食物来源 秀丽隐杆线虫 在实验室中是活体的 大肠杆菌由于细菌具有代谢活性，它们在代谢和药物研究中会成为一个混杂变量 秀丽隐杆线虫 一种使用多聚甲醛对细菌进行代谢灭活的详细实验方案如下所述。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Caenorhabditis elegans 是遗传学、发育、衰老、代谢和行为研究中常用的一种模式生物。由于 C. elegans 以活细菌为食，其食物来源的代谢活性可能会干扰旨在探究各种干预措施对线虫直接效应的实验。为避免细菌代谢带来的混杂效应，C. elegans 研究人员已采用多种方法对细菌进行代谢失活，包括紫外线（UV）照射、热灭活和抗生素处理。紫外线处理通量相对较低，且不能用于液体培养，因为每块平板都需检测细菌是否被成功杀灭。第二种方法——热灭活，会负面影响细菌的质地和营养质量，导致 C. elegans 发育停滞。最后，抗生素处理除了抑制细菌生长外，还可能直接改变 C. elegans 的生理状态。本论文介绍了一种使用多聚甲醛（PFA）对细菌进行代谢失活的替代方法。PFA 处理可通过交联细菌细胞内的蛋白质来阻断其代谢活性，同时保持细胞结构和营养成分。该方法通量高，既可用于液体培养，也可用于固体平板；只需检测一批 PFA 处理细菌中的一个平板是否无菌生长，即可验证整批样品的有效性。通过 PFA 处理实现的代谢失活，可用于消除细菌代谢对药物或代谢物补充、应激抗性、代谢组学以及 C. elegans 行为研究中产生的混杂影响。
引言
Caenorhabditis elegans 于1965年首次被提出作为模式生物1，此后已广泛应用于遗传学、发育、行为、衰老和代谢研究2。由于其子代数量多且体壁透明，C. elegans 特别适用于使用荧光报告基因进行高通量筛选3。其较短的生命周期、雌雄同体的繁殖方式以及与人类基因的高度同源性，也使C. elegans 成为发育4和衰老生物学研究中的重要模型系统5。此外，C. elegans 易于培养，可在液体培养基或固体琼脂平板上生长，并以活的Escherichia coli OP50细菌为食4。
然而，活体食物来源的 秀丽隐杆线虫 可能影响对代谢、药物补充和行为的研究。由于活细菌具有自身的代谢活动，影响细菌的实验条件也会改变线虫可获取的营养物质和代谢物。例如，细菌中铁、氨基酸和叶酸浓度的差异会对线虫产生多种影响 秀丽隐杆线虫 发育、生理学与寿命6许多常见的实验室操作会引发OP50菌株营养成分和代谢产物的变化。特别是暴露....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 细菌接种
- 通过将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠（NaCl）溶解于 950 mL 蒸馏水中，制备 LB 培养基（Luria broth）。
- 加入 5 M 氢氧化钠（NaOH）将 LB 培养基的 pH 调至 7.0。此过程通常仅需约 0.2 mL NaOH。
- 将 pH 调整后的 LB 培养基在液体循环条件下于 15 psi 压力下高压灭菌 45 分钟。待溶液冷却后，室温保存。
- 在 500 mL 锥形瓶中的 100 mL LB 培养基中接种单个细菌菌落，并于 37 °C 摇床培养箱中过夜培养。
- 根据细菌菌落的生长状态、锥形瓶的大小以及摇床转速的不同，细菌生长所需时间可能有所差异。约 14 小时后，测定细菌在 600 nm 处的光密度（OD）（OD600）。
- 当 OD600 达到 3.0（1 × 109 菌落形成单位（CFU）/mL）时，从摇床上取出细菌。若 OD600 低于 3.0，则将锥形瓶放回摇床培养箱中继续培养，直至达到目标 OD 值。
- 将细菌分装至 50 mL 离心管中，于 4 °C 保存或直接进行下一步操作。
2. 使用多聚甲醛
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
该方案的详细工作流程见图1。我们开发并优化了一种高通量方法，可稳定地灭活细菌的复制（图2A）和代谢（图2B），用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中开展代谢和药物相关实验，所用试剂为多聚甲醛（paraformaldehyde）16。本研究的目标是确定能够稳定杀灭细菌所需的最低PFA浓度和最短处理时间，同时不干扰线虫各项健康指标的检测。这些参数可能因实验室环境的不同或细菌菌株的差异而有所变化。例如，HB101菌株经0.25% PFA处理1小时即可实现代谢失活（图2C），而粪肠球菌（Enterococcus faecalis，EF）则需要1.0%的PFA浓度才能获得稳定效果（图2D）。此前已有研究建立了一套适用于各实验室的优化方法
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
与其它细菌灭活方法相比，PFA灭活法的优势
PFA处理是一种高通量方法，可在抑制细菌代谢的同时为秀丽隐杆线虫（C. elegans）提供富含营养的食物来源。相较于其他灭菌方法，PFA处理具有多项优势。与紫外线（UV）处理不同，后者需对每一块培养板进行灭菌效果检测，而PFA处理的菌液只需从同一批次中取单个样品检测即可验证整批处理的有效性16。PFA处理能高效抑制细菌代谢活动（图2B），且与抗生素处理的细菌相比，PFA处理的细菌代谢活性更低19。PFA处理的另一优势在于细菌细胞结构和营养成分得以保持。 因此，线虫可在PFA处理的细菌上正常发育，而以高温灭活的细菌作为食物时，线虫自卵孵化后会出现发育停滞13,16。
关键步.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R21AG059117项目和密歇根大学保罗·F·格伦衰老生物学研究实验室资助。SB由T32AG000114项目资助。ESK由美国国家科学基金会（NSF）DGE 1841052项目资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝箔 | Staples | 2549291 | |
| 本生灯 | VWR | 470121-700 | |
| 细胞密度计 | Denville | 80-3000-45 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5430 | |
| 化学通风橱 | Labcono | 975050411384RG | |
| 锥形管（50 mL） | Fisher | 339652 | |
| 比色皿 | Fisher | 14-955-127 | |
| 大肠杆菌 OP50 | CGC | OP50 | |
| 锥形瓶 | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 | |
| 接种环 | Fisher | 22-363-605 | |
| LB 琼脂 | Fisher | BP1425500 | |
| 液体废物收集瓶 | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| 硫酸镁（MgSO4） | Sigma | M7506 | |
| 多聚甲醛（32%） | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | 多聚甲醛 – 无甲醇溶液 |
| 移液器 | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| 塑料培养皿（100 mm） | Fisher | FB0875712 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF 校准液 | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 细胞外通量检测试剂盒及细胞培养微孔板 | Agilent | 101085-004 | |
| 血清移液管（50 mL） | Genesee Scientific | 12-107 | |
| 摇床培养箱 | Thermo | 11 676 083 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher | S640-3 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher | S318500 | |
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Sigma | S374-500 | |
| 固体废物收集桶 | M&M Industries | 5.0 加仑 M1 传统桶 | |
| 胰蛋白胨 | Genesee Scientific | 20-251 | |
| 涡旋振荡器 | Thermo | 11676331 | |
| 电子天平 | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| 酵母提取物 | Genesee Scientific | 20-255 |
参考文献
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
