活线粒体染色在细胞分选中纯化人诱导多能干细胞肝细胞的应用

摘要

来源于多能干细胞的肝细胞可以通过细胞分选进行纯化，使用线粒体和活化的白细胞粘附分子（ALCAM，也称为CD166）染色的组合。

摘要

人胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）由于其无限增殖和多能特性，在基于细胞的再生医学中具有治疗严重疾病器官的潜在应用。然而，由于人 ES/iPS 细胞对环境的高度敏感性，将人 ES/iPS 细胞分化为 100% 纯的靶细胞类型具有挑战性。移植后的肿瘤发生是由被污染的、增殖的和未分化的细胞引起的，因此高纯化技术对于安全实现再生医学至关重要。为了降低肿瘤发生的风险，已经开发了一种针对人 iPS 细胞来源的肝细胞的高纯度技术。该方法采用FACS（荧光激活细胞分选），使用高线粒体含量和细胞表面标记物ALCAM（活化的白细胞粘附分子）的组合，无需基因修饰。使用该方法的纯化肝细胞中±97%0.38%（n = 5）表现出白蛋白表达。本文旨在提供该方法的详细程序，应用于最新的人iPS细胞到肝细胞的二维分化方法。

引言

胚胎干细胞和诱导多能干细胞（分别为 ES 和 iPS）被认为是再生疗法的有前途的细胞来源。然而，即使使用相同的细胞系、方案和实验者 1,2,3,4，^将这些细胞分化为特定靶细胞类型的效率也可能有所不同。这种变异性可能归因于人类 ES/iPS 细胞对其环境的高敏感性。因此，目前很难一致地获得纯的靶细胞。为了实现高度安全的再生医学，消除治疗细胞中的增殖细胞和未分化干细胞至关重要，而针对靶细胞的先进纯化技术是必不可少的^5,6,7。

细胞分选仪是一种设备，可以立即分析单个细胞，并根据荧光信号强度对感兴趣的活细胞进行分选，提供了一种有前途的解决方案。这可以通过对细胞类型特异性表面标记物进行抗体染色或利用细胞类型特异性报告基因表达来实现。使用这种技术，有几篇关于纯化多能干细胞来源的心肌细胞 ^8,9,10 和肝细胞^11,12 的方法的报道。Hattori 等人使用细胞分选仪开发了一种创新的线粒体纯化方法¹³。利用心肌细胞通过线粒体活性对能量有高需求这一事实，用活线粒体指示染料 TMRM（四甲基罗丹明甲酯）染色细胞可用于通过 FACS 标记和高度纯化来自含有各种细胞类型的人 ES 细胞衍生的胚状体的心肌细胞。通过对纯化的心肌细胞进行畸胎瘤形成测定，证实了没有致瘤性。此外，Yamashita 等人出乎意料地发现了一种通过分离具有高线粒体活性和 ALCAM 阳性表达的组分从人 ES 细胞衍生的胚状体中纯化肝细胞的方法¹⁴。这种方法的基本原理是，肝细胞也具有相对较多的线粒体，因为它们大量消耗 ATP 进行营养代谢和解毒¹⁵，并且肝细胞表达 ALCAM，它是免疫球蛋白超家族的成员，在细胞粘附和迁移中发挥作用¹⁶。

以往对多能干细胞来源的肝细胞的高纯化方法需要基因修饰，非基因纯化方法效率低¹⁷。线粒体非遗传方法在实现高纯度方面具有优点。当需要肝祖细胞时，可以选择基于CD133和CD13或Dlk1的方法^18,19。尽管基因组编辑技术的准确性已经提高，但无法完全消除不可预见的基因组变化（例如致癌）的潜在风险。基于线粒体活性的方法，不涉及基因改造，可以避免这种风险。

通过检查新生大鼠心肌细胞中的各种线粒体指标，观察到 TMRM 在 24 小时内完全消失，而其他染料保留至少 5 天¹³。此外，需要注意的是，使用 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物 （MTT） 测定法评估时，TMRM 和 JC-1 不影响细胞活力，而其他染料对细胞活力的影响各不相同¹³。TMRM表现出更高的安全性。

