通过细胞分选可纯化由多能干细胞衍生的肝细胞，该方法结合使用线粒体染色和活化白细胞细胞黏附分子（ALCAM，也称为CD166）染色。
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摘要
摘要
人类胚胎干细胞（ES）和诱导性多能干细胞（iPS）因其无限增殖能力和多能性，有望应用于基于细胞的再生医学，以治疗严重病变的器官。然而，由于这些细胞对环境高度敏感，将人类ES/iPS细胞分化为100%纯度的目标细胞类型仍具挑战性。移植后发生致瘤性的原因在于残留的、具有增殖能力的未分化细胞，因此，高纯度分离技术对于实现安全的再生医学至关重要。为降低致瘤风险，目前已开发出一种针对人iPS细胞来源肝细胞的高纯度分离技术。该方法采用无需基因修饰的FACS（荧光激活细胞分选）技术，结合线粒体含量高和细胞表面标志物ALCAM（活化白细胞细胞黏附分子）进行分选。使用该方法纯化的肝细胞中，97% ± 0.38%（n = 5）表现出白蛋白蛋白表达。本文旨在详细介绍该技术的操作流程，并将其应用于当前最新的人iPS细胞向肝细胞二维分化的方案中。
引言
胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（分别为 ES 和 iPS）被认为是再生治疗中具有前景的细胞来源。然而，即使使用相同的细胞系、实验方案和操作人员，这些细胞向特定目标细胞类型分化的效率也可能存在差异1,2,3,4。这种差异可能归因于人源 ES/iPS 细胞对环境的高度敏感性。因此，目前难以稳定地获得高纯度的目标细胞。为了实现高度安全的再生医学，必须清除治疗用细胞中的增殖细胞和未分化干细胞，因此开发先进的目标细胞纯化技术至关重要5,6,7。
细胞分选仪是一种能够瞬时分析单个细胞并根据荧光信号强度对目标活细胞进行分选的装置，提供了一种颇具前景的解决方案。该技术可通过针对细胞类型特异性表面标志物的抗体染色，或利用细胞类型特异性的报告基因表达来实现。已有若干研究报告了利用该技术纯化多能干细胞来源的心肌细胞8,9,10 和肝细胞11,12 的方法。Hattori 等人开发了一种利用细胞分选仪进行线粒体纯化的创新方法13。该方法利用心肌细胞依赖线粒体活动产生高能量需求的特性，通过使用活线粒体指示性染料 TMRM（四甲基罗丹明甲酯）对细胞进行染色，可在包含多种细胞类型的人胚胎干细胞来源的拟胚体中，利用流式细胞分选（FACS）高效地标记并纯化心肌细胞。经纯化的心肌细胞通过畸胎瘤形成实验验证了其无致瘤性。此外，Yamashita 等人意外发现了一种从人胚胎干细胞来源的拟胚体中纯化肝细胞的方法，即通过分离具有高线粒体活性且表达 ALCAM 的细胞组分14。该方法的原理在于，肝细胞因在营养代谢和解毒过程中大量消耗 ATP，其线粒体数量也相对较多15，同时肝细胞表达 ALCAM——一种属于免疫球蛋白超家族的分子，在细胞黏附和迁移中发挥重要作用16。
以往用于纯化多能干细胞来源肝细胞的高纯度方法需要进行基因改造，而非基因改造的纯化方法则效率较低17。基于线粒体的非基因改造方法在实现高纯度方面具有优势。当需要肝前体细胞时，可选择基于CD133和CD13或Dlk1的方法18,19。尽管基因组编辑技术的精确性已显著提高，但不可预见的基因组改变（例如致癌风险）的潜在风险仍无法完全排除。基于线粒体活性且不涉及基因改造的方法可避免此类风险。
通过对新生大鼠心肌细胞中多种线粒体指标的检测发现，TMRM 在 24 小时内完全消失，而其他染料至少可保留 5 天13。此外，值得注意的是，在采用 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法评估时，TMRM 和 JC-1 对细胞活力无影响，而其他染料对细胞活力表现出不同程度的影响13。TMRM 具有更高的安全性。
迄今为止，已开发出多种二维（2D）分化方法，相较于三维（3D）类胚体形成，这些方法在诱导分化方面效率更高。其原因是分化诱导化合物或细胞因子可在二维平面上均匀地作用于细胞，而无需在三维空间中扩散。本研究对先前报道的方法20进行了改进，以诱导人iPS细胞向肝细胞分化。本文详细描述了人iPS细胞来源的肝细胞在最新二维条件下的分化与纯化操作步骤。
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方案
本研究使用了商业获取的人诱导多能干细胞（253G1品系）（参见材料表）。
