嵌合小非编码RNA的计算分析教程:靶标RNA测序文库

Summary

在这里，我们提出了一个协议，展示了生物信息学管道的安装和使用，以分析用于研究 体内 RNA:RNA相互作用的嵌合RNA测序数据。

Abstract

近年来，通过生化方法，通过使用交联和连接，通过形成嵌合 RNA 和随后的测序文库来捕获 sncRNA:靶标 RNA 相互作用，从而推进了对小非编码 RNA （sncRNA） 等小非编码 RNA （sncRNA） 与其靶 RNA 的 体内 基因调控相互作用的理解。虽然来自嵌合RNA测序的数据集提供了全基因组的输入，并且比miRNA预测软件的模糊性要少得多，但将这些数据提炼成有意义和可操作的信息需要额外的分析，并且可能会劝阻缺乏计算背景的研究人员。本报告提供了一个教程，以支持入门级计算生物学家安装和应用最新的开源软件工具:小嵌合 RNA 分析管道 （SCRAP）。提供了平台要求、更新以及管道步骤和关键用户输入变量操作的说明。减少生物学家从嵌合RNA测序方法中获得见解的障碍，有可能在多种生物学背景下对调节性sncRNA:靶RNA相互作用进行基于发现的研究。

Introduction

小的非编码 RNA 因其在不同过程中协调基因套件表达（如分化和发育、信号处理和疾病）中的转录后作用而受到高度研究 ^1,2,3。准确测定基因调控小非编码 RNA （sncRNA） 的靶转录本（包括 microRNA （miRNA）的能力对于基础和翻译水平的 RNA 生物学研究都很重要。利用miRNA种子序列与其潜在靶标之间预期互补性的生物信息学算法已经常用于预测miRNA:靶标RNA相互作用。虽然这些生物信息学算法已经成功，但它们也可能同时存在假阳性和假阴性结果，正如在其他地方所回顾的那样 ^4,5,6。最近，已经设计并实施了几种生化方法，这些方法允许通过体内交联和随后的连接步骤掺入将 sncRNA 物理连接到其靶标以形成单个嵌合 RNA 4,5,7,8,9,10 ^<....

Protocol

注:该协议将从下载和安装使用 SCRAP 分析嵌合 RNA 测序文库所需的软件开始。

1. 安装

1. 在安装 SCRAP 之前，请在要用于分析的计算机上安装依赖项 Git 和 Miniconda。Git 可能已安装。例如，在 Mac OSX 平台上，使用哪个 git 验证这一点，以查看" git "实用程序是否存在并安装在此目录中。检查 Miniconda 是否使用 哪个 conda 安装。如果未返回任何内容，请安装 Miniconda。Miniconda 需要 400 MB 的磁盘空间才能安装。
   1. 有几种方法可以安装 Miniconda，它们因平台而异。请参阅 Meffert Lab GitHub 存储库 [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] 上的 PLATFORM-SETUP markdown 文件，其中包含有关在 Windows、MacOS 和 Ubuntu 上安装的更多说明。对于 Linux 用户，Linux 有自己的默认包管理器 （apt）。在本研究的特定情况下，使用命令 brew install Miniconda 使用现有包管理器 brew 安装 Miniconda 。

Results

在使用 CLEAR-CLIP⁹ 制备的先前发表的测序数据集上，由 SCRAP 的修改版本（SCRAP 版本 2.0，实现了 rRNA 过滤的修改）检测到的 sncRNA:靶 RNA 的结果如 图 2 和 表 1 所示。用户可以欣赏到在SCRAP中通过峰检出分离高置信度相互作用后发生的与内含子区域的相对部分miRNA相互作用的减少。使用 SCRAP 进行分析的其他数据也可在本管道⁶ 的初始出版物中找到。根据实验方法的不同，可能需要从制备的嵌合RNA文库中过滤测序数据，以减少结果中的伪影。测序文库的次优生化制备和/或测序数据的次优过滤可能导致不正确包含不是由 Argonaute 结合的 sncRNA 和靶 RNA 连接产生的读长。这些伪影读段可以包括引物二聚体或接头二聚体、rRNA 和前 miRNA。 表 2 描述了可能在结果中检测到的可能伪影和潜在的解决方案。

Discussion

本关于使用 SCRAP 管道分析 sncRNA:靶标 RNA 相互作用的协议旨在帮助正在进入计算分析的研究人员。本教程的完成预计将指导具有入门级或更高计算经验的研究人员完成安装和使用该管道及其应用以分析从嵌合 RNA 测序文库获得的数据所需的步骤。完成此协议的关键步骤包括正确的参考安装和运行 SCRAP，这可能非常耗时，并且可能是错误的根源，尤其是在使用 Anaconda 安装依赖项或键入命令行参数时未小心的情况下。

在这里，特别关注的是实际使用 SCRAP 管道分析嵌合 sncRNA:靶标 RNA 测序文库的技巧和步骤。研究发现，SCRAP 在检测 sncRNA:靶标 RNA 相互作用方面优于其他嵌合 RNA 分析平台 ^6,13。这可能是由于 SCRAP 的峰值调用特征，该特征是专门为检测由于嵌合 RNA 形成所涉及的生化步骤而观察到的特征（例如 3' 肩部）而开发的。已经开发了用于不同生化方法的其他峰检出方法，例如染色质免疫沉淀测序 （CHIP-seq） 应用的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
基因组	UCSC 基因组浏览器	不适用	https://genome.ucsc.edu/ 或 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/
Linux	Linux	Ubuntu 20.04 或 22.04 LTS 推荐
Mac	Apple	Mac OSX （>11）
平台设置	GitHub	不适用	https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]
SCRAP pipeline	GitHub	不适用	https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP
Unix shell	Unix作系统	bash >=5.0
Unix shell	Unix作系统	zsh（推荐 5.9）
Windows		Windows WSL Ubuntu 20.04 或 22.04 LTS