迄今为止，与三维 （3D） 胚状体形成相比，已经开发了几种二维 （2D） 分化方法，作为更有效的诱导分化方法。这是因为逐步分化诱导化合物或细胞因子可以在 2D 平面上均匀地给药到细胞中，而不是在 3D 空间中。在这项研究中，对先前报道的方法²⁰ 进行了修改，以诱导分化为人 iPS 细胞来源的肝细胞。本文详细介绍了对源自人 iPS 细胞的肝细胞进行最新 2D 分化和纯化的程序。

方案

本研究使用商业获得的人 iPS 细胞（253G1 菌株）（参见 材料表）。

1. 人iPS细胞的维持

1. 在涂有 0.25 μg/^{cm 2} iMatrix-511 的培养皿上，在 AK02 培养基中将人 iPS 细胞保持在无饲养层条件下（参见 材料表）。

2. 人 iPS 细胞在 2D 培养物中的肝分化

注:请参阅 图1A 了解肝分化的每日时间表。在整个过程中，使用 6 孔培养板并向每个孔中加入 2 mL 指定的洗涤或培养基。在37°C下保持100%湿度，5%CO₂和20%O₂ 的细胞培养条件。

1. 用1mL基底膜基质（在PBS（-）中稀释1/25））包被6孔板的每个孔，并在37°C下孵育1小时。
2. 使用补充有 10 μM ROCK 抑制剂 （Y-27632） 的 AK02N 培养基以 20,000-30,000 个细胞/cm² 的密度将人 iPS 细胞传代到包被培养皿上（参见 材料表）。第二天更换不含 Y-27632 的培养基，并再培养 2 天。
3. 用 RPMI-1640 培养基洗涤细胞一次。通过用补充有3-6μM CHIR-99021和100ng / mL激活素A的RPMI-B27-Glu（RPMI-1640 + 2%B27胰岛素+ 1%二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）替换培养基24小时（参见 材料表）来启动内胚层分化。
4. 用补充有 50 ng/mL 激活素 A 的 RPMI-B27-Glu 替换培养基 24 小时。
5. 为了诱导肝祖细胞分化，用补充有 1% 二甲基亚砜 （DMSO） 的 RPMI-B27-Glu 替换培养基 5 天。
6. 为了促进肝细胞成熟，改用肝细胞成熟培养基:Leibovitz 的 L-15 培养基含有 10 μM 氢化可的松 21-琥珀酸酯、8.3% 磷酸胰蛋白酶肉汤、100 nM 地塞米松 （DEX）、50 μg/mL 钠-L-抗坏血酸、0.58% 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 （ITS）、8.3% 胎牛血清 （FBS）、2 mM 二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和 100 nM N-己酸-Try-Ile-（6）-氨基己酸酰胺 （Dihexa）（参见 材料目录）。
7. 每 2 天更换一次培养基，持续 20 天。在开始分化后约 27 天对细胞进行分选。

