活体线粒体染色在细胞分选中的应用以纯化人诱导性多能干细胞来源的肝细胞

摘要

通过细胞分选可纯化由多能干细胞衍生的肝细胞，该方法结合使用线粒体染色和活化白细胞细胞黏附分子（ALCAM，也称为CD166）染色。

摘要

人类胚胎干细胞（ES）和诱导性多能干细胞（iPS）因其无限增殖能力和多能性，有望应用于基于细胞的再生医学，以治疗严重病变的器官。然而，由于这些细胞对环境高度敏感，将人类ES/iPS细胞分化为100%纯度的目标细胞类型仍具挑战性。移植后发生致瘤性的原因在于残留的、具有增殖能力的未分化细胞，因此，高纯度分离技术对于实现安全的再生医学至关重要。为降低致瘤风险，目前已开发出一种针对人iPS细胞来源肝细胞的高纯度分离技术。该方法采用无需基因修饰的FACS（荧光激活细胞分选）技术，结合线粒体含量高和细胞表面标志物ALCAM（活化白细胞细胞黏附分子）进行分选。使用该方法纯化的肝细胞中，97% ± 0.38%（n = 5）表现出白蛋白蛋白表达。本文旨在详细介绍该技术的操作流程，并将其应用于当前最新的人iPS细胞向肝细胞二维分化的方案中。

引言

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（分别为 ES 和 iPS）被认为是再生治疗中具有前景的细胞来源。然而，即使使用相同的细胞系、实验方案和操作人员，这些细胞向特定目标细胞类型分化的效率也可能存在差异^1,2,3,4。这种差异可能归因于人源 ES/iPS 细胞对环境的高度敏感性。因此，目前难以稳定地获得高纯度的目标细胞。为了实现高度安全的再生医学，必须清除治疗用细胞中的增殖细胞和未分化干细胞，因此开发先进的目标细胞纯化技术至关重要^5,6,7。

细胞分选仪是一种能够瞬时分析单个细胞并根据荧光信号强度对目标活细胞进行分选的装置，提供了一种颇具前景的解决方案。该技术可通过针对细胞类型特异性表面标志物的抗体染色，或利用细胞类型特异性的报告基因表达来实现。已有若干研究报告了利用该技术纯化多能干细胞来源的心肌细胞^8,9,<....

方案

本研究使用了商业获取的人诱导多能干细胞（253G1品系）（参见材料表）。

1. 人类iPS细胞的维持

1. 在涂有0.25 µg/cm² iMatrix-511（参见材料表）的培养皿中，将人iPS细胞在无饲养层条件下于AK02培养基中培养。

2. 人iPS细胞在二维培养中的肝细胞分化

注意：请参考图1A中的肝细胞分化每日时间表。整个过程中使用6孔培养板，每孔加入2 mL指定的洗涤液或培养基。细胞培养条件维持在37 °C、100%湿度、5% CO₂和20% O₂。

1. 用 1 mL 基底膜基质（以 PBS (-) 按 1/25 稀释）包被 6 孔板的每个孔，在 37 °C 下孵育 1 小时。
2. 使用添加了 10 µM ROCK 抑制剂（Y-27632）的 AK02N 培养基，将人 iPS 细胞以 20,000–30,000 个细胞/cm² 的密度传代至包被好的培养皿中（参见 材料表）。次日更换不含 Y-276....

结果

通过二维培养诱导人iPS细胞分化为肝细胞的过程时间线（图1A）及代表性细胞特征（图1B）如图所示。大约在分化第12天，细胞开始呈现多边形细胞形态和圆形细胞核，这是肝细胞的典型特征。部分肝细胞还表现出多核现象。

使用分化第27天的细胞进行FACS分析。为鉴定ALCAM⁺细胞群，图2D、E分别展示了使用与不使用第一抗ALCAM抗体的对照图。通过2D培养诱导肝分化，本实验中肝细胞（P2）群体比例为10.1%，相较于采用3D拟胚体形成方法获得的0.8%（数据未显示）有显著提高。

经分选的 P1 和 P2 细胞培养于经丝裂霉素 C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞上。P2 细胞呈现致密的球形集落形成，而 P1 细胞则呈分散状态且形态较扁平。对人核抗原（hNA）和白蛋白进行的免疫组织化学染色证实了 P2 中肝细胞样细胞的富.......

讨论

由于肝细胞在营养代谢和解毒过程中具有重要功能，与其他细胞类型相比，其含有相对较多的线粒体¹⁵。ALCAM 属于免疫球蛋白超家族，参与细胞黏附和迁移过程。它在多种细胞类型中均有表达，包括肝细胞、上皮细胞、淋巴细胞、髓样细胞、成纤维细胞和神经元细胞¹⁶。通过结合基于线粒体的方法与 ALCAM 抗体，成功鉴定了由人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化而来的肝细胞。

尽管未对纯化的肝细胞进行分泌功能或酶活性的检测，但已验证了人iPS细胞来源的肝细胞中CYP3A4基因的mRNA表达。此外，从人胚胎干细胞来源的拟胚体中分离出的TMRM（高）和ALCAM（+）肝细胞群体，其肝细胞相关基因集（VTN、SERPINA1、CYP1A1、FGB、FGA、FGG、AFP、ALB 和 APOB）的表达水平高于胚胎干细胞来源的心肌细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
253G1 人诱导多能干细胞系	RIKEN 生物资源研究中心	HPS0002
4% 多聚甲醛	FUJIFILM Wako 纯化学公司	163-20145
人源重组 Activin A 溶液	NACALAI TESQUE 公司	18585
抗核抗体，克隆号 235-1	Chemicon	MAB1281	抗人核抗原抗体
B-27 添加剂（50 倍浓度），无血清	赛默飞世尔科技	17504044
BD FACSAria III	BD 生物科学		细胞分选仪
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
环孢素 A	FUJIFILM Wako 纯化学公司	035-18961
胶原酶	FUJIFILM Wako 纯化学公司	034-22363
Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质	Corning	354230	凝胶状基底膜基质
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako 纯化学公司	036-24023	ROCK 抑制剂
地塞米松	FUJIFILM Wako 纯化学公司	047-18863
二甲基亚砜（DMSO）	FUJIFILM Wako 纯化学公司	047-29353
驴抗山羊 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	赛默飞世尔科技	A-11055
驴抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记	赛默飞世尔科技	A10036
驴抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	赛默飞世尔科技	A-21206
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap	Corning	352235
胎牛血清	Biowest	51820-500
GlutaMAX 添加剂	赛默飞世尔科技	35050061	二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
人/小鼠/大鼠/犬 ALCAM/CD166 抗体	R&D Systems	AF1172
氢化可的松 21-半琥珀酸钠盐	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 丝素蛋白	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	封闭液
ITS-G 添加剂（×100）	FUJIFILM Wako 纯化学公司	090-06741
Leibovitz's L-15 培养基	FUJIFILM Wako 纯化学公司	128-06075
N-己酰基-色氨酰-异亮氨酸-(6)-氨基己酰胺（Dihexa）	Toronto Research Chemicals	H293745
多克隆兔抗人白蛋白抗体	Dako	A0001
聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）	NACALAI TESQUE 公司	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako 纯化学公司	189-02025
L-抗坏血酸钠	NACALAI TESQUE 公司	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS（10 倍浓度）	NACALAI TESQUE 公司	12748-31
四甲基罗丹明甲酯（TMRM）	赛默飞世尔科技	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE 公司	28229-25
台盼蓝溶液	NACALAI TESQUE 公司	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
胰蛋白胨磷酸盐肉汤溶液	Sigma-Aldrich	T8159