本文介绍了一种生物信息学分析流程的安装与使用方案，用于分析嵌合RNA测序数据，该数据应用于相关研究中 体内 RNA:RNA 相互作用
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本文内容
摘要
摘要
对……的理解 体内 小非编码RNA（sncRNA），例如microRNA（miRNA），与其靶标RNA之间的基因调控相互作用近年来通过生化方法取得了进展，这些方法利用交联后连接技术捕获sncRNA与靶标RNA的相互作用，形成嵌合RNA，并构建测序文库进行后续分析。尽管嵌合RNA测序产生的数据集能够提供全基因组范围的信息，且相比miRNA预测软件结果具有更低的不确定性，但将此类数据转化为有意义且可操作的信息仍需进一步分析，这可能使缺乏计算生物学背景的研究人员望而却步。本报告提供一份教程，旨在帮助初级计算生物学家安装并应用一种新近开发的开源软件工具：小嵌合RNA分析流程（Small Chimeric RNA Analysis Pipeline, SCRAP）。文中详细说明了平台需求、软件更新内容，以及流程各步骤的解释和关键用户输入参数的调整方法。降低生物学家在解析嵌合RNA测序数据方面的技术门槛，有望推动在多种生物学背景下对调控性sncRNA:靶标RNA相互作用的发现性研究。 小非编码RNA，microRNA，嵌合RNA，交联连接，测序文库，计算生物学，SCRAP，基因调控，靶标RNA，生物信息学分析
引言
小分子非编码RNA因其在多种生物学过程（如分化与发育、信号转导及疾病）中协调基因表达的转录后调控作用而受到广泛关注1,2,3准确确定基因调控性小非编码RNA（sncRNA），包括微小RNA（miRNA）的靶转录本，对于在基础和转化层面开展RNA生物学研究具有重要意义。目前常采用生物信息学算法，通过分析miRNA种子序列与其潜在靶标之间的预期互补性，来预测miRNA与靶RNA之间的相互作用。尽管这些生物信息学算法已取得一定成功，但如其他文献所综述，仍可能存在假阳性与假阴性结果。4,5,6近年来，已设计并实施了多种生化方法，可实现明确且半定量的测定 体内 sncRNA：靶标RNA相互作用通过 体内 交联及随后引入连接步骤，以将小非编码RNA（sncRNA）与其靶标物理连接，形成单一的嵌合RNA4,5,7,
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方案
注意：本实验方案将从下载和安装使用 SCRAP 分析嵌合 RNA 测序文库所需的软件开始。
1. 安装
- 在安装 SCRAP 之前，需在用于分析的机器上安装依赖程序 Git 和 Miniconda。Git 很可能已预先安装。例如，在 Mac OSX 平台上，可使用以下命令验证 哪个 git 以观察到该 "git" 实用程序已存在并安装在此目录中。使用以下方法检查 Miniconda 是否已安装 哪个 conda如果未返回任何内容，则安装 Miniconda。Miniconda 安装需要 400 MB 的磁盘空间。
- 安装 Miniconda 有多种方法，具体取决于平台。请参考 平台设置 位于 Meffert 实验室 GitHub 仓库的 markdown 文件 [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] 中提供了有关在 Windows、MacOS 和 Ubuntu 系统上安装的进一步说明。对于 Linux 用户，Linux 拥有其默认的包管理器（apt）。在本研究特定情况下，请使用以下命令 brew install Miniconda 使用现有的包管理....
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结果
使用经修改的SCRAP方法（SCRAP 2.0版本，包含rRNA过滤的改进）对先前发表的采用CLEAR-CLIP9构建的测序数据集进行sncRNA：靶标RNA相互作用分析的结果如图2和表1所示。用户可观察到，在SCRAP中通过峰识别（peak calling）筛选出高置信度相互作用后，miRNA与内含子区域相互作用的相对比例有所降低。有关使用SCRAP分析的其他数据也可在该分析流程的初始发表文献中获取6。根据实验策略的不同，可能需要对构建的嵌合RNA文库测序数据进行过滤，以减少结果中的假象。测序文库生化制备不理想和/或测序数据过滤不充分，可能导致错误地纳入并非来源于Argonaute蛋白结合的sncRNA与靶标RNA连接事件的测序读段。这些假象读段可能包括引物二聚体或接头二聚体、rRNA以及pre-miRNA。表2列出了结果中可能出现的假象类型及相应的解决方案。
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讨论
本实验方案旨在介绍如何使用 SCRAP 分析流程分析小非编码 RNA（sncRNA）与靶 RNA 的相互作用，以帮助初涉计算分析的研究人员。完成本教程后，具备初级或更高水平计算经验的研究人员将能够掌握该流程的安装与使用步骤，并将其应用于分析来自嵌合 RNA 测序文库的数据。本方案成功实施的关键步骤包括正确安装参考数据及运行 SCRAP，这些步骤耗时较长，若在使用 Anaconda 安装依赖项或输入命令行参数时未加注意，容易出现错误。
本文重点介绍了使用 SCRAP 分析流程对嵌合体小非编码 RNA（sncRNA）与靶标 RNA 测序文库进行实际分析时的技巧与操作步骤。研究表明，SCRAP 在检测 sncRNA 与靶标 RNA 相互作用方面优于其他嵌合 RNA 分析平台6,13。这可能归因于 SCRAP 所特有的峰识别（peak calling）功能，该功能专门设计用于识别在嵌合 RNA 形成过程中因生化步骤而产生的特征（例如 3' 肩状峰）。针对其他不同生化方法（如.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Meffert实验室成员的有益讨论，特别是BH Powell和WT Mills IV，他们对描述本流程的安装与实施提供了宝贵的反馈意见。本研究工作得到了Braude基金会奖项、马里兰干细胞研究基金启动计划、Blaustein疼痛研究与教育基金奖，以及美国国立神经疾病与中风研究所（NINDS RO1NS103974）和美国国立精神卫生研究所（NIMH RO1MH129292）向M.K.M.提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基因组 | UCSC 基因组浏览器 | 无 | https://genome.ucsc.edu/ 或 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | 推荐使用 Ubuntu 20.04 或 22.04 LTS | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| 平台设置 | GitHub | 无 | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP 分析流程 | GitHub | 无 | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix 操作系统 | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix 操作系统 | zsh（推荐版本 5.9） | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 或 22.04 LTS |
参考文献
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury resp....
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重印与许可