3. 用于纯化人 iPS 细胞来源肝细胞的细胞制备

1. 每孔用 2 mL PBS （-） 洗涤肝分化细胞。
2. 每孔加入 1 mL 酶溶液，其中包括 0.1% 胶原酶、0.083% 胰蛋白酶、10 μM ROCK 抑制剂 （Y-27632）、20 nM 环孢素 A 和 50 μg/mL 钠-L-抗坏血酸在 Ads 缓冲液（116 mM NaCl、12.5 mM NaH₂PO₄、20 mM HEPES、5.4 mM KCl、5.6 mM 葡萄糖和 0.8 mM MgSO 4;pH 7.35）（参见 材料表）。通过在37°C下水平旋转约2小时将细胞从板上分离。
3. 在显微镜下确认细胞分离并变圆后，通过轻轻移液将它们分散到单个细胞中，并将它们收集在 50 mL 试管中。
4. 将细胞在18°C下以200× g 离心5分钟以沉淀它们。使用吸液器取出上清液。
5. 通过将细胞的线粒体分散在含有100nM TMRM（四甲基罗丹明，甲酯）的5mL肝细胞成熟培养基中来染色细胞的线粒体（参见 材料表）。在37°C下孵育30分钟，同时通过包裹铝箔避光。
6. 将细胞在18°C下以200× g 离心5分钟以沉淀它们。取出上清液。
7. 用含有 2% FBS 的 1-5 mL 冷 Ads 缓冲液重悬细胞。
8. 使用0.4%台盼蓝溶液和细胞计数板计数细胞数。
9. 将细胞在4°C下以200× g 离心5分钟以沉淀它们。取出上清液。
10. 在 Ads 缓冲液中以 1:50 的比例稀释抗 ALCAM 抗体（一抗，参见 材料表），每 10^个 细胞加入 100 μL 稀释的抗体。将细胞在冰上染色50分钟。制备未用一抗染色的细胞作为阴性对照。
11. 用含有2%FBS的冷Ads缓冲液洗涤细胞两次。
12. 在 Ads 缓冲液中以 1:100 的比例稀释 Alexa Fluor 488 驴抗山羊 IgG（二抗，参见 材料表），每 10^{个 6} 个细胞加入 100 μL 稀释的抗体。将细胞在冰上染色30分钟。使用二抗对未用一抗染色的细胞进行染色。
13. 用含有2%FBS的冷Ads缓冲液洗涤细胞两次。
14. 将细胞重悬于Ads缓冲液中，并通过卡扣帽细胞过滤器（35μm网眼）过滤它们，然后通过FACS分选以去除大细胞团块和碎片。

4. 人iPS细胞来源肝细胞的FACS分析和分选

1. 按照制造商的说明设置 FACS 机器进行细胞分选（参见 材料表）。
   注意:使用 85 μm 或 100 μm 喷嘴尺寸和 2.0 的 ND 滤光片治疗肝细胞。使用 FITC 通道检测 ALCAM 的 Alexa Flour 488 和 PE 通道检测线粒体的 TMRM 荧光。
2. 调整FSC（前向散射）和SSC（侧向散射）电压，以正确观察细胞群。
3. 调整 FITC 和 PE 荧光通道的电压。从未标记的细胞开始，将细胞群居中位于每个通道图的底部。确保标记的细胞在图中正确放置。
4. 使用通用门控策略来消除双峰:对主要 FSC-A 进行门控。SSC-A群体（图2A），其次是FSC-H与。-W，然后是 SSC-H 与。-W（图2B，C）。
5. 门控 TMRM^hi 和 ^ALCAM + 群体（ 图 2E 中的 P2）以分选肝细胞。门控TMRM^hi 和^ALCAM- 群体（ 图2E中的P1）以分选非肝细胞。将分选的肝细胞和非肝细胞收集在含有肝细胞成熟培养基的 15 mL 收集管中。
6. 将含有分选细胞的收集管在18°C下以200× g 离心5分钟。
7. 取出上清液并将细胞重悬于肝细胞成熟培养基中。
8. 将细胞接种在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或凝胶样基底膜基质上，用补充有10μM Y-27632和20nM环孢素A的肝细胞成熟培养基接种细胞，在37°C CO₂ 培养箱中培养细胞5天。

5. 免疫细胞化学检测人 iPS 细胞来源的肝细胞

1. 用 PBS （-） 分选后洗涤培养的细胞 5 天。
2. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 5 分钟。
3. 用TBS-T缓冲液（1x TBS与1%吐温20）洗涤细胞两次以去除多聚甲醛。
4. 在室温下用 0.1% Triton X-100 稀释的 TBS-T 缓冲液孵育细胞 5 分钟。
5. 用TBS-T缓冲液洗涤细胞两次以去除Triton X-100。
6. 在室温下向细胞中加入市售的封闭溶液（参见 材料表）30分钟。
7. 加入针对白蛋白（肝细胞标志物）和人核抗原（hNA，见 材料表）的一抗，在封闭溶液中按 1:50 稀释。
8. 将细胞在4°C孵育过夜。用 TBS-T 缓冲液洗涤细胞两次。
9. 添加二抗:Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG 和 Alexa Fluor 546 驴抗小鼠 IgG，在封闭溶液中以 1:100 稀释（参见 材料表）。
10. 将细胞在室温下孵育 30 分钟。用 TBS-T 缓冲液洗涤细胞两次。
11. 通过在荧光显微镜下计数白蛋白阳性细胞和hNA阳性细胞来评估肝细胞纯度。计算 P1 和 P2 群体中每个 hNA 阳性细胞的白蛋白阳性细胞百分比。