1. 人类iPS细胞的维持
- 在涂有0.25 µg/cm2 iMatrix-511（参见材料表）的培养皿中，将人iPS细胞在无饲养层条件下于AK02培养基中培养。
2. 人iPS细胞在二维培养中的肝细胞分化
注意：请参考图1A中的肝细胞分化每日时间表。整个过程中使用6孔培养板，每孔加入2 mL指定的洗涤液或培养基。细胞培养条件维持在37 °C、100%湿度、5% CO2和20% O2。
- 用 1 mL 基底膜基质（以 PBS (-) 按 1/25 稀释）包被 6 孔板的每个孔，在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 使用添加了 10 µM ROCK 抑制剂（Y-27632）的 AK02N 培养基，将人 iPS 细胞以 20,000–30,000 个细胞/cm² 的密度传代至包被好的培养皿中（参见 材料表）。次日更换不含 Y-27632 的培养基，并继续培养 2 天。
- 用 RPMI-1640 培养基洗涤细胞一次。通过更换为添加了 3–6 µM CHIR-99021 和 100 ng/mL Activin A 的 RPMI-B27-Glu 培养基（RPMI-1640 + 2% B27 胰岛素 + 1% 二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）培养 24 小时，启动内胚层分化（参见 材料表）。
- 更换为添加了 50 ng/mL Activin A 的 RPMI-B27-Glu 培养基，继续培养 24 小时。
- 为诱导肝祖细胞分化，更换为添加了 1% 二甲基亚砜（DMSO）的 RPMI-B27-Glu 培养基，持续培养 5 天。
- 为促进肝细胞成熟，更换为肝细胞成熟培养基：Leibovitz's L-15 培养基，含有 10 µM 氢化可的松-21-半琥珀酸酯、8.3% 胰蛋白胨磷酸盐肉汤、100 nM 地塞米松（DEX）、50 µg/mL L-抗坏血酸钠、0.58% 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、8.3% 胎牛血清（FBS）、2 mM 二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，以及 100 nM N-己酰基-Try-Ile-(6)-氨基己酰胺（Dihexa）（参见 材料表）。
- 每 2 天更换一次培养基，持续 20 天。在启动分化后约 27 天进行细胞分选。
3. 人iPS细胞来源肝细胞纯化的细胞准备
- 用 2 mL PBS (-) 洗涤每孔肝向分化细胞。
- 每孔加入 1 mL 酶溶液，其中包含 0.1% 胶原酶、0.083% 胰蛋白酶、10 µM ROCK 抑制剂（Y-27632）、20 nM 环孢素 A 和 50 µg/mL 抗坏血酸钠，溶于 Ads 缓冲液（116 mM NaCl，12.5 mM NaH2PO4，20 mM HEPES，5.4 mM KCl，5.6 mM 葡萄糖和 0.8 mM MgSO₄；pH 7.35）（见 材料表)。在37 °C下水平旋转约2小时，使细胞从培养板上脱落。
- 在显微镜下确认细胞已脱壁并变圆后，轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，并收集至50 mL离心管中。
- 以 200 x g 离心细胞 g 在18 °C下离心5分钟以收集沉淀。使用抽吸装置移除上清液。
- 用含有100 nM TMRM（四甲基罗丹明甲酯）的5 mL肝细胞成熟培养基重悬细胞，对线粒体进行染色（参见 材料表37 °C 避光孵育 30 分钟，可用铝箔包裹以避光。
- 以 200 x g 离心细胞 g 在18 °C下离心5分钟以收集沉淀。弃去上清液。
- 用含有 2% FBS 的冷吸附缓冲液重悬细胞，体积为 1–5 mL。
- 使用0.4%台盼蓝溶液和细胞计数板对细胞数量进行计数。
- 以 200 x g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟以收集沉淀，弃去上清液。
- 稀释抗ALCAM抗体（一抗，参见 材料表) 按1:50的比例用吸附缓冲液稀释，并在每10个样本中加入100 µL稀释后的抗体6 细胞。将细胞在冰上染色50分钟。以未用一抗染色的细胞作为阴性对照。
- 用含2% FBS的冷Ads缓冲液洗涤细胞两次。
