心管中。使用血清移液管而非直接倾倒细菌，可避免因瓶口边缘可能存在未经戊二醛（PFA）直接处理的细菌菌落而导致的污染。
  2. 将处理后的细菌在约3000 x g 条件下离心20分钟。在化学通风橱中，将上清液弃入液体废弃物化学危险品容器中。
  3. 加入25 mL LB培养基，并涡旋振荡以重悬菌体沉淀（将离心管完全装满会使沉淀更难重悬）。重复离心和沉淀重悬操作4次。
  4. 根据不同的实验需求，用适量体积重悬沉淀。进行寿命实验时，将10 mL LB培养基中重悬的200 µL细菌接种至60 mm培养皿中。将细菌重悬于10 mL LB培养基中，相当于将原始50 mL培养物浓缩5倍。
  5. 将细菌在4 °C条件下保存。

6. 细菌生长质量检测

  1. 最后一次洗涤并重悬后，用无菌枪头将制备好的细菌划线接种于LB平板。建议同时将用于洗涤和重悬的LB液体也划线接种于另一单独的平板，以确保所用LB未被污染。
  2. 将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。检查是否有菌落生长。若细菌在LB平板上无任何菌落生长，则认为其已失去复制能力（复制性死亡）。

7. 使用呼吸仪检测细菌代谢的质量控制

  1. 完成第5.4步的最终洗涤和重悬后，使用现有工具（如呼吸仪19,20）并测定基础氧消耗率（OCR），确认细菌已处于代谢死亡状态。
  2. 配制M9溶液：将3 g磷酸二氢钾（KH2PO4）、6 g磷酸氢二钠（Na2HPO4）和5 g氯化钠（NaCl）溶解于950 mL蒸馏水中。在15 psi条件下，采用液体循环模式高压灭菌45分钟，随后使溶液冷却至室温。加入1 mL 1 M硫酸镁（MgSO4），室温保存。
  3. 水合呼吸仪检测盒：向96孔板的所有孔中各加入200 µL校准液。将检测盒放入96孔板中，在37 °C培养箱中孵育过夜。
  4. 检测校准：次日，将已水合的检测盒放入仪器中，开始校准程序。
  5. 检测用板的设置：使用新的96孔板，在检测孔中加入160 µL M9溶液和40 µL预处理的细菌（1 × 109 CFU/mL）。在四个角落的孔中各加入200 µL M9溶液作为空白对照孔。在阴性对照孔中加入160 µL M9溶液和40 µL用于洗涤和重悬的LB培养基。其余不使用的孔中各加入200 µL M9溶液。
  6. 运行检测：当检测盒校准完成后，将第7.5步制备的检测板插入仪器进行分析。仪器设置包括混合、等待、测量和循环步骤。结果将以氧消耗率（OCR）形式显示。当OCR为零时，表明细菌已完全代谢失活，可投入使用。

用多聚甲醛处理细菌的过程；实验室操作流程和实验装置示意图。
图1．多聚甲醛处理的工作流程。 将单个 E. coli OP50 菌落过夜培养。加入多聚甲醛（PFA），使其终浓度为 0.5%，将经 PFA 处理的菌液在 37 °C 下振荡孵育 1 小时。最后，用新鲜 LB 培养基洗涤菌液 5 次以去除 PFA。为确认处理后的细菌已丧失复制能力，可将处理后的菌液划线接种于 LB 平板，并过夜培养以观察生长情况。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

该方案的详细工作流程见图1。我们开发并优化了一种高通量方法，可稳定地灭活细菌的复制（图2A）和代谢（图2B），用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中开展代谢和药物相关实验，所用试剂为多聚甲醛（paraformaldehyde）16。本研究的目标是确定能够稳定杀灭细菌所需的最低PFA浓度和最短处理时间，同时不干扰线虫各项健康指标的检测。这些参数可能因实验室环境的不同或细菌菌株的差异而有所变化。例如，HB101菌株经0.25% PFA处理1小时即可实现代谢失活（图2C），而粪肠球菌（Enterococcus faecalis，EF）则需要1.0%的PFA浓度才能获得稳定效果（图2D）。此前已有研究建立了一套适用于各实验室的优化方法

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讨论

与其它细菌灭活方法相比，PFA灭活法的优势
PFA处理是一种高通量方法，可在抑制细菌代谢的同时为秀丽隐杆线虫（C. elegans）提供富含营养的食物来源。相较于其他灭菌方法，PFA处理具有多项优势。与紫外线（UV）处理不同，后者需对每一块培养板进行灭菌效果检测，而PFA处理的菌液只需从同一批次中取单个样品检测即可验证整批处理的有效性16。PFA处理能高效抑制细菌代谢活动（图2B），且与抗生素处理的细菌相比，PFA处理的细菌代谢活性更低19。PFA处理的另一优势在于细菌细胞结构和营养成分得以保持。 因此，线虫可在PFA处理的细菌上正常发育，而以高温灭活的细菌作为食物时，线虫自卵孵化后会出现发育停滞13,16。

关键步...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R21AG059117项目和密歇根大学保罗·F·格伦衰老生物学研究实验室资助。SB由T32AG000114项目资助。ESK由美国国家科学基金会（NSF）DGE 1841052项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝箔Staples2549291
本生灯VWR470121-700 
细胞密度计Denville80-3000-45 
离心机Eppendorf5430
化学通风橱Labcono975050411384RG
锥形管（50 mL）Fisher339652
比色皿 Fisher14-955-127
大肠杆菌 OP50CGCOP50
锥形瓶Fisher250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
接种环Fisher22-363-605
LB 琼脂FisherBP1425500
液体废物收集瓶Thomas Scientific1230G50
硫酸镁（MgSO4）SigmaM7506
多聚甲醛（32%）Electron Microscopy Sciences15714-S多聚甲醛 – 无甲醇溶液
移液器EppendorfEppendorf Easypet 3
塑料培养皿（100 mm）FisherFB0875712
磷酸二氢钾（KH2PO4）FisherP2853
Seahorse XF 校准液Agilent100840-000
Seahorse XFe96 细胞外通量检测试剂盒及细胞培养微孔板Agilent101085-004
血清移液管（50 mL）Genesee Scientific12-107
摇床培养箱Thermo11 676 083
氯化钠（NaCl）FisherS640-3
氢氧化钠（NaOH）FisherS318500
无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）SigmaS374-500
固体废物收集桶M&M Industries 5.0 加仑 M1 传统桶
胰蛋白胨Genesee Scientific20-251
涡旋振荡器Thermo11676331
电子天平C GoldenwallHZ10K6B
酵母提取物Genesee Scientific20-255

参考文献

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