结果

图中显示了通过2D培养诱导人iPS细胞分化为肝细胞的过程时间表（图1A）和代表性细胞特征（图1B）。大约在分化第 12 天，细胞开始表现出多边形细胞形状和圆形细胞核，这是肝细胞的特征。一些肝细胞也表现出多核。

在分化第 27 天使用细胞进行 FACS 分析。为了鉴定ALCAM⁺群体，有和没有第一种抗ALCAM抗体的比较图分别显示在图2D，E中。通过2D培养诱导肝脏分化，该实验发现肝细胞（P2）的数量为10.1%，比使用3D胚状体形成方法发现的0.8%（数据未显示）显着增加。

在用丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞上培养已分选的P1和P2细胞，P2细胞表现出紧凑的球形集落形成，而P1细胞分散且形态更扁平。人核抗原 （hNA） 和白蛋白的免疫组织化学染色证实了 P2 中肝细胞样细胞的富集，如图

讨论

由于肝细胞在营养代谢和解毒方面的功能，与其他细胞类型相比，肝细胞拥有相对较多的线粒体¹⁵。ALCAM是免疫球蛋白超家族的成员，在细胞粘附和迁移中发挥作用。它在多种细胞类型中表达，包括肝细胞、上皮细胞、淋巴细胞、髓样细胞、成纤维细胞和神经元细胞¹⁶。通过结合使用基于线粒体的方法和ALCAM抗体，成功鉴定了人iPS细胞来源的肝细胞。

虽然没有进行表征纯化肝细胞分泌功能或酶活性的测定，但验证了纯化的人 iPS 细胞来源的肝细胞中 CYP3A4 基因的 mRNA 表达。此外，从人 ES 细胞衍生的胚状体中分离出具有 TMRM（高）和 ALCAM （+） 的肝细胞群，观察到肝细胞相关基因集（VTN、SERPINA1、CYP1A1、FGB、FGA、FGG、AFP、ALB 和 APOB）的表达高于 ES 细胞衍生的心肌细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
253G1 人 iPS 细胞系	RIKEN 生物资源研究中心	HPS0002
4% 多聚甲醛	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
激活素 A 溶液，人，重组	NACALAI TESQUE， INC.	18585
抗核抗体，克隆 235-1	Chemicon	MAB1281	抗人核抗原
B-27 添加剂 （50x），无血清	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		细胞分选仪
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
环孢素 A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
胶原酶	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
康宁基质胶生长因子降低 （GFR） 基底膜基质	康宁	354230	凝胶状基底膜基质
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK 抑制剂
地塞米松	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
二甲基亚砜 （DMSO）	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
驴抗山羊 IgG （H+L） 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
驴抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
驴抗兔 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡口盖	Corning	352235
胎牛血清	Biowest	51820-500
GlutaMAX 补充剂	Thermo Fisher Scientific	35050061	二肽 L-丙酰-L-谷氨酰胺
/小鼠/大鼠/犬 ALCAM/CD166 抗体	R&D Systems	AF1172
氢化可的松 21-半琥珀酸钠盐	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 蚕丝	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	封闭液
ITS-G 补充剂（×100）	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 培养基	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-己酸-Try-Ile-（6）-氨基己酰胺（二hexa）	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit 抗人白蛋白	Dako	A0001
聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸琴 （Tween 20）	NACALAI TESQUE， INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
L-抗坏血酸钠	NACALAI TESQUE， INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS （10x）	NACALAI TESQUE， INC.	12748-31
四甲基罗丹明，甲酯 （TMRM）	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE， INC.	28229-25
台盼蓝溶液	NACALAI TESQUE， INC.	20577-34
胰蛋白酶 250	Difco	215240
胰蛋白胨磷酸盐肉汤溶液	Sigma-Aldrich	T8159