- 稀释Alexa Fluor 488标记的驴抗山羊IgG（二抗，参见 材料表) 按1:100的比例用吸附缓冲液稀释，并在每10个中加入100 µL稀释后的抗体6 细胞。将细胞在冰上染色30分钟。使用二抗对未用一抗染色的细胞进行染色。
- 用含2% FBS的冷Ads缓冲液洗涤细胞两次。
- 用 Ads 缓冲液重悬细胞，并在 FACS 分选前通过带 snap cap 的细胞滤网（35 µm 孔径）过滤，以去除较大的细胞团块和碎片。
4. 人iPS细胞来源肝细胞的FACS分析与分选
- 根据制造商的说明设置用于细胞分选的流式细胞分选仪（参见材料表）。
注意：肝细胞分选时使用85 µm或100 µm的喷嘴尺寸，并使用2.0的ND滤光片。ALCAM的Alexa Fluor 488信号检测使用FITC通道，线粒体的TMRM荧光检测使用PE通道。 - 调节FSC（前向散射）和SSC（侧向散射）电压，以清晰显示细胞群。
- 调节FITC和PE荧光通道的电压。首先使用未标记的细胞，将细胞群中心调整至每个通道图的底部，确保标记后的细胞在图中处于适当位置。
- 采用通用的设门策略排除双联体：首先对主要的FSC-A vs. SSC-A细胞群设门（图2A），然后进行FSC-H vs. -W设门，再进行SSC-H vs. -W设门（图2B、C）。
- 对TMRMhi和ALCAM+细胞群（图2E中的P2）设门以分选肝细胞；对TMRMhi和ALCAM-细胞群（图2E中的P1）设门以分选非肝细胞。将分选后的肝细胞和非肝细胞分别收集至含有肝细胞成熟培养基的15 mL收集管中。
- 在18 °C条件下，以200 × g离心含有分选细胞的收集管5分钟。
- 弃去上清液，并将细胞重悬于肝细胞成熟培养基中。
- 将细胞接种于丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或类凝胶基底膜基质上，培养基为添加了10 µM Y-27632和20 nM环孢素A的肝细胞成熟培养基。将细胞置于37 °C的CO2培养箱中培养5天。
5. 人iPS细胞来源肝细胞的免疫细胞化学检测
- 将分选后培养5天的细胞用PBS (-) 洗涤。
- 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞5分钟。
- 用TBS-T缓冲液（1x TBS含1% Tween 20）洗涤细胞两次，以去除多聚甲醛。
- 将细胞与含0.1% Triton X-100的TBS-T缓冲液在室温下孵育5分钟。
- 用TBS-T缓冲液洗涤细胞两次，以去除Triton X-100。
- 加入市售封闭液（见材料表），在室温下处理细胞30分钟。
- 加入针对白蛋白（肝细胞标志物）和人核抗原（hNA，见材料表）的一抗，用封闭液按1:50稀释后加入。
- 将细胞在4 °C下孵育过夜，然后用TBS-T缓冲液洗涤两次。
- 加入二抗：Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG和Alexa Fluor 546标记的驴抗小鼠IgG，用封闭液按1:100稀释（见材料表）。
- 将细胞在室温下孵育30分钟，然后用TBS-T缓冲液洗涤两次。
- 在荧光显微镜下计数白蛋白阳性及hNA阳性细胞，评估肝细胞纯度。分别计算P1和P2细胞群中每个hNA阳性细胞对应的白蛋白阳性细胞百分比。
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结果
通过二维培养诱导人iPS细胞分化为肝细胞的过程时间线（图1A）及代表性细胞特征（图1B）如图所示。大约在分化第12天，细胞开始呈现多边形细胞形态和圆形细胞核，这是肝细胞的典型特征。部分肝细胞还表现出多核现象。
使用分化第27天的细胞进行FACS分析。为鉴定ALCAM+细胞群，图2D、E分别展示了使用与不使用第一抗ALCAM抗体的对照图。通过2D培养诱导肝分化，本实验中肝细胞（P2）群体比例为10.1%，相较于采用3D拟胚体形成方法获得的0.8%（数据未显示）有显著提高。
经分选的 P1 和 P2 细胞培养于经丝裂霉素 C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞上。P2 细胞呈现致密的球形集落形成，而 P1 细胞则呈分散状态且形态较扁平。对人核抗原（hNA）和白蛋白进行的免疫组织化学染色证实了 P2 中肝细胞样细胞的富...
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讨论
由于肝细胞在营养代谢和解毒过程中具有重要功能，与其他细胞类型相比，其含有相对较多的线粒体15。ALCAM 属于免疫球蛋白超家族，参与细胞黏附和迁移过程。它在多种细胞类型中均有表达，包括肝细胞、上皮细胞、淋巴细胞、髓样细胞、成纤维细胞和神经元细胞16。通过结合基于线粒体的方法与 ALCAM 抗体，成功鉴定了由人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化而来的肝细胞。
尽管未对纯化的肝细胞进行分泌功能或酶活性的检测，但已验证了人iPS细胞来源的肝细胞中CYP3A4基因的mRNA表达。此外，从人胚胎干细胞来源的拟胚体中分离出的TMRM（高）和ALCAM（+）肝细胞群体，其肝细胞相关基因集（VTN、SERPINA1、CYP1A1、FGB、FGA、FGG、AFP、ALB 和 APOB）的表达水平高于胚胎干细胞来源的心肌细胞
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由日本文部科学省资助，资助编号为[23390072]。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 253G1 人诱导多能干细胞系 | RIKEN 生物资源研究中心 | HPS0002 | |
| 4% 多聚甲醛 | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 163-20145 | |
| 人源重组 Activin A 溶液 | NACALAI TESQUE 公司 | 18585 | |
| 抗核抗体，克隆号 235-1 | Chemicon | MAB1281 | 抗人核抗原抗体 |
| B-27 添加剂（50 倍浓度），无血清 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| BD FACSAria III | BD 生物科学 | 细胞分选仪 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| 环孢素 A | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 035-18961 | |
| 胶原酶 | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 034-22363 | |
| Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质 | Corning | 354230 | 凝胶状基底膜基质 |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 036-24023 | ROCK 抑制剂 |
| 地塞米松 | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 047-18863 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 047-29353 | |
| 驴抗山羊 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | 赛默飞世尔科技 | A-11055 | |
| 驴抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记 | 赛默飞世尔科技 | A10036 | |
| 驴抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | 赛默飞世尔科技 | A-21206 | |
| Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap | Corning | 352235 | |
| 胎牛血清 | Biowest | 51820-500 | |
| GlutaMAX 添加剂 | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | 二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 |
| 人/小鼠/大鼠/犬 ALCAM/CD166 抗体 | R&D Systems | AF1172 | |
| 氢化可的松 21-半琥珀酸钠盐 | Sigma-Aldrich | H2270 | |
| iMatrix-511 丝素蛋白 | Nippi | 892021 | |
| ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | 封闭液 |
| ITS-G 添加剂（×100） | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 090-06741 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 128-06075 | |
| N-己酰基-色氨酰-异亮氨酸-(6)-氨基己酰胺（Dihexa） | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
| 多克隆兔抗人白蛋白抗体 | Dako | A0001 | |
| 聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20） | NACALAI TESQUE 公司 | 28353-85 | |
| RPMI-1640 | FUJIFILM Wako 纯化学公司 | 189-02025 | |
| L-抗坏血酸钠 | NACALAI TESQUE 公司 | 03422-32 | |
| StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
| TBS（10 倍浓度） | NACALAI TESQUE 公司 | 12748-31 | |
| 四甲基罗丹明甲酯（TMRM） | 赛默飞世尔科技 | T668 | |
| Triton X-100 | NACALAI TESQUE 公司 | 28229-25 | |
| 台盼蓝溶液 | NACALAI TESQUE 公司 | 20577-34 | |
| TRYPSIN 250 | Difco | 215240 | |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤溶液 | Sigma-Aldrich | T8159 |
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